Nghiên cứu phân lập gen cystatin ở một số giống lúa có khả năng chịu hạn khác nhau

.yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy yyyyyyyyyyyyyyyyyyyy ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN MINH PHƢƠNG yyyyyyyyyyyyyyyyy NGUYỄN VĂN TƢỜNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GEN CYSTATIN Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA CÓ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN KHÁC NHAU NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GEN NAC LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU HẠN Ở MỘT SỐ GIỐNG NGÔ ĐỊA PHƢƠNG HÀ GIANG - VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN MINH PHƢƠNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GEN CYSTATIN Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA CÓ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN KHÁC NHAU Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 04 02 01 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN VŨ THANH THANH THÁI NGUYÊN - 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh tận tình hƣớng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành đề tài Tôi xin cảm ơn kỹ thuật viên phịng thí nghiệm Sinh học, Khoa Khoa học Sự sống, Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Ngun tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành số thí nghiệm Tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp động viên khuyến khích giúp đỡ tơi suốt q trình học tập làm đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu đó! Thái Nguyên, ngày tháng 03 năm 2014 Tác giả luận văn Nguyễn Minh Phƣơng Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY LÚA 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh học lúa 1.1.3 Giá trị kinh tế lúa 1.1.4 Đặc điểm hóa sinh hạt gạo 1.1.5 Tình hình sản xuất lúa giới Việt Nam 1.2 HẠN VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY LÚA 1.2.1 Hạn ảnh hƣởng hạn tới trồng 1.2.2 Tình hình nghiên cứu đặc tính chịu hạn lúa1.2.3 Cơ sở sinh lý, hóa sinh di truyền tính chịu hạn lúa 11 1.2.4 Cystatin vai trò cystatin với tính chịu hạn 18 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 VẬT LIỆU 24 2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 25 2.2.1 Hóa chất 25 2.2.2 Thiết bị 26 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.3.1 Phƣơng pháp sinh lí, hóa sinh 26 2.3.2 Phƣơng pháp sinh học phân tử 33 2.3.3 Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide 39 2.3.4 Phƣơng pháp xử lí trình tự gen 39 2.3.5 Phƣơng pháp xử lý kết tính tốn số liệu 39 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii 2.4 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 39 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, HỐ SINH HẠT CỦA MẪU LÚA NGHIÊN CỨU 41 3.1.1 Đặc điểm hình thái khối lƣợng hạt 41 3.1.2 Hàm lƣợng protein lipid 42 3.1.3 Hoạt tính α – amylase 43 3.1.4 Hoạt tính protease 44 3.1.5 Chiều dài rễ giống lúa nghiên cứu giai đoạn non 44 3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA GIỐNG LÚA Ở GIAI ĐOẠN CÂY MẠ 46 3.3 KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN 48 3.3.1 Kết tách chiết DNA tổng số 48 3.3.2 Kết nhân gen Cystatin 49 3.3.3 Kết xác định trình tự gen Cystatin 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54 Kết luận 54 Đề nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic Acid (Axit abxisic) ASTT u Bp ) CTAB Cetyltrimethyl – amonium bromide CUC Cup Shaped Cotyledon CYS Cystatin DNA Axit deoxyribonucleic (Deoxyribonucleic acid) đtg Đồng tác giả JA Jasmonic acid HSP Heat shock pro ) LTP ) MX mồi xuôi MN mồi ngƣợc LEA ) NAM No Apical Merstem PCR ) P5CS Pyroline – – carboylate synthase TAE Tris Acetate EDTA Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Tình hình sản xuất lúa giới từ năm 2000 – 2012 Bảng 1.2 Tình hình sản xuất lúa Việt Nam từ năm 2000 – 2012 Bảng 2.1 Đặc điểm 09 giống lúa nghiên cứu 24 Bảng 2.2 Danh mục thiết bị sử dụng 26 Bảng 2.3 Cặp mồi nhân gen cystatin 35 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng nhân gen cystatin 35 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector 36 Bảng 3.1 Hình thái khối lƣợng hạt giống lúa 41 Bảng 3.2 Hàm lƣợng protein lipid giống lúa 42 Bảng 3.3 Hoạt tính enzyme α – amylase giống lúa 43 Bảng 3.4 Hoạt tính protease giống lúa 44 Bảng 3.5 Chiều dài rễ giống lúa 45 Bảng 3.6 Khả chịu hạn giai đoạn non giống lúa 46 Bảng 3.7 Phổ hấp phụ DNA bƣớc sóng 260 nm 280 nm giống lúa nghiên cứu 49 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Hình ảnh hạt giống lúa nghiên cứu……………………….25 Hình 2.2 Vector pBT 37 Hình 3.1 Đồ thị rada biểu diễn khả chịu hạn giống lúa nghiên cứu 47 Hình 3.2 Hình ảnh điện di DNA tổng số giống lúa nghiên cứu 48 Hình 3.3 Hình ảnh điện di kết PCR nhân gen Cystatin mẫu luá LH Sym6 50 Hình 3.4 Kết điện di tách plasmid tái tổ hợp mang gen cystatin 50 Hình 3.5 Trình tự nucleotide gen cystatin hai giống LH Sym6 521 Hình 3.6 So sánh trình tự amino acid suy diễn protein cystatin hai giống lúa nghiên cứu AF435976……………………………… ….….53 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Lúa gạo (Ozyza sativa L.) lƣơng thực chiếm 10% diện tích trồng trọt lƣơng thực ni sống nửa dân số giới Hiện nay, lúa đƣợc xếp vào vị trí thứ hai sau lúa mì diện tích sản lƣợng Lúa gạo nguồn cung cấp lƣợng lớn cho ngƣời Trên giới, lúa đƣợc khoảng 250 triệu nông dân trồng 100 nƣớc giới Ở Việt Nam, lúa lƣơng thực quan trọng đƣợc trồng nhiều vùng sinh thái khác nhau, đa dạng mùa vụ gieo trồng hệ thống canh tác Trong thập kỉ qua, loài ngƣời đứng trƣớc nguy bùng nổ dân số theo FAO để đảm bảo mức tiêu dùng ổn định, mức tăng sản lƣợng hàng năm cần gấp lần so với mức tăng dân số Trƣớc tình hình lúa đối tƣợng nghiên cứu nhiều nhà khoa học Trong năm gần đây, trình biến đổi khí hậu trái đất diễn phức tạp, khó lƣờng theo chiều hƣớng xấu mơi trƣờng nhƣ: Hạn hán, lũ lụt, xói mịn, thối hố đất,…Ở Việt Nam, năm qua, cịn có hạn chế điều kiện tƣới tiêu, tập quán canh tác đặc biệt việc chọn giống chịu hạn đƣa vào sản xuất chƣa đƣợc trọng, thêm vào diễn biến thời tiết phức tạp, hạn hán thƣờng xuyên xảy gây ảnh hƣởng không nhỏ đến suất chất lƣợng nhiều loại trồng có lúa Cây lúa loài tƣơng đối mẫn cảm với điều kiện bất lợi ngoại cảnh thuộc nhóm chịu hạn Vì vậy, việc tạo giống lúa có suất cao, khả chống chịu tốt yêu cầu thực tiễn đề cho nhà khoa học Trên giới nay, chọn tạo trồng theo hƣớng chống chịu vấn đề đƣợc đặt trọng tâm nghiên cứu, chọn tạo giống lúa theo hƣớng chống khô hạn nhận đƣợc quan tâm nhiều nhà khoa học Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Nghiên cứu gen liên quan đến tính chịu hạn cho thấy tính chống chịu khơ hạn tính trạng đa gen Các trình tự gen liên quan đến tính chịu hạn lúa đƣợc công bố ngân hàng gen Quốc tế, có gen cystatin Cystatin chất ức chế có chất protein, gen thƣờng đƣợc biểu điều kiện hạn, lạnh, mặn pha riêng rẽ trình sinh trƣởng, phát triển thực vật Mặc dù nghiên cứu gen liên quan đến tính chịu hạn ngày đƣợc quan tâm nhƣng thông tin gen chƣa nhiều Vấn đề đặt cần tìm hiểu đặc điểm sinh lý, hoá sinh sinh học phân tử liên quan đến tính chịu hạn lúa Trên sở định hƣớng cho cơng tác chọn giống cải tạo giống phù hợp có khả chịu hạn tốt Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn việc chọn tạo giống lúa theo hƣớng nâng cao khả chịu hạn, tiến hành đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu phân lập gen cystatin số giống lúa có khả chịu hạn khác nhau” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác định đƣợc mức độ chịu hạn số giống lúa giai đoạn non - Xác định đƣợc mối liên quan hoạt tính α – amylase, protease, chiều dài rễ với khả chịu hạn số giống lúa - Phân lập xác định đƣợc trình tự gen cystatin số giống lúa có khả chịu hạn khác NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Đánh giá khả chịu hạn phƣơng pháp gây hạn nhân tạo giai đoạn 3, 5, 7, ngày gây hạn - Xác định hoạt tính α – amylase, protease hạt 09 giống lúa nghiên cứu - Xác định chiều dài rễ ngày tuổi giai đoạn non - Khuyếch đại, tách dòng xác định trình tự gen cystatin giống lúa có khả chịu hạn tốt giống lúa chịu hạn Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 47 Bảng 3.6 cho thấy, sau 3, 5, ngày gây hạn, giống nghiên cứu chịu ảnh hƣởng hạn tỷ lệ thiệt hại hạn gây tăng theo thời gian gây hạn Sau ngày gây hạn, giống lúa bắt đầu bị ảnh hƣởng nhƣng mức độ thấp, sau ngày hạn, mức độ ảnh hƣởng tăng lên rõ rệt Dựa số không héo phục hồi chúng tơi tính số chịu hạn Chỉ số chịu hạn giảm dần theo thứ tự sau: LH>NL203>N97>U17>Q>KD>TB>ND>Sym6 Nhƣ vậy, mẫu LH có số chịu hạn cao nhất, mẫu có số chịu hạn thấp mẫu Sym6 %CKH3 100 80 60 %CPH7 %CPH3 40 20 %CKH7 %CKH5 %CPH5 ND LTB KD LH U17 N97 Sym Q NL203 Hình 3.1 Đồ thị rada biểu diễn khả chịu hạn giống lúa nghiên cứu Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 48 Chúng tơi nhận thấy có liên quan khả chịu hạn với hàm lƣợng protein, hàm lƣợng lipid, hoạt tính  - amylase, protease, chiều dài rễ Những giống có khả chịu hạn tốt hàm lƣợng protein, hàm lƣợng lipid, hoạt tính  - amylase, protease, chiều dài rễ cao Ngƣợc lại, giống chịu hạn hoạt độ  - amylase, protease, chiều dài rễ thấp so với giống chịu hạn tốt Từ kết trên, lựa chọn giống LH (chịu hạn tốt) giống Sym6 (chịu hạn kém) để tiếp tục nghiên cứu đặc điểm gen Cystatin 3.3 KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN 3.3.1 Kết tách chiết DNA tổng số Lấy non giống lúa sử dụng để tách chiết DNA tổng số Sau tách chiết tinh sạch, hàm lƣợng độ DNA đƣợc xác định phƣơng pháp đo quang phổ hấp thụ bƣớc sóng 260 nm 280 nm Đồng thời, DNA tổng số đƣợc điện di gel agarose 1% TAE 1X chụp ảnh máy soi gel để đánh giá chất lƣợng DNA Kết đƣợc thể hình 3.2 M Hình 3.2 Hình ảnh điện di DNA tổng số giống lúa nghiên cứu Trong đó: M: marker lamda; 1: LH; 2: Sym6 Tiến hành kiểm tra độ tinh hàm lƣợng DNA tổng số phƣơng pháp đo máy quang phổ Kết thu đƣợc thể bảng 3.7 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 49 Bảng 3.7 Phổ hấp phụ DNA bƣớc sóng 260 nm 280 nm giống lúa nghiên cứu Tên giống A260 A280 A260/280 LH 0,122 0,065 1,88 Hàm lƣợng DNA (ng/μl) 1220 Sym6 0,155 0,078 1,99 1550 Từ bảng 3.7 cho thấy: tỷ số A269/A280 dao động khoảng 1,8 2,0 chứng tỏ mẫu DNA tổng số tách chiết có độ tinh cao, sử dụng để tiến hành nghiên cứu 3.3.2 Kết nhân gen Cystatin Sau tiến hành kiểm tra đảm bảo độ tinh DNA tổng số thu đƣợc, tiến hành nhân gen cystatin giống lúa nghiên cứu, giống lúa có khả chịu hạn tốt, giống lúa có khả chịu hạn phƣơng pháp PCR Thành phần phản ứng PCR đƣợc thể bảng 2.4 Nhiệt độ gắn mồi đƣợc chúng tơi tính tốn dựa đặc điểm trình tự mồi thiết kế Tuy nhiên, trình thực tiến hành phản ứng PCR với điều kiện khác nhận thấy phản ứng PCR xảy tối ƣu điều kiện nhiệt độ gắn mồi 56oC Sau 30 chu kì phản ứng, kết nhân gen đƣợc kiểm tra gel agarose 1% với marker 1kb đƣợc thể hình 3.3 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 50 M 660bp Hình 3.3 Hình ảnh điện di kết PCR nhân gen cystatin giống luá LH Sym6 Ghi chú: M marker 1kb; 1: LH; 2: Sym6 Qua hình 3.3 cho thấy, khuếch đại đƣợc gen cystatin giống lúa nghiên cứu với với kích thƣớc khoảng 660 bp, kích thƣớc với kích thƣớc dự kiến thiết kế cặp mồi đặc hiệu 3.3.3 Kết xác định trình tự gen Cystatin Để xác định trình tự gen cystatin, chúng tơi tiến hành tách dịng gen Sản phẩm tách plasmid đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 0,8 % đệm TAE 1X, nhuộm gel ethidium bromid % chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím (hình 3.4) Hình 3.4 Kết điện di tách plasmid tái tổ hợp mang gen cystatin Ghi chú: 1: LH; 2: Sym6 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 51 Kết điện di cho thấy sản phẩm tách plasmid sạch, đảm bảo chất lƣợng số lƣợng phục vụ cho việc xác định trình tự nucleotide Sau xác định trình tự gen cystatin máy xác định trình tự tự động viện Công nghệ sinh học, thu đƣợc kết nhƣ sau: gen cystatin mẫu LH 664 nucleotide mẫu Sym6 dài 645 nucleotide Nhƣ vậy, gen cystatin mẫu Sym6 ngắn mẫu LH 19 nucleotide Tuy nhiên, 19 nucleotide thiếu hụt nằm vùng intron nên khơng ảnh hƣởng đến đoạn mã hóa amino acid (hình 3.6) LH Sym6 LH Sym6 LH Sym6 LH Sym6 LH Sym6 LH Sym6 LH Sym6 LH Sym6 LH Sym6 LH Sym6 LH | | | | | | | | | | 10 20 30 40 50 ATGTCGAGCG ACGGAGGGCC GGTGCTTGGC GGCGTCGAGC CGGTGGGGAA ATGTCGAGCG ACGGAGGGCC GGTGCTTGGC GGCGTCGAGC CGGTGGGGAA | | | | | | | | | | 60 70 80 90 100 CGAGAACGAC CTCCACCTCG TCGACCTCGC CCGCTTCGCC GTCACCGAGC CGAGAACGAC CTCCACCTCG TCGACCTCGC CCGCTTCGCC GTCACCGAGC | | | | | | | | | | 110 120 130 140 150 ACAACAAGAA GGCCGTAAGC GCCCCGCTCT ACCCTCCTCC CTACTTCTCC ACAACAAGAA GGCCGTAAGC GCCCCGCTCT ACCCTCCTCC CTACTTCTCC | | | | | | | | | | 160 170 180 190 200 TCTTCGCAAG GCCGGTCGTC CAACTAGATC TGTGTTCTAT GGACTAATTA TCTTCGCAAG GCCGGTCGTC CAACTAGATC TGTGTTCTAT GGACTAATTA | | | | | | | | | | 210 220 230 240 250 TGCAACGCAT GACACACGGC TCTATTTAAT TTTTAAATTG ATCCAATTCA TGCAACGCAT GACACACGGC TCTATTTAAT TTTTAAATTG AT - | | | | | | | | | | 260 270 280 290 300 ATTTCATTTG TTCTCGCCAA GGAAGTAATT TTGATTCCTA GTCATGTAAA -TCTCGCCAA GGAAGTAATT TTGATTCCTA GTCATGTAAA | | | | | | | | | | 310 320 330 340 350 CCTGCTCGAG TCGGTGAGAA AAAAAAAGAT GCGGTGTTGC GTATGTTTGT CCTGCTCGAG TCGGTGAGAA AAAAAAAGAT GCGGTGTTGC GTATGTTTGT | | | | | | | | | | 360 370 380 390 400 TAAAAGTGCA ATTAGGCAAT TTTTTGTGTT CAAAGATTGT GCTGTGTTCT TAAAAGTGCA ATTAGGCAAT TTTTTGTGTT CAAAGATTGT GCTGTGTTCT | | | | | | | | | | 410 420 430 440 450 CTTTTATGAC AATATGGAAC AGGAGGTTCT GGACTGATTA GCATTTAATC CTTTTATGAC AATATGGAAC AGGAGGTTCT GGACTGATTA GCATTTAATC | | | | | | | | | | 460 470 480 490 500 TTGATACTAC CATGCGCAGA ATTCTCTGCT GGAGTTCGAG AAGCTTGTGA TTGATACTAC CATGCGCAGA ATTCTCTGCT GGAGTTCGAG AAGCTTGTGA | | | | | | | | | | 510 520 530 540 550 GTGTGAAGCA GCAAGTTGTC GCTGGCACTT TGTACTATTT CACAATTGAG Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 52 Sym6 LH Sym6 LH Sym6 LH Sym6 GTGTGAAGCA GCAAGTTGTC GCTGGCACTT TGTACTATTT CACAATTGAG | | | | | | | | | | 560 570 580 590 600 GTGAAGGAAG GGGATGCCAA GAAGCTCTAT GAAGCTAAGG TCTGGGAGAA GTGAAGGAAG GGGATGCCAA GAAGCTCTAT GAAGCTAAGG TCTGGGAGAA | | | | | | | | | | 610 620 630 640 650 ACCATGGATG GACTTCAAGG AGCTCCAGGA GTTCAAGCCT GTCGATGCCA ACCATGGATG GACTTCAAGG AGCTCCAGGA GTTCAAGCCT GTCGATGCCA | | 660 GTGCAAATGC CTAA GTGCAAATGC CTAA Hình 3.5 Trình tự nucleotide gen cystatin hai mẫu LH Sym6 Vì trình tự gen cystatin mà phân lập từ DNA tổng số nên có intron cịn trình tự gen cystatin công bố Ngân hàng gen NCBI phân lập từ mRNA nên khơng có intron So sánh trình tự gen cystatin mà chúng tơi thu đƣợc với trình tự gen Ngân hàng gen NCBI cho thấy, trình tự gen mà chúng tơi phân lập có intron exon: exon dài 114 nucleotide (từ vị trí đến 114 hình 3.8), exon dài 195 nucleotide (từ vị trí 470 đến 664 hình 3.5), intron (từ vị trí 115 đến 469 hình 3.5) đó: intron mẫu Sym6 dài 336 nucleotide cịn mẫu LH dài 355 nucleotide Đoạn mã hóa dài 309 nucleotide mã hóa cho 102 amino acid (trừ amino acid kết thúc) So sánh trình tự đoạn mã hóa gen cystatin hai giống lúa nghiên cứu khơng thấy có khác biệt giống 100% với đoạn mã hóa trình tự cơng bố NCBI với mã số AF435976 Do đó, trình tự amnino acid suy diễn protein cystatin giống lúa nghiên cứu tƣơng đồng 100% với trình tự amino acid mẫu AF435976 (hình 3.6) Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 53 Hình 3.6 So sánh trình tự amino acid suy diễn protein cystatin hai giống lúa nghiên cứu AF435976 Nhƣ vậy, khác trình tự gen cystatin hai giống lúa nghiên cứu xảy vùng intron (từ vị trí 243 đến 261 hình 3.5) Giống LH nhiều giống Sym6 19 nucleotide Các nucleotide có ảnh hƣởng đến biểu gen hay không vấn đề cần đƣợc làm sáng tỏ Hiện có nhiều nhà khoa học giới nghiên cứu vai trò intron nhƣng ảnh hƣởng tới biểu gen chƣa đƣợc chứng minh Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 54 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Khối lƣợng 1000 hạt giống lúa nghiên cứu dao động khoảng (20,21) đến (30,80), Chiều dài rễ giai đoạn non dao động từ 4,98 – 7,12 cm 1.2 Các giống lúa nghiên cứu có hàm lƣợng protein hạt dao động từ: (6,68%) đến (8,66%) Hàm lƣợng lipid dao động khoảng (1,19%) đến (2,30%) Giống lúa LH có hoạt tính  - amylase mạnh (0,81 đvhđ/mg) giống lúa Sym6 có hoạt tính  - amylase yếu (0,59 đvhđ/mg) Giống lúa có hoạt tính protease cao mẫu LH (0,19 đvhđ/mg) giống lúa có hoạt tính protease thấp mẫu Sym6 (0,12 đvhđ/mg) 1.3 Khả chịu hạn giống lúa nghiên cứu có khác nhau, giống lúa LH mẫu có khả chịu hạn tốt nhất, giống lúa Sym6 mẫu có khả chịu hạn 1.4 Đã khuyếch đại, tách dòng xác định đƣợc gen cystatin giống lúa LH Sym6 Mẫu LH có chiều dài gen cystatin 664 nucleotide cịn giống Sym6 dài 645 nucleotide Trình tự đoạn mã hóa gen cystatin hai giống lúa nghiên cứu khơng thấy có khác biệt giống 100% với đoạn mã hóa trình tự cơng bố NCBI với mã số AF435976 nên protein cystatin chúng dài 102 amino acid Đề nghị Tiếp tục xác định thêm trình tự gen cystatin giống lúa khác để có sở so sánh, xác định thị phân tử phục vụ cho việc chuyển gen để tạo đƣợc giống lúa có khả chịu hạn tốt Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi lúa, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tƣờng (1998), Thực hành hoá sinh học, NXB Giáo Dục Ngô Mạnh Dũng (2008), Nghiên cứu đặc tính di truyền đặc tính chịu hạn số giống lúa (Ozyra sativa L.),Luận văn Thạc sỹ Sinh học, Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên, Tr 19-32 Đỗ Thị Dƣơng (2011), Nghiên cứu số đặc điểm hình thái, sinh lý hố sinh giống lúa cạn địa phương, Luận văn Thạc sỹ Sinh học, Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên, Tr 35-39 Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng (2002), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục Nguyễn Văn Hoan (2006), Cẩm nang lúa, NXB Lao động Hà Nội Trần Thị Phƣơng Liên (2010), Protein tính chống chịu thực vật, NXB Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, Hà Nội Lê Đình Lƣơng, Quyền Đình Thi (2004), Kĩ thuật di truyền ứng dụng, NXB Quốc gia Hà Nội Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Hà (2011), Gen đặc tính chịu hạn đậu tương, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội 10 Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin sinh học, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, tr: 53 – 163 11 Nguyễn Văn Mùi (2002), Xác định hoạt độ enzyme, NXB Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội 12 Nguyễn Thị Tâm (2003), Nghiên cứu khả chịu nóng chọn dịng chịu nóng lúa cơng nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sỹ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội, Tr 20-30 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 56 13 Bùi Thị Thu Thuỷ (2006), Nghiên cứu khả chịu hạn tạo dòng vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn lúa công nghệ tế bào thực vật, Luận văn Thạc sỹ Sinh học, Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên, Tr 45-55 14 Vũ Thị Thu Thủy (2011), Tạo dịng chịu hạn cơng nghệ tế bào phân lập gen Cystatin liên quan đến tính chịu hạn lạc, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên 15.Nguyễn Thị Thu Trang (2008), Đánh giá chất lượng hạt, khả chịu hạn phân lập gen Cystatin số giống đậu xanh, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái nguyên 16 Vũ Văn Vụ , Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (2007), Sinh lý học thực vật, NXB Giáo dục TÀI LIỆU TIẾNG ANH 17 Abe K., Emori Y., Kondo H.,Susuki K., Aria S (1987) “Molecular cloning of a cystein proteinase inhibitor of rice (Oryzacystatin) Homology with animal cystatin and transient expression in the ripening process of rice seeds”, J Biol Chem, 262(35), pp: 16793-16797 18 Abe M., Arai S (1991), "Some propeties of a cystein proteinase inhibitor from corn endosperm", Agricultural and biological chemistry, 55(9), pp: 2417-2418 19 Abrahanson M., Ritonja A., Brown M.A., Grabb A., Machleibt W., Barrett A.J (1987), "Identification of the probable inhibitory reactive sites of the cysteine proteinase inhibitors, Human cystatin c and chicken cystatin", J Biol, Chem, 262, pp: 9688-9494 20 Barrett A.J (1986), “The Cystatins: a diverse superfamily of cystein peptidase inhibitor”, Biomed Biochim Acta, 45, pp: 1363-1374 21 Barrett A.J., Fritz H., Grubb A., Isemura S., Jarvinen M., Katunuma N., Machleidt W., Muller-Esterl Số hóa Trung tâm Học liệu W., Sasaki M., Turk V (1986), http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 57 "Nomenclature and classification of the proteins homologous with the cystein–proteinase inhibitor chicken cystein", Biochem J, 1, pp: 236-312 22 Bray Elizabeth A (1993), “Molecular responses to water deficit”, Plant Physiol 103, pp: 1035-1040 23 Chou W.M., Shigaki J., Dammann C., Liu J.Q., Bhattachamy M.K (2004), "Inhibition of pathogenesis-related genes in soybean plant biology", 6, pp: 664-672 24 Diop N.N., Kidric., Repellin A., Gareil M., d'Acry-Lameta A., Pham Thi A.T., Zuil- Fodil Y (2004), “A mulicystatin is induced by drough-stress in cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.) leaves”, FEBS Lett 577(3), pp: 50-545 25 Gawel N J., Jarret R L (1991) “A wodified CTAB DNA extraction procedure of Musa and Ipomoea”, Plant Mol Biol Rep, 9, pp 262 – 266 26 Grudkowska M., Zagdanska B (2004), “Multifunctional role of plant cysteine proteinases, Acta Biochim Polonica, 51(3), pp: 609 - 624 27 Hatano K, Kojima M, Tanokura M, Takahashi K (1996), "Solution structure of bromelain inhibitor IV from pineapple stem: structural similarity with Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor from soybean", Biochemistry, 35(17), pp: 5379-5384 28 Kader J.C (1996) “Lipid-transfer proteins in plant”, Annu Rev Plant Phys, 47 29 Liu K.H., Lin T.Y (2003), “Cloning and characterization of two novel lipid transfer protein I genes in Vigna radiate, DNA sequence”, J Seq Map, 14(6) 30 Machleidt W., Thiele U., Laber B., Arsfald, Machleidt I., Ester L., Wiegand G., Kos J., Turk V., Bode W (1989), "Mechanism of inhibition of papain by chicken egg white cystatin: Inhibition constants of N- Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 58 terminally truncated forms and cyano gen bromid fragments of the inhibitor.", Bio Chem, 243(2), pp: 234-238 31 Martinez M., Abraham Z., Carbonero P., Diaz I (2005), “Comparative phylogenetic analysis of cytatin gen familíe from arabidopsis, rice and barley”, Mol genet gennomic, 273(5), pp 423-432 32 Misaka T., Kuroda M., Iwabuchi K., Abe K., Arai S (1996), "Soyacystatin, A novel cystein proteinase inhibitor in soybean, is distinct in protein structure and gene organization from other cystatins of animal and plant origin", European Journal of biochemistry, 240, pp: 609 33 Massonneau A., Condamine P., Wisniewski J P., Zivy M., Rogowsky P M (2005), “Maize cystatins respond to developmental cues, cold stress and drought”, Biochim Biophys Acta, 1729 (3) pp: 99-186 34 Ohtsubo S., Taiyọi M., Kawase T., Taniguchi M., Saitoh E (2005), “Oryzacystatin-II, a cystatin from rice (Oryza sativa L japonica), is a dimeric protein: posible involvement of the interconversion between dimer and monomer in the regulation of the reactivity of oryzacystatin-II”, Agric food chem, 55(5), pp 1762-1966 35 Oliveira A.S., Filho J.X., Sales M.P (2003) “Cysteine proteinases and cystatins”, Braz Arch Biol Techn, 46(1) pp: 91-104 36 Ojima A., Shiota H., Higashi K., Shimma Y., Wada M.,Satoh S (1997), "An extracularin soluble inhibitor of cysteine proteinase in cell cultrures and seed carrot", Plant molecular biology, 34, pp: 99-109 37 Rawlings N.D, Barrett A.J (1994), "Families of cysteine peptidases", Methods enzymol, 244, pp: 461-486 38 Ryan S.N., Mc Manus M.J., Laiing W.A (2003), "Indentification and characterisation of proteinase inhibitor and their gen from seeds of apple (Malus domestica)", Japanese Biochemical Society, 134(1), pp: 31-42 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 59 39 Ramanjulu S., Bartels D (2002), “Drought- and desiccation- induced modulation of gene expression in plant”, Plant cell and environment, 25(2), pp.141-151 40 Turk B., Turk V., Turk D (1997), "Structural and functional aspects of papain-like cysteine proteinase and their protein inhibitor", Biol Chem Hopp seyler, 378, pp: 141-150 41 Trysellius Y., Huttmark D (1997), "Cysteine proteinase 1, a chatepsin Llike enzyme expressed in the Drosophila melanogaster haemocyte cell line mbn-2", Insect molecular Biol, 6(2), pp: 173-181 42 Xiong L., Karen S.S., Zhu J.K (2001), "Cell signaling during cold, drought, and salt stress", The plant cell, pp: 165-183 43 Valdes R S., Guerrero R A., Melgoza V C., Chagolla L A., Delgado V.F., Martinez G N., Sanchez H N., Delano F J (2007), “Cloning of a cDNA encoding a cystatin from grain amaranth (Amaranthus hypochondriacus) showing a tissue-specific expression that is modified by germination and abiotic stress”, Plant Physiology and Biochemistry 44 Valueva J.A., Morsolov V.V (2009), “Sole of inhibitors of protecolytic enzyme in plant defense against phytipathogenic microorganisms”, Bochemistry (Moscow), 69(11).pp.1305-1309 45 Wangxia W , Basia V., Oded S., Arie A (2004), "Role of plant heat shock protein and molecular chaperon in the abiotic stress responds", Plant science, 9(5), pp: 244-252 46 Walsh J.A., Strick land J.A (1993), "Proteolysis of the 85-kilodalton crystaltine cysteine proteinase inhibitor from potato release funtional cystatin domains", Plant physiol, 103(4), pp: 1227-1234 47 Waldron C., Wegrich L.M., Merlo P.A.O, Walsh J.A (1993), "Characterization of a genemic sequence coding for potato multicystatin, Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 60 An eight-domain cystein proteinase inhibitor", Plant molecular biology, 23(4), pp: 801-812 48 Wang H., Zhang H., Gao F., Li J., Li Z (2007), “Comparision of gene expression between upland rice cultivars under water stress using cDNA microarray”, Tag, 115, pp.1109-1126 49 YamamotoY., Takimoto K., Izumi S., Tonyamasakurai M., Kageyama T., Takahash S.Y (1994), "Molecular cloning and sequencing of cDNA that encodes cysteine proteinase in the egg of silkmoth, bombysmory", T Biochem, 116, pp: 1330-1335 50.Yang W., Jifeng Y., Minika K., Maryse C., Angela S., Charlene M., Tina U., Carlene S., Jiangxin W., David T.D., Peter M., Yafan H (2005), “Molecular tailoring of faresylation for plant drought tolerance and yield protection”, The plant journal, 43, pp.413-424 51 Yin L., Lan Y., Zhu L (2008), “Analysis of the protein expression profiling during rice callus differentiation under different plant hormone conditions”, Plant mol biol, 68(6), pp.597-617 52 Zhang X., Liu S., Takano T (2008), “Two cysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasing the salt, drought, oxidation and cold tolerance”, Plant Mol Biol, 68(1-2), pp: 43131 MỘT SỐ TRANG WEB 53 www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/X67711, Qun W., Rong-Xiang F., (2006), Orsatyva HSP 70 gene for heat sock protein 70 54 www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF04688, Chen P.W and Chen L.T., (1999), Oryza sativa group LEA protein (lea) gene, complete cds 55 www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/U77295, Lee M.C., Park J.Y, Lee J.S and Eun M.Y., (1996), Oryza sativa lipid transfer protein (LPT) mRNA, complete cds Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 61 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ... chiều dài rễ với khả chịu hạn số giống lúa - Phân lập xác định đƣợc trình tự gen cystatin số giống lúa có khả chịu hạn khác NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Đánh giá khả chịu hạn phƣơng pháp gây hạn nhân tạo... hạn, tiến hành đề tài nghiên cứu: ? ?Nghiên cứu phân lập gen cystatin số giống lúa có khả chịu hạn khác nhau? ?? MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác định đƣợc mức độ chịu hạn số giống lúa giai đoạn non - Xác định... ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN MINH PHƢƠNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GEN CYSTATIN Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA CÓ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN KHÁC NHAU Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 04 02 01 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG