Phát triển hệ thống tái sinh in vitro nhằm phục vụ chuyển gen ở cây lạc arachis hypogaea l

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM PHẠM VIỆT HẢI PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO NHẰM PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY LẠC (ARACHIS HYPOGAEA L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN – 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM PHẠM VIỆT HẢI PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO NHẰM PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY LẠC (ARACHIS HYPOGAEA L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 01 21 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hồng Mậu THÁI NGUN – 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn THAI NGUYEN UNIVERSITY THE COLLEGE OF EDUCATION - PHAM VIET HAI DEVELOPMENT OF REGENERATION SYSTEM IN VITRO TO SERVE THE GENE TRANSFER IN PEANUT CULTIVARS (ARACHIS HYPOGAEA) MASTER THESIS IN BIOLOGY Specialyty: GENETICS Code: 60 42 01 21 Scientific supervisor: Prof CHU HOANG MAU Ph.D THAI NGUYEN – 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên THAI NGUYEN – 2013 http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố Tác giả luận văn Phạm Việt Hải i Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn tới GS.TS Chu Hồng Mậu tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sau Đại học, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – Kỹ thuật Nông nghiệp thầy cô giáo, cán Khoa quan tâm giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Tâm, TS Vũ Thị Thu Thuỷ, NCS Nguyễn Thị Thu Ngà, chị Trần Thị Hồng, chị Đào Thu Thủy thầy cô Bộ môn Di truyền & Sinh học đại, khoa Sinh – Kỹ thuật Nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Tôi xin cảm ơn Trung tâm nghiên cứu Phát triển đậu đỗ, Viện lương thực thực phẩm - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp giống lạc làm vật liệu cho thí nghiệm đề tài Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, mợ, anh chị em gia đình tơi giúp đỡ, động viên tơi nhiều q trình học tập Tác giả luận văn Phạm Việt Hải ii Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn iii Mục lục iiii Những chữ viết tắt .v Danh mục bảng vi Danh mục hình viii MỞ ĐẦU Chƣơng I Tổng quan tài liệu 1.1 Cây lạc 1.1.1 Nguồn gốc, phân bố, phân loại, đặc điểm sinh học lạc 1.1.2 Giá trị dinh dưỡng giá trị kinh tế lạc…… ……………… 1.1.3 Tình hình sản xuất lạc giới Việt Nam 1.2 Hệ thống tái sinh in vitro lạc 11 1.2.1 Cơ sở khoa học kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 11 1.2.2 Ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến q trình ni cấy mơ tế bào thực vật Error! Bookmark not defined.12 1.2.3 Tái sinh 13 1.2.4 Nghiên cứu hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen lạc 15 1.2.5 Hệ thống tái sinh chuyển gen gián tiếp lạc ……………… 18 Chƣơng II Nguyên liêu phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 23 2.1.1 Nguyên liệu 23 2.1.2 Hóa chất thiết bị 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 iii Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro 24 2.2.2 Phương pháp xử lý kết tính tốn số liệu 30 Chƣơng III Kết thảo luận 31 3.1 Ảnh hưởng nồng độ chất đến kết khử trùng hạt 31 3.2 Kết tái sinh lạc từ nách mầm 32 3.2.1 Môi trường tạo nảy mầm cho hạt lạc 32 3.2.2 Môi trường cảm ứng chồi nách mầm 32 3.2.3 Môi trường kéo dài chồi hai giống lạc 38 3.2.4 Mơi trường rễ tạo hồn chỉnh 40 3.2.5 Nhận xét môi trường tái sinh chồi từ nách mầm 41 3.3 Kết tái sinh từ mô sẹo phôi trục hạt lạc 42 3.3.1 Ảnh hưởng nồng độ 2,4D đến khả tạo mô sẹo từ phôi lạc 42 3.3.2 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh từ mô sẹo phôi lạc 45 3.3.3 Môi trường tạo rễ chồi tái sinh từ mô sẹo 48 3.3.4 Nhận xét môi trường tái sinh lạc từ mô sẹo phôi 49 3.4 Kết tái sinh thơng qua hình thành phôi soma 49 3.4.1 Môi trường cảm ứng tạo cụm phôi soma phôi trục hạt lạc 49 3.4.2 Môi trường tái sinh từ phôi soma 53 3.4.3 Khả rễ tạo hoàn chỉnh từ phôi soma 56 3.4.4 Nhận xét môi trường tái sinh lạc từ phôi soma 57 3.5 Ra chế độ chăm sóc 57 3.6 So sánh hiệu tái sinh từ ba hệ thống sinh khác giống lạc…………………………………………………………………… 59 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 iv Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4D 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid BAP - Benzyl Amino Purin cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acid EM Môi trường phát triển phôi soma GA3 Gibberellic acid GM Môi trường nảy mầm hạt IAA ß – indol axetic acid IBA Indole butyric acid KN Kinitin MS Murashige – Skoog (1962) NAA Naphthyl acetic acid PM Môi trường tiền cảm ứng phôi soma RIM Môi trường cảm ứng rễ chồi RM Môi trường rễ cho phôi soma SEM Môi trường kéo dài chồi SIM Môi trường cảm ứng tạo chồi SM Môi trường nảy mầm phôi soma TB Trung bình v Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Tình hình sản xuất lạc giới ( 2002 - 2007) Bảng 1.2 Các quốc gia sản xuất lạc nhiều giới Bảng 1.3 Diễn biến sản xuất lạc nước ta 10 Bảng 1.4 Diện tích, suất, sản lượng lạc vùng trọng 11 điểm Việt Nam năm 2009 Bảng 1.5 Một số báo cáo chuyển gen lạc thông qua vi 20 khuẩn A tumefaciens (trước năm 2000) Bảng 1.6 Một số báo cáo chuyển gen lạc (năm 2000-2009) 22 Bảng 2.1 Thành phần loại môi trường nuôi cấy dùng cho hệ 26 thống tái sinh từ nách mầm Bảng 2.2 Thành phần loại môi trường nuôi cấy dùng cho hệ 29 thống tái sinh từ phôi soma Bảng 3.1 Ảnh hưởng nồng độ BAP tổ hợp BAP với NAA 35 đến khả cảm ứng tạo chồi Bảng 3.2 Ảnh hưởng tác động gây thương tổn đến khả 37 tạo đa chồi môi trường cảm ứng tạo chồi tốt Bảng 3.3 Ảnh hưởng BAP tổ hợp BAP với NAA đến 39 khả kéo dài chồi Bảng 3.4 Hiệu kích thích rễ cho lạc NAA IBA 40 Bảng 3.5 Ảnh hưởng 2,4-D đến khả tạo mô sẹo 42 giống lạc Bảng 3.6 Khối lượng mô sẹo giống lạc mức nồng vi Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 44 độ 2,4-D Bảng 3.7 Ảnh hưởng BAP tổ hợp BAP với NAA đến tỷ lệ 46 tái sinh chồi từ mô sẹo (%) Bảng 3.8 Ảnh hưởng BAP tổ hợp BAP với NAA đến khả 48 tạo chồi mô sẹo lạc sau tuần tái sinh Bảng 3.9 Ảnh hưởng nồng độ khác 2,4-D đến khả 50 cảm ứng phôi soma giống lạc (%) Bảng 3.10 Ảnh hưởng BAP tổ hợp BAP với NAA đến khả 53 tái sinh phôi soma sau tuần Bảng 3.11 Hiệu tái sinh hệ thống tái sinh vii Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 59 Hình 3.13 Cây tái sinh từ phôi soma với rễ hồn chỉnh 3.4.4 Nhận xét mơi trƣờng tái sinh lạc từ phơi soma (1) Mơi trường thích hợp cho phôi trục cảm ứng phôi soma môi trường 2,4D (20 mg/l) giống L23 L26 (2) Mơi trường thích hợp cho tái sinh phơi soma (trong phạm vi bố trí thí nghiệm đề tài) môi trường BAP (0,3 mg/l) giống L23 L26 (3) Môi trường thích hợp cho rễ tạo hồn chỉnh từ phơi soma mơi trường có bổ sung 0,3 mg/l NAA, môi trường tỷ lệ tạo rễ, số rễ/cây kích thước rễ cao (4) Tổng thời gian dành cho quy trình tái sinh hồn chỉnh từ mô sẹo phôi mầm hai giống lạc tính từ tạo mơ sẹo đến hoàn thiện rễ 26 tuần 3.5 RA CÂY VÀ CHẾ ĐỘ CHĂM SÓC Khi ống nghiệm có kích thước - cm với hệ rễ phát triển đưa ngồi ni cốc nhựa (Hình 3.14A), chăm sóc cẩn thận (tiến hành mục 2.2.1.5) Sau khoảng 20 – 28 ngày lạc mọc rễ (Hình 3.14B) Tiếp đến chuyển vườn ươm đề tăng trưởng chiều cao, hoa kết (Hình 3.14C, D) Giá thể tốt giúp cho lạc tái sinh ống nghiệm đạt tỷ lệ sống sót cao hỗn hợp đất, cát với tỷ lệ 1:1 Khi sử dụng loại giá thể này, tỷ lệ sống 58 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn sót 80% cao so với dùng loại giá thể đơn lẻ có 100% đất 100% cát (tỷ lệ sống sót 30% 42%), thời gian tạo rễ ngắn (22 ngày so với 28, 30 ngày trồng giá thể 100% đất 100% cát) Khi chuyển từ cốc nhựa sang vườn ươm, phần lớn lạc tái sinh ống nghiệm tạo số lượng nhánh so với trồng từ hạt, số lượng tạo (trung bình 12 / gốc) (Hình 3.14B, C, D) A B D C E Hình 3.14 Sự sinh trưởng tái sinh ống nghiệm A - Cây tái sinh hoàn chỉnh trồng cốc nhựa chứa giá thể đất, cát tỷ lệ : B - Cây mọc sau 22 ngày đưa ống nghiệm C - Cây lạc hoa kết D - Cây tái sinh ống nghiệm cho với số lượng E - Cây lạc đối chứng cho 59 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.6 SO SÁNH HIỆU QUẢ TÁI SINH TỪ BA HỆ THỐNG TÁI SINH KHÁC NHAU TRÊN CÙNG MỘT GIỐNG LẠC Trong báo cáo trước đối tượng lạc, chưa thấy có nghiên cứu tiến hành đồng thời nhiều hệ thống tái sinh giống lạc, phần lớn tiến hành nghiên cứu hệ thống tái sinh định giống lạc đồng thời vài giống lạc Vì việc so sánh hiệu hệ thống tái sinh thường khơng tồn diện bị ảnh hưởng yếu tố khác giống Trong thí nghiệm này, chúng tơi tiến hành phân tích hiệu ba hệ thống tái sinh giống tiến hành song song hai giống lạc khác L23 L26, kết trình bày bảng 3.11 Bảng 3.11 Hiệu tái sinh hệ thống tái sinh Hệ thống Thời gian tạo mẫu tái Tỷ lệ tái sinh cao Số chồi cao Thời gian tái sinh hoàn tái sinh sinh (ngày) (%) L23 L26 L23 L26 L23 L26 L23 L26 L23 L26 Hình thành mơ sẹo 10 10 96,7 93,3 1,6 1,7 56 56 66 66 Đa chồi nách mầm 7 75 69 6,29 5,68 98 98 105 105 Hình thành phôi soma 70 70 36,0 34,7 1 112 112 182 182 mẫu Tổng thời gian hoàn chỉnh (ngày) thành (ngày) Kết thể bảng 3.11 cho thấy thời gian hoàn thành ba hệ thống tái sinh có khác biệt lớn, hệ thống tái sinh từ mơ sẹo có thời gian hoàn thành ngắn từ khâu chuẩn bị mẫu cho tái sinh (tạo mô sẹo) khâu tái sinh khoảng 66 ngày (khoảng tháng); tiếp đến hệ thống tái sinh đa chồi từ nách mầm hoàn thành 105 ngày (tương đương khoảng 60 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn tháng rưỡi); sau hệ thống tái sinh từ hình thành phơi soma có thời gian hồn thành chậm từ khâu chuẩn bị mẫu cho tái sinh (phôi soma) khâu tái sinh phải 182 ngày (tương đương với sáu tháng) Trong hiệu tái sinh lại thuộc hệ thống tái sinh từ hình thành phơi soma với tỷ lệ tái sinh dao động từ 34,7% - 36% giống với hệ số chồi chồi/ phôi soma; tiếp đến hệ thống tái sinh từ mô sẹo với tỉ lệ tái sinh lên đến 93,3% - 96,7% giống hệ số tạo chồi 1,6 – 1,7 chồi/ mô sẹo; hiệu tái sinh cao thuộc hệ thống tái sinh đa chồi từ nách mầm hai giống với tỷ lệ tái sinh tương đối cao 69% - 75% hệ số chồi tạo 5,68 - 6,29/ nách mầm Kết nghiên cứu khẳng định điều hệ thống tái sinh đa chồi từ nách mầm hướng nghiên cứu có triển vọng để ứng dụng vào nghiên cứu chuyển gen không cho riêng lạc mà họ đậu nói chung [31], thực tế giới tiến hành chuyển gen tái sinh thành công thông qua hệ thống tái sinh đa chồi từ nách mầm số họ đậu đậu tương, pea, pigeon pea, chickpea, mung bean lạc [63] Trong tái sinh thơng qua hình thành phơi soma, trở ngại lớn tần số thấp chuyển đổi phôi thành Chuyển đổi phôi soma thành dường phụ thuộc vào kiểu gen, tỷ lệ chuyển đổi thấp thường chưa trưởng thành cấu trúc bất thường phôi Trong hầu hết nghiên cứu, q trình tái sinh thơng qua hình thành phơi soma địi hỏi nhiều bước rườm rà, phức tạp phương thức tái sinh không tốn thời gian mà nảy sinh nguy bị nhiễm cao trình thao tác ống nghiệm Quan trọng thời gian kéo dài việc nuôi cấy mô tần số tái sinh phôi soma thấp khiến cho hiệu chuyển gen lạc bị ảnh hưởng đáng kể Do đó, chuyển gen lạc, việc tăng cường hiệu tái sinh giảm thiểu thời gian để phục hồi biến đổi gen mục tiêu quan trọng hai phương thức chuyển gen trực tiếp hay gián tiếp [52] Trong nghiên cứu này, phát triển phương thức hiệu cho tái sinh lạc thông qua phát sinh đa chồi từ nuôi cấy nách mầm Hệ thống tái sinh đơn giản tiết kiệm thời gian, với tần số cao cảm ứng đa chồi áp dụng cho giống lạc khác 61 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Điều kiện khử trùng hạt lạc thích hợp cho hai giống L23, L26 cồn 70% thủy ngân clorua 0,2% 1.2 Môi trường tạo đa chồi có hiệu mơi trường MS có bổ sung BAP (nồng độ 4mg/l) + NAA (0,1mg/l) giống L23 môi trường MS bổ sung BAP (5mg/l) + NAA (0,5mg/l) giống L26, mẫu cấy phải có gây thương tổn Mơi trường kéo dài chồi tốt mơi trường MS có bổ sung 2mg/l BAP + 0,1mg/l NAA giống lạc L23 mơi trường có bổ sung 2,5mg/l BAP + 0,1mg/l NAA giống lạc L26 1.3 Môi trường MS có bổ sung 12mg/l 2,4D mơi trường thích hợp cho tạo mô sẹo giống lạc L23 L26 Môi trường MS bổ sung BAP với nồng độ 2mg/l cho tỷ lệ tái sinh, số chồi trung bình, kích thước trung bình chồi cao Mơ sẹo chẻ làm đơi có khả tái sinh tốt giống lạc 1.4 Hệ thống tái sinh hoàn chỉnh in vitro phương pháp hình thành phơi soma từ phơi trục trưởng thành thực thành công giống lạc L23 L26 Môi trường tiền cảm ứng phôi soma mơi trường MS có bổ sung 2,4-D nồng độ 20mg/l giúp phôi trục cảm ứng phôi soma tốt tạo số phôi soma cao mơi trường phát triển có bổ sung 3mg/l 2,4-D Mơi trường nảy mầm phơi soma thích hợp mơi trường MS có bổ sung 0,3mg/l BAP 1.5 Mơi trường rễ mơi trường MS có bổ sung NAA với nồng độ thích hợp 0,3mg/l hai giống lạc L23 L26 Cả hai giống lạc L23 L26 tái sinh hồn chỉnh in vitro ba hệ thống tái sinh: từ nách mầm, từ mô sẹo từ hình thành phơi soma Cây tái sinh hồn chỉnh in vitro có khả hoa kết trồng vườn ruộng 62 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.6 Hệ thống tái sinh từ mơ sẹo có thời gian hồn thành ngắn (9 tuần), hiệu tạo đa chồi Hệ thống tái sinh từ hình thành phơi soma có thời gian hồn thành chậm (26 tuần), tiềm tạo đa phôi soma tái sinh hồn chỉnh từ phơi soma cao Hệ thống tái sinh từ nách mầm có thời gian hồn thành 15 tuần có hiệu tái sinh khả tạo đa chồi cao, thích hợp cho nghiên cứu chuyển gen lạc Đề nghị 2.1 Tiếp tục nghiên cứu sâu, rộng điều kiện tối ưu nhằm tăng cường khả tái sinh in vitro từ phôi soma giống lạc 2.2 Tiếp tục nghiên cứu kết hợp thử nghiệm chuyển gen hệ thống tái sinh đa chồi từ nách mầm giống lạc L23 L26 63 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Văn Bình, Vũ Đình Chính, Nguyễn Thế Cơn, Lê Song Dự, Đoàn Thị Thanh Nhàn, Bùi Xuân Sửu (1996), Giáo trình cơng nghiệp, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội Nguyễn Khoa Chi (1987), Cây đậu phộng, Nxb TP Hồ Chí Minh, 4-95 Nguyễn Thị Chinh (2005), Kỹ thuật thâm canh lạc suất cao, Nxb Nông nghiệp, 25 – 47 Lê Song Dự, Nguyễn Thế Côn (1979), Giáo trình lạc, Nxb Nơng Nghiệp Trần Văn Điền (1990), Giáo trình lạc, Trường Đại học Nơng nghiệp I, Nxb Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Danh Đông, Ngô Ngọc Đăng, Nguyễn Thế Côn, Dương Văn Nghĩa, Lê Quang Hanh, Ngô Đức Dương (1984), Cây lạc, Nxb Hà Nội Vũ Công Hậu, Ngô Thế Dân, Trần Thị Dung (biên dịch) (1995), Cây lạc, Nxb Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh, 3-92 Nguyễn Thị Thuý Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009), “Phát triển hệ thống tái sinh in vitro đậu tương ((Glycine max (L.) Merill) phục vụ chuyển gen”, Tạp chí Khoa học & Công nghệ, 52(4): 89 – 93 Ngô Thị Liêm (2006), Nghiên cứu đa dạng di truyền khả chịu hạn số giống lạc, Luận văn thạc sỹ khoa học Sinh học, Trường Đại học sư phạm Thái Nguyên 10 Nguyễn Thị Luyện, Chu Hoàng Mậu (2009), Phát triển hệ thống tái sinh đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) phục vụ chọn dòng chịu hạn chuyển gen, Luận văn thạc sỹ khoa học Sinh học, Trường Đại học sư phạm Thái Nguyên 11 Niên giám thống kê năm năm http://www.gso.gov.vn/ 2004 đến năm 2010 truy cập địa chỉ: 64 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 12 Nguyễn Xuân Tài, Đỗ Tiến Phát, Đinh Thị Phòng, Phan Thị Liên Hương, Vũ Văn Vụ (2005), Nghiên cứu biến dị soma quần thể lạc tái sinh in vitro, Nxb Khoa học kỹ thuật, 1366 13 Nguyễn Thị Tâm, Chu Hồng Mậu, Ngơ Thị Liêm, Bùi Thị Hồi Loan (2006), “Nghiên cứu mơi trường nuôi cấy in vitro phôi lạc phục vụ nghiên cứu chọn dịng chịu hạn”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Đại học Thái Nguyên, 1(37): 87 – 92 14 Bùi Văn Thắng, Đinh Thị Phịng, Chu Hồng Hà (2004), “Nghiên cứu hệ thống tái sinh lạc (Arachis hypogaea L.) phục vụ cho chuyển gen”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2(3): 371 – 379, 2004 15 Vũ Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2009), “Chọn dòng tế bào chịu hạn lạc (Arachis hypogaea L.) phương pháp ni cấy invitro”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển Nông thôn, số 7/2009, 14-19 16 Phan Hữu Tơn (2004), Giáo trình Cơng nghệ sinh học chọn tạo giống trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 17 Tạ Quốc Tuấn, Trần Văn Lợt (2006), Cây đậu phộng, kỹ thuật trồng thâm canh, Nxb Nông nghiệp 18 Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật ứng dụng, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội (148 trang) 19 Chu Hồng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền đại chọn giống trồng, Nxb Đại học Thái Nguyên, 13-202 Tiếng Anh 20 Babaoglu M., Davey M.R., and J.B Power (2000), “Genetic engineering of grain legumes: Key transformation events”, AgBiotech Net (June): ABN 050 21 Bajaj Y.P.S., Kumar P., Labana K.S., and Singh M.M (1981), “Regeneration of plants from seedling explants and callus cultures of Arachis hypogaea L”, Indian Journal of Experimental Biology, 19:1026-1029 22 Baker C.M & Wetzstein H.Y (1992), “Somatic embryogenesis and plant regeneration from leaflets of peanut, Arachis hypogaea L”, Plant Cell Rep, 11:71–75 23 Baker C.M & Wetzstein H.Y (1994), “Influence of auxin-type and concentration on peanut somatic embryogenesis”, Plant Cell Tiss Org Cult, 36:361–368 65 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 24 Baker C.M and Wetzstein H.Y (1995), “Repetitive somatic embryogenesis in peanut cotyledon cultures by continual exposure to 2,4-D”, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 40:249-54 25 Banerjee S., Bandyopadhyay & Ghosh P.D (1988), “Cotyledonary node culture and multiple shoot formation in peanut: evidences for somatic embryogenesis”, Current Sci, 57 (5): 252-255 26 Beena M.R., Tuli R., Datta-Gupta A., and Kirti P.B (2008), “Transgenic peanut (Arachis hypogaea L.) plants expressing cryI E-C and rice chitinase cDNA (Chi 11) exhibit resistance against insect pest, Spodoptera litura and fungal pathogen Phaeoisariopsis personata”, (Revised version, submitted) 27 Beena M.R., Jami S.K., Srinivasan T., Swathi Anuradha T., Padmaja G., and Kirti P.B (2005), “Efficient direct shoot regeneration from cotyledonary node explants of peanut (Arachis hypogaea L cv JL-24)”, Indian Journal of Plant Physiology, 10:205-210 28 Bean S.J., Gooding P.S., Mullineaux P.M., and Davies D.R (1997), “A simple system for pea transformation”, Plant Cell Reports, 16:513-519 29 Bhatnagar-Mathur P., Devi M.J., Reddy D.S., Lavanya M., Vadez V., Serraj R., Yamaguchi-Shinozaki K., Sharma K.K (2007), “Stress-inducible expression of at DREB1A in transgenic peanut (Arachis hypogaea L.) increases transpiration efficiency under water-limiting conditions”, Plant Cell Rep, 26, 2071-2082 30 Bhatnagar-Mathur P., Devi M.J., Vadez V., Sharma K.K (2009), “Differential antioxidative responses in transgenic peanut bear no relationship to their superior transpiration efficiency under drought stress”, J Plant Physiol, 166, 1207-1217 31 Chandra A & Pental D (2003), ―Regeneration and genetic transformation of grain legumes: An overview‖, Current Science, 84(3): 381-387 32 Cheng M., Jarret R.L., Li Z & Demski J.W (1997a), “Expression and inheritance of foreign genes in transgenic peanut plants generated by Agrobacteriummediated transformation”, Plant Cell Rep, 16:541–544 33 Cheng M., Jarret R.L., Li Z., Xing A & Demski J.W (1996), “Production of fertile transgenic peanut (Arachis hypogaea L.) plants using tumefaciens”, Plant Cell Rep,15:653–657 Agrobacterium 66 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 34 Chengalrayan K., Sathaye S.S & Hazra S (1994), “Somatic embryogenesis from mature embryo derived leaflets of peanut (Arachis hypogaea L.)”, Plant Cell Rep, 13:578-581 35 Chengalrayan K., Mhaske V.B & Hazra S (1995), “In vitro regulation of morphogenesis in peanut (Arachis hypogaea L.)”, Plant Sci, 110:259-268 36 Chengalrayan K., Mhaske V.B & Hazra S (1997), “High frequency conversion of abnormal peanut somatic embryos”, Plant Cell Rep, 16:783-786 37 Chengalrayan K., Hazra S & Gallo-Meagher M (2001), “Histological analysis of somatic embryogenesis and organogenesis induced from mature zygotic embryo-derived leaflets of peanut (Arachis hypogaea L.)”, Plant Sci, 161:415-421 38 Chu Y., Deng X.Y., Faustinelli P & Ozias-Akins P (2008), “Bcl-XL transformed peanut (Arachis hypogaea L.) exhibits paraquat tolerance”, Plant Cell Rep, 27(1): 85-92 39 Dodo H.W., Konan K.N., Chen F.C., Egnin M., Viquez O.M (2008), “Alleviating peanut allergy using genetic engineering: The silencing of the immunodominant allergen Ara h leads to its significant reduction and a decrease in peanut allergenicity”, Plant Biotechnol J., 6: 135-145 40 Eapen S & George L (1993), “Somatic embyogenesis in peanut: influence of growth regulators and sugars”, Plant Cell Tiss Org Cult, 35:151-156 41 Eapen S & George L (1994), “Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer in peanut (Arachis hypogaea L.)”, Plant Cell Rep, 13:582–586 42 Egnin, Mora M.A & Prakash C.S (1998), “Factors enhancing Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer in peanut (Arachis hypogaea L.)”, In Vitro Cell Dev Biol Plant, 34:310–318 43 Filippov M., Miroshnichenko D., Vernikovskaya D & Dolgov S (2006), “The effect of auxins, time exposure to auxin and genotypes on somatic embryogenesis from mature embryos of wheat”, Plant Cell Tiss Org Cult, 84: 213-222 44 Gairi A & Rashid A (2004), “Direct differentiation of somatic embryos on different regions of intact seedlings of Azadirachta in response to thidiazuron”, j plant physiol, 161:1073-1077 67 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 45 Gamborg O.L., Miller R.A and Ojima K (1968), “Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells”, Journal of Experimenal Research: 151-158 46 Gulati A., Jaiwal P.K (1994), “Plant regeneration from cotyledonary node explants of mungbean (Vigna radiata (L.) Wilczek)”, Plant Cell Rep 13:523–527 47 Gohari A.A and Niyaki Syed A.N (2010), “Effects of Iron and Nitrogen Fertilizers on Yield and Yield Components of Peanut (Arachis hypogaea L.) in Astaneh Ashrafiyeh, Iran”, American-Eurasian J Agric Environ Sci., 9: 256–262 48 http://www.icrisat.org/GroundNut/GroundNut.htm 49 http://www.faostat.fao.org/site/339/default.aspx 50 Jaiwal P.K., Kumari R., Ignacimuthu S., Potrykus I., and Sauter C (2001), “Agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation of mungbean [Vigna radiata (L.)Wilczek] - a recalcitrant grain legume”, Plant Science, 161:239-247 51 Jimenez V.M (2001), “Regulation of in vitro somatic embryogenesis with emphasis on the role of endogenous hormones”, Rev Bras Fisiol Veg, 13: 196–223 52 Joshi M., Niu C., Fleming C., Hazra S., Chu Y., Nairn C.J., Yang H & OziasAkins P (2005), “Use of green fluorescent protein as a non-destructive marker for peanut genetic transformation”, In Vitro Cell Dev Biol Plant, 41:437-445 53 Khandelwal A., Vally K.J.M., Geeta N., Venkatachalam P., Shaila M.S and Lakshmi Sita G (2003), “Engineering hemagglutinin (H) protein of rinder pest virus into peanut (Arachis hypogaea L.) as a possible source of vaccine”, Plant Science, 165:77-84 54 Lacorte C., Mansur, Timmerman B and Cordeiro A.R (1991), “Gene transfer into peanut (Arachis hypogaea L.) by Agrobaclerium tumefaciens”, Plant Cell Reports, 10: 354-357 55 McKently A.H., Moore G.A and Gardner F.P (1991), “Regeneration of peanut and perennial peanut from cultured leaf tissue”, Crop Science, 31:833-837 56 McKently A.H (1995), “Effect of genotype on somatic embryogenesis from axes of mature peanut embryos”, Plant Cell Tiss Org Cult, 42 :251–254 68 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 57 Murashige T and Skoog F (1962), “A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture”, Physiology Planta, 15:473-497 58 Norbor M W (1990), “Environmental stress resistance”, In: Plant Cell Line Selection, Weihein, New York, Basel, Cambridge, VCH, pp 167 – 186 59 Olhoft P.M., Flagel L.E., Donovan C.M and Somers D.A (2003), “Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method”, Planta, 216:723-735 60 Ozias - Akins P., Anderson W.F & Holbrook C.C (1992), “Somatic embryogenesis in Arachis hypogaea L.: genotype comparison”, Plant Sci, 83: 103–111 61 Panaia M., Senaratna T., Dixon K.W & Sivasithamparam (2004), “The role of cytokinins and thidiazuron in the stimulation of somatic embryogenesis in key members of the Restionaceae”, Austra J Bot, 52: 257-265 62 Philips G.C and Gamborg O.L (2005), “Plant cell tissue and organ culture”, pp 91- 93 Published by N.K Mehra.Narosa publishing house 6, community centre New Delhi, India 63 Kirti P.B (2008), ―Handbook of New Technologies for Genetic Improvement of Legumes‖, editor , 227-257 64 Qiusheng Z., Bao j., Likuun L & Xianhua X (2005), “Effects of antioxidants on the plant regeneration and GUS expressive frequency of peanut (Arachis hypogaea L.) explants by Agrobacterium tumefaciens”, Plant Cell Tiss Organ Cult, 81: 83-90 65 Raghvan V (2005), “Control of leaf formation and somatic embryogenesis in cultured zygotic embryos of Arabidopsis thaliana by 2,4-D-dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D)”, Int J Plant Sci, 166 (4): 575-588 66 Raghava R.N.V., Nabors M.V (1985), “Plant negeneration from tissue cultures of Pokali rice is promoted by optizing callus to medium volume ratio and by a medium conditioning factor produced by embryogeneic callus”, Cell Tiss Org Cult, 4, pp 241 – 248 67 Rao R.C.N and Nigam S.N (2001), “Genetic options for drought anagement in groundnut In Management of agricultural drought—agronomic and genetic options‖, N.P Saxena (ed.) New Delhi: Oxford & IBH Publishing, pp 123-142 69 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 68 Renato A Avenido, Jo Motoda and Kazumi Hattori (2001), “Direct shoot regeneration from cotyledonary nodes as a marker for genomic groupings within the Asiatic Vigna (subgenus Ceratotropis {Piper} Verdc.) species”, Plant Growth Regulation, 35: 59–67 69 Rohini V.K & Sankara Rao K (2001), “Transformation of peanut (Arachis hypogaea L.) with tobacco chitinase gene: variable response of transformants to leaf spot disease”, Plant Sci,160: 889–898 70 Rohini V.K and Rao K S (2000), “Transformation of peanut (Arachis hypogaea L.): A non-tissue culture based approach for generating transgenic plants”, Plant Science, 150:41-49 71 Rudrabhatla Sairam, Siva Chennareddy, Madasamy Parani, Shulu Zhang, Diaa Al-abed, Wissam Abou-Alaiw, and Stephen Goldman (2005), “Obpc symposium: Maize 2004 & beyond – plant regeneration, gene discovery, and genetic engineering of plants for crop improvement”, In Vitro Cell Dev Biol.-Plant, 41:411–423 72 Saini R.S and Jaiwal P.K (2003), “Stable genetic transformation of Vigna mungo (L.) Hepper via Agrobacterium tumefaciens”, Plant Cell Reports, 21:851-859 73 Sarker R.H., Chowdury A.P & Hoque M.I (1997), “Preliminary studies on Agrobacterium-mediated genetic transformation of peanut (Arachis hypogaea L.)”, Bangala J Bot, 26: 155-162 74 Sarker R.H & Nahar M (2003), “Stable expression of GUS (β-glucuronidase) gene following Agrobacterium-mediated transformation of peanut (Arachis hypogaea L.)”, Bangala J Bot, 32(1): 23-31 75 Sharma K.K and Anjaiah V (2000), “An efficient method for the production of transgenic plants of peanut (Arachis hypogaea L.) through Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation”, Plant Science, 159:7-19 76 Sharma K.K and Ortiz R (2000), “Program for the application of genetic transformation for crop improvement in the semi-arid tropics”, In Vitro Cell and Developmental Biology–Plant, 36:83-92 77 Singh S and Hazra S (2009), “Somatic embryogenesis from the axillary meristems of peanut (Arachis hypogea L.)”, Plant Biotechnol Rep, 3:333–340 70 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 78 Swathi Anuradha T., Divya K., Jami S.K., Kirti P.B (2008) “Transgenic tobacco and peanut plants expressing a mustard defensin show resistance to fungal pathogens”, Plant Cell Rep, 27, 1777-1786 79 Swathi Anuradha T., Jami S.K., Datla R.S., Kirti P.B (2006), “Genetic transformation of peanut (Arachis hypogaea L.) using cotyledonary node as explant and a promoterless gus::nptII fusion gene based vector”, J Biosci, 31, 235-246 80 Stefaniak B (1994) “Somatic embryogenesis and plant regeneration of gladiolus (Gladiolus hort)”, Plant Cell Rep, 13: 386–389 81 Tiwari S., Mishra D.K., Singh A., Singh P.K., Tuli R (2008), “Expression of a synthetic cry1EC gene for resistance against Spodoptera litura in transgenic peanut (Arachis hypogaea L.)”, Plant Cell Rep, 27: 1017-1025 82 Venkatachalam P., Kavi Kishor P.B., Geetha N., Thangavelu M & Jayabalan N (1999), “A rapid protocol for somatic embryogenesis from immature leaflets of groundnut (Arachis hypogaea L.)”, - In Vitro Cell Dev Biol Plant, 35: 409-412 83 Venkatachalam P., Kavikishor P.B & jayabalan N (1997), “High frequency somatic embryogenesis and efficient plant regeneration from hypocotyl explants of groundnut”, Curr Sci, 72: 271-275 84 Venkatachalam P., Sankara Rao K., Kavi Kishor P.B & Jayabalan N (1998), “Regeneration of late leaf spot-resistant groundnut plants from Cercosporidium personatum culture filtratetreated callus”, Curr Sci, 74(1): 61-65 85 Venkatachalam P., Geeta N., and Jayabalan N (1998), “Induction of somatic embryos and plantlet development in cell suspension cultures of Arachis hypogaea L‖, Breeding Science, 48:231-236 86 Venkatachalam P.N., Geetha A., Khandelwal M.S., Shaila G & Lakshmi Sita (1999), “Induction of direct somatic embryogenesis and plant regeneration from mature cotyledon explants of Arachis hypogaea L”, Curr Sci, 77: 269–273 87 Venkatachalam P., Geeta N., Khandelwal A., Shaila M.S., and Lakshmi Sita G (2000), “Agrobacterium-mediated genetic transformation and regeneration of transgenic plants from cotyledon explants of groundnut (Arachis hypogaea L.) via somatic embryogenesis”, Current Science, 78:1130-1136 71 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 88 Wetzstein H.Y & Baker C.M (1993), “The relationship between somatic embryo morphology and conversion in peanut (Arachis hypogaea L.)”, Plant Sci, 92: 81-89 72 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... chua l? ??c, việc nghiên cứu phát triển hệ thống tái sinh chuyển gen điều mẻ Từ l? ? trên, chọn đề tài: ? ?Phát triển hệ thống tái sinh in vitro nhằm phục vụ chuyển gen l? ??c (Arachis hypogaea L. )” Mục... not defined.12 1.2.3 Tái sinh 13 1.2.4 Nghiên cứu hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen l? ??c 15 1.2.5 Hệ thống tái sinh chuyển gen gián tiếp l? ??c ……………… 18 Chƣơng II Nguyên liêu phƣơng... NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM PHẠM VIỆT HẢI PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO NHẰM PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY L? ??C (ARACHIS HYPOGAEA L. ) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: