Nghiên cứu phân lập gen cystatin ở một số giống lúa có khả năng chịu hạn khác nhau ( Luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu phân lập genNghiên cứu phân lập gen cystatin ở một số giống lúa có khả năng chịu hạn khác nhau ( Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phân lập gen cystatin ở một số giống lúa có khả năng chịu hạn khác nhau ( Luận văn thạc sĩ) cystatin ở một số giống lúa có khả năng chịu hạn khác nhau ( Luận văn thạc sĩ)

.yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy yyyyyyyyyyyyyyyyyyyy ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN MINH PHƢƠNG yyyyyyyyyyyyyyyyy NGUYỄN VĂN TƢỜNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GEN CYSTATIN Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA CÓ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN KHÁC NHAU NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GEN NAC LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU HẠN Ở MỘT SỐ GIỐNG NGÔ ĐỊA PHƢƠNG HÀ GIANG - VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN MINH PHƢƠNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GEN CYSTATIN Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA CÓ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN KHÁC NHAU Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 04 02 01 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN VŨ THANH THANH THÁI NGUYÊN - 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh tận tình hƣớng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành đề tài Tôi xin cảm ơn kỹ thuật viên phòng thí nghiệm Sinh học, Khoa Khoa học Sự sống, Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Ngun tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành số thí nghiệm Tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp động viên khuyến khích giúp đỡ tơi suốt q trình học tập làm đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu đó! Thái Nguyên, ngày tháng 03 năm 2014 Tác giả luận văn Nguyễn Minh Phƣơng Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY LÚA 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh học lúa 1.1.3 Giá trị kinh tế lúa 1.1.4 Đặc điểm hóa sinh hạt gạo 1.1.5 Tình hình sản xuất lúa giới Việt Nam 1.2 HẠN VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY LÚA 1.2.1 Hạn ảnh hƣởng hạn tới trồng 1.2.2 Tình hình nghiên cứu đặc tính chịu hạn lúa1.2.3 Cơ sở sinh lý, hóa sinh di truyền tính chịu hạn lúa 11 1.2.4 Cystatin vai trò cystatin với tính chịu hạn 18 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 VẬT LIỆU 24 2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 25 2.2.1 Hóa chất 25 2.2.2 Thiết bị 26 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.3.1 Phƣơng pháp sinh lí, hóa sinh 26 2.3.2 Phƣơng pháp sinh học phân tử 33 2.3.3 Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide 39 2.3.4 Phƣơng pháp xử lí trình tự gen 39 2.3.5 Phƣơng pháp xử lý kết tính tốn số liệu 39 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii 2.4 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 39 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, HỐ SINH HẠT CỦA MẪU LÚA NGHIÊN CỨU 41 3.1.1 Đặc điểm hình thái khối lƣợng hạt 41 3.1.2 Hàm lƣợng protein lipid 42 3.1.3 Hoạt tính α – amylase 43 3.1.4 Hoạt tính protease 44 3.1.5 Chiều dài rễ giống lúa nghiên cứu giai đoạn non 44 3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA GIỐNG LÚA Ở GIAI ĐOẠN CÂY MẠ 46 3.3 KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN 48 3.3.1 Kết tách chiết DNA tổng số 48 3.3.2 Kết nhân gen Cystatin 49 3.3.3 Kết xác định trình tự gen Cystatin 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54 Kết luận 54 Đề nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic Acid (Axit abxisic) ASTT u Bp ) CTAB Cetyltrimethyl – amonium bromide CUC Cup Shaped Cotyledon CYS Cystatin DNA Axit deoxyribonucleic (Deoxyribonucleic acid) đtg Đồng tác giả JA Jasmonic acid HSP Heat shock pro ) LTP ) MX mồi xuôi MN mồi ngƣợc LEA ) NAM No Apical Merstem PCR ) P5CS Pyroline – – carboylate synthase TAE Tris Acetate EDTA Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Tình hình sản xuất lúa giới từ năm 2000 – 2012 Bảng 1.2 Tình hình sản xuất lúa Việt Nam từ năm 2000 – 2012 Bảng 2.1 Đặc điểm 09 giống lúa nghiên cứu 24 Bảng 2.2 Danh mục thiết bị sử dụng 26 Bảng 2.3 Cặp mồi nhân gen cystatin 35 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng nhân gen cystatin 35 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector 36 Bảng 3.1 Hình thái khối lƣợng hạt giống lúa 41 Bảng 3.2 Hàm lƣợng protein lipid giống lúa 42 Bảng 3.3 Hoạt tính enzyme α – amylase giống lúa 43 Bảng 3.4 Hoạt tính protease giống lúa 44 Bảng 3.5 Chiều dài rễ giống lúa 45 Bảng 3.6 Khả chịu hạn giai đoạn non giống lúa 46 Bảng 3.7 Phổ hấp phụ DNA bƣớc sóng 260 nm 280 nm giống lúa nghiên cứu 49 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Hình ảnh hạt giống lúa nghiên cứu……………………….25 Hình 2.2 Vector pBT 37 Hình 3.1 Đồ thị rada biểu diễn khả chịu hạn giống lúa nghiên cứu 47 Hình 3.2 Hình ảnh điện di DNA tổng số giống lúa nghiên cứu 48 Hình 3.3 Hình ảnh điện di kết PCR nhân gen Cystatin mẫu luá LH Sym6 50 Hình 3.4 Kết điện di tách plasmid tái tổ hợp mang gen cystatin 50 Hình 3.5 Trình tự nucleotide gen cystatin hai giống LH Sym6 521 Hình 3.6 So sánh trình tự amino acid suy diễn protein cystatin hai giống lúa nghiên cứu AF435976……………………………… ….….53 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Lúa gạo (Ozyza sativa L.) lƣơng thực chiếm 10% diện tích trồng trọt lƣơng thực ni sống nửa dân số giới Hiện nay, lúa đƣợc xếp vào vị trí thứ hai sau lúa mì diện tích sản lƣợng Lúa gạo nguồn cung cấp lƣợng lớn cho ngƣời Trên giới, lúa đƣợc khoảng 250 triệu nông dân trồng 100 nƣớc giới Ở Việt Nam, lúa lƣơng thực quan trọng đƣợc trồng nhiều vùng sinh thái khác nhau, đa dạng mùa vụ gieo trồng hệ thống canh tác Trong thập kỉ qua, loài ngƣời đứng trƣớc nguy bùng nổ dân số theo FAO để đảm bảo mức tiêu dùng ổn định, mức tăng sản lƣợng hàng năm cần gấp lần so với mức tăng dân số Trƣớc tình hình lúa đối tƣợng nghiên cứu nhiều nhà khoa học Trong năm gần đây, trình biến đổi khí hậu trái đất diễn phức tạp, khó lƣờng theo chiều hƣớng xấu mơi trƣờng nhƣ: Hạn hán, lũ lụt, xói mòn, thối hố đất,…Ở Việt Nam, năm qua, có hạn chế điều kiện tƣới tiêu, tập quán canh tác đặc biệt việc chọn giống chịu hạn đƣa vào sản xuất chƣa đƣợc trọng, thêm vào diễn biến thời tiết phức tạp, hạn hán thƣờng xuyên xảy gây ảnh hƣởng không nhỏ đến suất chất lƣợng nhiều loại trồng có lúa Cây lúa loài tƣơng đối mẫn cảm với điều kiện bất lợi ngoại cảnh thuộc nhóm chịu hạn Vì vậy, việc tạo giống lúa có suất cao, khả chống chịu tốt yêu cầu thực tiễn đề cho nhà khoa học Trên giới nay, chọn tạo trồng theo hƣớng chống chịu vấn đề đƣợc đặt trọng tâm nghiên cứu, chọn tạo giống lúa theo hƣớng chống khô hạn nhận đƣợc quan tâm nhiều nhà khoa học Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Nghiên cứu gen liên quan đến tính chịu hạn cho thấy tính chống chịu khơ hạn tính trạng đa gen Các trình tự gen liên quan đến tính chịu hạn lúa đƣợc công bố ngân hàng gen Quốc tế, có gen cystatin Cystatin chất ức chế có chất protein, gen thƣờng đƣợc biểu điều kiện hạn, lạnh, mặn pha riêng rẽ trình sinh trƣởng, phát triển thực vật Mặc dù nghiên cứu gen liên quan đến tính chịu hạn ngày đƣợc quan tâm nhƣng thông tin gen chƣa nhiều Vấn đề đặt cần tìm hiểu đặc điểm sinh lý, hoá sinh sinh học phân tử liên quan đến tính chịu hạn lúa Trên sở định hƣớng cho cơng tác chọn giống cải tạo giống phù hợp có khả chịu hạn tốt Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn việc chọn tạo giống lúa theo hƣớng nâng cao khả chịu hạn, tiến hành đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu phân lập gen cystatin số giống lúa có khả chịu hạn khác nhau” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác định đƣợc mức độ chịu hạn số giống lúa giai đoạn non - Xác định đƣợc mối liên quan hoạt tính α – amylase, protease, chiều dài rễ với khả chịu hạn số giống lúa - Phân lập xác định đƣợc trình tự gen cystatin số giống lúa có khả chịu hạn khác NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Đánh giá khả chịu hạn phƣơng pháp gây hạn nhân tạo giai đoạn 3, 5, 7, ngày gây hạn - Xác định hoạt tính α – amylase, protease hạt 09 giống lúa nghiên cứu - Xác định chiều dài rễ ngày tuổi giai đoạn non - Khuyếch đại, tách dòng xác định trình tự gen cystatin giống lúa có khả chịu hạn tốt giống lúa chịu hạn Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ... chiều dài rễ với khả chịu hạn số giống lúa - Phân lập xác định đƣợc trình tự gen cystatin số giống lúa có khả chịu hạn khác NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Đánh giá khả chịu hạn phƣơng pháp gây hạn nhân tạo... hạn, tiến hành đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu phân lập gen cystatin số giống lúa có khả chịu hạn khác nhau MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác định đƣợc mức độ chịu hạn số giống lúa giai đoạn non - Xác định... HỌC NGUYỄN MINH PHƢƠNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GEN CYSTATIN Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA CÓ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN KHÁC NHAU Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 04 02 01 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC