Nghiên cứu giải trình tự vùng gen trong hệ gen ty thể của loài sán lá ruột nhỏ haplorchis taichui phân lập tại việt nam

1 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - NGUYỄN THỊ KHUÊ NGHIÊN CỨU GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG GEN TRONG HỆ GEN TY THỂ CỦA LOÀI SÁN LÁ RUỘT NHỎ HAPLORCHIS TAICHUI PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội – 12/2013 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - Nguyễn Thị Khuê Nghiên cứu giải trình tự vùng gen hệ gen ty thể loài sán ruột nhỏ Haplorchis taichui phân lập Việt Nam Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS LÊ THANH HỊA Viện Cơng nghệ sinh học Hà Nội – 12/2013 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU Sán ruột nhỏ nguyên nhân gây bệnh sán ruột nhỏ (haplorchiasis), bệnh kí sinh trùng lây truyền từ động vật sang người (zoonotic), phát lưu hành phổ biến nhiều nước châu Á, phần châu Phi miền Trung Nam Mỹ Các kết nghiên cứu gần dịch tễ lưu hành, phân bố sán ruột nhỏ Việt Nam, dự án FIBOZOPA Đan Mạch tài trợ, ghi nhận có lưu hành nhiều lồi sán ruột nhỏ, chủ yếu Haplorchis taichui (H taichui), nguyên nhân gây bệnh sán ruột nhỏ người nhiều địa phương nước Sán ruột nhỏ H taichui có nhiều đặc điểm tương đồng hình thái, đặc tính gây bệnh lồi sán ruột nhỏ giống Haplorchis số loài sán gây bệnh khác Đây vấn đề gây nhiều khó khăn cho việc chẩn đốn, giám định, phân biệt loài sán ruột nhỏ H taichui với loài sán ruột nhỏ, dựa phương pháp hình thái học sinh lí học truyền thống Do đó, việc nghiên cứu phát thị đặc trưng loài sán ruột nhỏ H taichui so sánh với loài sán lá, đặc biệt sán ruột nhỏ, nhằm tìm nguồn gốc lây nhiễm, phục vụ công tác giám định, phân loại, chẩn đốn, giúp cho việc áp dụng biện pháp phịng ngừa điều trị hiệu thực cần thiết Phương pháp nghiên cứu di truyền cho phép phân tích biến đổi gen mức độ phân tử, qua đánh giá biến đổi đặc tính di truyền, bổ sung liệu có giá trị khắc phục nhược điểm phương pháp truyền thống việc giám định phân loại sinh vật Trong đó, liệu di truyền hệ gen ty thể sinh vật, sở liệu sử dụng phổ biến cho việc phân tích quan hệ họ hàng phân loại tiến hóa sinh vật, bao gồm loài ký sinh trùng Trên giới, việc sử dụng phần toàn hệ gen ty thể, làm thị phân tử chẩn đốn, giám định nghiên cứu kí sinh trùng sán ruột nhỏ nhiều nước áp dụng Ở Việt Nam, số tác giả áp dụng thị di truyền chẩn đoán, giám định nhiều loài ký sinh trùng như: sán dây Taenia asiatica, sán phổi Paragonimus heterotremus, sán gan lớn Fasciola gigantica Đặc biệt, Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ loài sán ruột nhỏ H taichui lưu hành Việt Nam, số cơng trình bước đầu nghiên cứu sinh học phân tử sử dụng thị gen cox1, ITS-2, 16S 18S, so sánh với gen tương ứng hệ gen ty thể chủng thu nhận từ Ngân hàng gen (GenBank) để chẩn đốn phân loại thẩm định lồi Tuy nhiên, nay, chưa có liệu hệ gen ty thể hoàn chỉnh cho loài sán ruột nhỏ (heterophyid) lây truyền từ động vật sang người nói chung H taichui nói riêng, lưu hành quốc gia giới Việt Nam sở liệu Ngân hàng gen Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, nhằm bổ sung liệu hệ gen ty thể loài sán ruột nhỏ H taichui lưu hành Việt Nam, chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu giải trình tự vùng gen hệ gen ty thể loài sán ruột nhỏ Haplorchis taichui phân lập Việt Nam” - Đối tượng nghiên cứu: Chủng H taichui trưởng thành phân lập người Quảng Trị (Việt Nam) kí hiệu HTAQT - Mục tiêu đề tài: Giải mã phần hệ gen ty thể (chủ yếu gen cox1, 16S RNA ribosome) loài sán ruột nhỏ H taichui – loài sán động vật lây sang người (ĐVLSN) phổ biến (mẫu thu Việt Nam), phân tích so sánh đặc điểm sinh học phân tử với loài sán khác ngành sán dẹt (Platyhelminthes); ứng dụng thị ty thể thu để phát triển phương pháp chẩn đoán giám định loài - Nội dung nghiên cứu: Thu nhận khoảng kb liệu di truyền hệ gen ty thể chứa gen mã hóa protein, gen RNA vận chuyển (tRNA), gen RNA ribosome (rRNA) phân tích trật tự xếp thành phần gen chúng hệ gen ty thể chủng HTAQT Thống kê, phân tích độ dài, trình tự nucleotide nhóm gen Phân tích so sánh trình tự nucleotide amino acid gen đại diện mã hóa cho protein (gen cox1), sán ruột nhỏ H taichui chủng HTAQT với gen tương ứng chủng đại diện lớp sán Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Xác lập phả hệ sử dụng đoạn gen đại diện (đoạn gen cox1) hệ gen ty thể chủng sán ruột nhỏ H taichui nghiên cứu, với chủng đại diện số loài thuộc lớp sán Xác định vị trí xếp trình tự nucleotide cấu trúc bậc (mạch thẳng) gen mã hóa cho protein, cung cấp mô cấu trúc bậc hai gen RNA vận chuyển (tRNA), loài sán ruột nhỏ H taichui chủng HTAQT Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 PHÂN LOẠI VÀ DỊCH TỄ SÁN LÁ RUỘT NHỎ H TAICHUI 1.1.1 Sơ lƣợc phân loại dịch tễ sán ruột nhỏ Sán ruột nhỏ gồm nhiều họ khác thuộc Plagiorchiida (phân Opithorchiata), lớp Trematoda (lớp phụ Digenea), ngành Platyhelminthes, giới Animalia, lưu hành phổ biến nhiều quốc gia giới Trong số 70 loài sán ruột nhỏ biết ký sinh người, có tới 69 lồi sán ruột nhỏ thuộc 11 họ sán ruột nhỏ khác phát ký sinh người, đó: - Họ Heterophyidae có 31 lồi; - Họ Echinostomatidae có 21 lồi; - Họ Leicithodendriidae có lồi; - Họ Plagiorchiidae có lồi; - Ba họ: Diplostomidae, Nanophyetidae Paramphistomatidae, họ có lồi; - Bốn họ: Gastrodiscidae, Gymnophallidae, Microphllidae Strigeidae, họ có lồi phát kí sinh người Đáng ý hai họ Heterophyidae Echinostomatidae, có số lồi phát kí sinh người nhiều lây truyền chủ yếu qua cá (WHO/WR, 2002) Họ Heterophyidae Odhner phát năm 1914, thường ký sinh chim, số lồi động vật có vú người (Chai et al., 2007) Trong họ này, loài giống Haplorchis đặc biệt quan tâm Hiện nay, có lồi thuộc giống Haplorchis thơng báo gây bệnh người, bao gồm: H taichui, H pumilio, H yokogawai, H pleurolophocerca H vanissimus (WHO/WR, 2002) H pumilio, H taichui H yokogawai ba loài gây bệnh haplorchiasis thường xuyên công bố nước châu Á bao gồm: Trung Quốc, Philippin, Thái Lan, Lào, Campuchia Việt Nam (Belizario et al., 2004; Chai et al., 2009; 2010; Dung et al., 2007; Phan et al., 2010) Loài H yokogawai phát ký sinh người Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Philippin, Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc Đài Loan, Katsuta vào năm 1932 H pumilio Loss phát năm 1986, phân bố lưu hành ký sinh người quốc gia: Đài Loan, Trung Quốc, Philippin, Ai Cập, Thái Lan, Australia Việt Nam (De, Le, 2011) 1.1.2 Dịch tễ học sán ruột nhỏ H taichui Sán ruột nhỏ H taichui thuộc giống Haplorchis họ Heterophyidae Nishigori phát lần vào năm 1924, ký sinh người Philippin Cho đến nay, H taichui ghi nhận lưu hành rộng rãi Thái Lan, Lào, Đài Loan, Bangladesh, Ấn Độ, Sri Lanka, Palestin, Ai Cập, I rắc, nam Trung Quốc, Malaysia Việt Nam (Dung et al., 2007; Chai et al., 2004; 2007; 2012; De, Le, 2011) Sán ruột nhỏ H pumilio Loss phát năm 1986, phân bố lưu hành ký sinh người Đài Loan, Trung Quốc, Philippin, Ai Cập, Thái Lan, Australia Việt Nam (De, Le, 2011) Điều tra quốc gia tình hình nhiễm bệnh giun sán Hàn Quốc năm 2004 cho thấy, tỉ lệ nhiễm sán gan nhỏ Clonorchis sinensis sán ruột nhỏ (Heterophyidae) tăng lên so với năm điều tra trước Tổng số người xét nghiệm phân dương tính với sán nhỏ họ Heterophyidae 228.253 người (Kim et al., 2009) Tại Lào, sán ruột nhỏ trưởng thành H taichui phát năm 1991 học sinh trường Czechslovakia (Giboda et al., 1991) Từ đến nay, tình hình nhiễm H taichui Lào ngày phổ biến Năm 2007, tỉnh Savannakhet có 67,1% người nhiễm loài sán gan nhỏ sán ruột nhỏ, nhiễm phối hợp O viverrini loài sán ruột nhỏ khác Trong tổng số 7.693 sán trưởng thành thu nhận, đa số loài H taichui, H pumilio, H yokogawai, Prosthodendrium molenkampi, Phaneropsolus bonnei, Echinostoma spp (Chai et al., 2007) Tại nghiên cứu khác hai tỉnh Lào cho thấy có 65,2% số người xét nghiệm bị nhiễm phối hợp sán gan nhỏ O viverrini với sán ruột nhỏ bao gồm loài H taichui, H pumilio, H yokogawai, Centrocestus caninus, P molenkampi, P bonnie Tiếp đó, năm 2009, nghiên cứu sử dụng phương pháp xét nghiệm phân cho thấy 62,9% người xét nghiệm (97 người) Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ nhiễm loại sán ruột nhỏ, sau điều trị tẩy đãi Sán trưởng thành thu thập bao gồm 76/97 (78,4%) H taichui, tỷ lệ nhiễm với P bonnie 22.7%, P molenkampi (14.4%), H pumilio (5.2%), H yokogawai (3.1%) Echinochasmus japonicus (3.1%) (Sayasone et al., 2009) Trong nghiên cứu Chai cộng năm 2013 Lào, cho thấy người nhiễm sán ruột nhỏ H taichui phổ biến, với tỉ lệ nhiễm cao hai tỉnh Saravane Champasak trung bình l21.565 12.079 sán/người (Chai et al., 2013) Tại Thái Lan có 14 lồi sán ghi nhận, Philippin 12 loài, Indonesia loài Malaysia loài (Waikagul, 1991) Một điều trị tổng quát phía Nam Phillippin cho thấy 36% bệnh nhân có biểu đau vùng bụng heterophyid, chủ yếu H taichui (Liu, 2012) Chính phân bố rộng rãi mà bệnh sán ruột nhỏ ngày chiếm lĩnh quan tâm cộng đồng châu Á, châu Phi Trung Nam Mỹ (Chai et al., 2009; 2010; Dung et al., 2007) H pumilio, H taichui H yokogawai ba loài gây bệnh haplorchiasis thường xuyên công bố nước châu Á bao gồm: Trung Quốc, Philippin, Thái Lan, Lào, Cambodia Việt Nam (Belizario et al., 2004; Chai et al., 2009; 2010; Dung et al., 2007; Phan et al., 2010) Tại Việt Nam, haplorchiasis ghi nhận nhiều loài sán ruột nhỏ Do tập quán ăn gỏi cá nên người bị nhiễm với tỷ lệ cao số vùng đặc hữu Tỉnh Nam Định biết đến vùng đặc hữu với tỷ lệ nhiễm sán truyền qua cá (Fish-borne zoonotic trematodes (FZT)) cao người (64,9%), mèo (70,2%) chó (56,9%) (Dung et al., 2007) Đặc biệt, có trường hợp bệnh nhân phát mang người tới 4.834 sán ruột nhỏ sán gan nhỏ (De, 2004) Chó, mèo lợn bị nhiễm sán lây truyền từ cá với tỷ lệ 13 - 38% (Skov et al., 2009; Dung et al., 2007; Van et al., 2009) Mười tám tỉnh Việt Nam, đặc biệt miền Bắc miền Trung Việt Nam xác định vùng dịch tễ cho sán ruột nhỏ Các khu vực bao gồm vùng cao nguyên cao nguyên miền núi, đồng sông Hồng, vùng đồng ven biển đồng sông Cửu Long (De, Hop, 2006) (Hình 1.1) Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Hình 1.1 Bản đồ phân bố sán ruột nhỏ Việt Nam (Nguyễn Văn Đề cs., 2008) 1.2 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC SÁN LÁ RUỘT NHỎ H TAICHUI 1.2.1 Hình thái, cấu tạo Giống nhiều loài sán ruột nhỏ khác, H taichui trưởng thành có hình dẹt theo hướng lưng bụng hình trụ Kích thước thể dao động từ 0,1120 µm Cơ quan bám đặc trưng giác bám gai bám thường nằm phần trước phần sau mặt bụng Giác miệng nằm phía trước thể có đường kính khoảng 0,06 mm, giác bụng nằm lệch phía bên phải dọc trục thể nối với giác sinh dục tạo thành quan giác bụng - sinh dục Buồng trứng nằm phía trước tinh hoàn, tử cung chứa đầy trứng tạo thành nhiều gấp khúc Tinh hồn lớn, nằm phía (Le et al., 2004) (Hình 1.2A) Trứng H taichui hình oval, vỏ dày, nhẵn, có nắp nhơ lên giống có vai, có mấu nhỏ phía khơng, kích thước (25-28) µm x (12-15) µm (Mishra et al., 2007) (Hình 1.2B) Trong nghiên cứu Nam Định, kích thước H taichui là: (24,2-28) µm x (12,8-16) µm; H pumilio (25,5-31,9) µm x Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 10 (12,8-17,9) µm (De Lellis et al., 2008) Trứng loài sán ruột nhỏ có hình thái kích thước gần giống nhau, kĩ thuật xét nghiệm phân thông thường Kato Kato-Katz (Katz et al., 1972), khơng thể phân biệt trứng lồi sán ruột nhỏ với trứng loài sán khác (Nguyễn Văn Đề Lê Thanh Hòa, 2006) B A Hình 1.2 Sán ruột nhỏ H taichui trưởng thành (A) trứng H taichui (B) (Dung et al., 2007) Ấu trùng (metaceraria) H taichui có hình elip có kích thước (0,19-0,22) x (0,16-0,19) mm, giống bóng chày (Hình 1.3A) Bộ phận sinh dục phần bụng có 11-19 hạt kitin hệ tiết hình bầu dục, gọi túi sinh dục – bụng (ventrogenital) Bộ phận chiếm khoảng không gian lớn nằm phía (Rim et al 1.3B) Hình 1.3 Ấu trùng H taichui (Rim et al., 2008) (A): Ấu trùng H taichui phát cá nước Lào; (B): Hình phóng to túi ventrogenital hình găng tay (mũi tên hình A) Ghi chú: OS (oral sucker): giác miệng, EB (excretory bladder): phận tiết Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ... NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - Nguyễn Thị Khuê Nghiên cứu giải trình tự vùng gen hệ gen ty thể loài sán ruột nhỏ Haplorchis taichui phân lập Việt Nam. .. giải trình tự vùng gen hệ gen ty thể loài sán ruột nhỏ Haplorchis taichui phân lập Việt Nam? ?? - Đối tượng nghiên cứu: Chủng H taichui trưởng thành phân lập người Quảng Trị (Việt Nam) kí hiệu HTAQT... giới Việt Nam sở liệu Ngân hàng gen Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, nhằm bổ sung liệu hệ gen ty thể loài sán ruột nhỏ H taichui lưu hành Việt Nam, tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu giải trình tự vùng