Thẩm định phương pháp hay còn gọi là xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp là công việc luôn cần phải tiến hành trước khi phòng thí nghiệm đưa phương pháp đó vào sử dụng với các mục đích khác nhau, đặc biệt khi dùng cho kiểm nghiệm hoặc nghiên cứu.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC NGHIÊN CỨU THẨM ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU AN TỒN VI SINH ĐĂNG KÝ CƠNG NHẬN ISO 17025 TẠI LABO TRUNG TÂM NĂM 2019 Lê Thị Kim Chung, Tạ Thị Linh, Đặng Quang Tân, Nguyễn Đăng Vững, Vũ Thị Quý, Bùi Thị Minh Hạnh Viện ĐT YHDP&YTCC, Trường Đại học Y Hà Nội Thẩm định phương pháp hay gọi xác nhận giá trị sử dụng phương pháp công việc cần phải tiến hành trước phịng thí nghiệm đưa phương pháp vào sử dụng với mục đích khác nhau, đặc biệt dùng cho kiểm nghiệm nghiên cứu Labo Trung Tâm Viện Đào tạo Y học dự phịng Y tế cơng cộng (PTN) tiến hành thẩm định sáu phương pháp xác định vi sinh vật nước thực phẩm có kết giới hạn phát đạt yêu cầu so với ngưỡng quy chuẩn kỹ thuật quốc gia; độ đặc hiệu, độ nhạy, độ đạt 100 % cho phương pháp định tính Đối với phương pháp định lượng có kết giới hạn định lượng đạt yêu cầu so với ngưỡng quy chuẩn kỹ thuật quốc gia; độ lệch chuẩn lặp lại < 14 %, độ lệch chuẩn tái lặp < 16 % cho phương pháp định lượng Từ khóa: Thẩm định phương pháp; độ đặc hiệu; độ nhạy I ĐẶT VẤN ĐỀ Kiểm soát vệ sinh an toàn thực phẩm việc quan trọng ngành y tế dự phòng Để thực tốt nhiệm vụ ngành an toàn thực phẩm cần phải có phương pháp chuẩn thẩm định kỹ lưỡng Thẩm định phương pháp khẳng định việc kiểm tra cung cấp chứng khách quan chứng minh phương pháp đáp ứng yêu cầu đặt Có thuật ngữ khác định trị phương pháp, đánh giá phương pháp, xác nhận giá trị sử dụng phương pháp, phê duyệt phương pháp cách gọi khác thẩm định phương pháp (method validation) Thẩm định phương pháp xuất phát từ phương pháp tiêu chuẩn phương pháp thử theo tiêu chuẩn quốc gia, quốc tế, hiệp hội khoa học Tác giả liên hệ: Lê Thị Kim Chung, Viện ĐT YHDP &YTCC, Trường Đại học Y Hà Nội Email: lekimchung@hmu.edu.vn Ngày nhận: 04/02/2020 Ngày chấp nhận: 20/03/2020 112 chấp nhận rộng rãi giới Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN), Tổ chức Tiêu chuẩn hóa quốc tế (ISO), Hội Thử nghiệm Vật liệu Mỹ (ASTM), Hiệp hội nhà Hóa phân tích thống (AOAC)… xuất phát từ phương pháp không tiêu chuẩn hay phương pháp nội (non-standard/alternative/in-house method) phương pháp phịng thí nghiệm tự xây dựng, phương pháp theo hướng dẫn nhà sản xuất thết bị, phương pháp theo tạp chí, tài liệu chuyên ngành Theo yêu cầu ISO 17025, phương pháp phân tích phải thẩm định thẩm định lại khi: (1) Phương pháp áp dụng phương pháp tiêu chuẩn; (2) Phương pháp phịng thí nghiệm tự xây dựng trước đưa vào sử dụng thành thường quy; (3) Có thay đổi đối tượng áp dụng nằm đối tượng áp dụng phương pháp thẩm định phương pháp tiêu chuẩn; (4) Có thay đổi điều kiện thực phương pháp thẩm định thiết bị phân tích với đặc tính khác biệt, mẫu phân tích, người TCNCYH 129 (5) - 2020 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC phân tích…).1 Như vậy, kết thẩm định phương pháp đánh giá chất lượng, độ tin cậy kết phân tích thẩm định phương pháp phần khơng thể thiếu muốn có kết phân tích đáng tin cậy Các phương pháp xác định vi sinh vật nước thực phẩm chuyển đổi tiêu chuẩn quốc gia để xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí, Coliforms, E.coli, Salmonella spp nước thực phẩm.2-6 Tuy nhiên, theo yêu cầu (4) ISO 17025 nêu trên, phịng thí nghiệm sử dụng phương pháp cần tiến hành thẩm định phương pháp hệ thống thiết bị, vật tư hóa chất đơn vị để xem có phù hợp để sử dụng phương pháp hay khơng Các hướng dẫn thẩm định phương pháp từ nguồn khác tài liệu nước biên soạn lại, tài liệu tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế ISO, tài liệu hướng dẫn Codex…7-11 Labo Trung tâm xem xét đưa vào áp dụng cho trình thẩm định tiêu an toàn vi sinh vật nước thực phẩm.2-6,12 Nhằm phục vụ công tác xin công nhận phịng thí nghiệm Viện Đào tạo Y học dự phịng Y tế cơng cộng đạt tiêu chuẩn ISO 17025:2017, Labo Trung Tâm tiến hành thẩm định phương pháp cụ thể sau: Đếm khuẩn lạc 30oC kỹ thuật đổ đĩa; Định lượng Coliform kỹ thuật đếm số có xác xuất lớn (MPN); Phát định lượng E.coli giả định kỹ thuật MPN; Định lượng Coliform E.coli phương pháp màng lọc; Phát Salmonella kỹ thuật nuôi cấy khuếch đại chuỗi gen PCR II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng Nền mẫu nghiên cứu: mẫu nước, thịt xay đóng hộp, rau đóng hộp, sữa tiệt trùng, bột ngũ cốc uống liền TCNCYH 129 (5) - 2020 Chủng vi sinh vật bổ sung vào mẫu phân tích bao gồm chủng có nguồn gốc từ bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (VTCC): Salmonella sp VTCC 12271 Salmonella enteritica VTCC 12270 Escherichia coli VTCC 12272 Các thiết bị, vật tư, môi trường nuôi cấy vi sinh Phương pháp Chỉ số nghiên cứu, xử lý số liệu phương pháp định tính¹ Độ nhạy SE TP theo công thức: Độ nhạy tính SE = TP + FN ×100 Độ đặc hiệu SP Độ đặc hiệu tính theo cơng thức: SP = TN TN + FP × 100 Độ xác AC Độ xác tính theo cơng thức: AC = TP + TN N × 100 Trong : TP: Dương tính FP: Dương tính giả TN: Âm tính FN: Âm tính giả Tổng số kết quả: N= TP + FP + FN + TN Giới hạn phát LOD Giới hạn phát tính theo chương trình PODLOD calculation program version (dated 2017-09-23).13 Chỉ số nghiên cứu, xử lý số liệu phương pháp định lượng1 Độ lặp lại : thông qua độ lệch chuẩn tương đối lặp lại RSDr theo công thức 𝑥𝑥𝑖𝑖 = RSDr =√ log + log bi ∑ni=1[( log - log bi )/xi ]2 2n 113 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Trong đó: ai, bi : Các kết phân tích song song cán phân tích xi: Kết trung bình hai lần thí nghiệm song song cán phân tích n: Số kết phân tích song song cán phân tích Độ tái lặp nội phịng thí nghiệm : thơng qua độ lệch chuẩn tương đối tái lặp RSDR theo công thức log + log bi xi = 𝑅𝑅𝑅𝑅𝐷𝐷𝑅𝑅 = √ ∑ni=1[( log - log bi )/xi ]2 2n Trong đó: ai, bi: Các kết phân tích song song hai cán phân tích xi: Kết trung bình hai lần thí nghiệm song song hai cán phân tích n: Số kết phân tích song song hai cán phân tích Giới hạn định lượng LOQ Tính tốn giới hạn định lượng LOQ = 3×LOD Độ khơng đảm bảo đo U Tính tốn độ khơng đảm bảo đo U theo ISO/ TS 19036 :2006 thông qua độ lệch chuẩn lặp lại Sr độ lệch chuẩn tái lặp SR.10 Nội dung, qui trình nghiên cứu Thẩm định phương pháp đếm khuẩn lạc 30oC kỹ thuật đổ đĩa Nghiên cứu giới hạn phát LOD - Nền mẫu (nước): mẫu thử nhiễm chủng nồng độ đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU)/ ml, 10 CFU/ ml, 20 CFU/ ml, 50 CFU/ ml vào 25 ml nước vô trùng x mẫu, mẫu thử nhiễm chủng có nồng độ vi khuẩn nêu - Nền mẫu (thịt xay đóng hộp): mẫu thử nhiễm chủng nồng độ 20 CFU/ g, 100 CFU/ g, 200 CFU/ g, 500 CFU/ g vào 25 g mẫu mẫu thử nhiễm chủng có nồng độ vi khuẩn nêu Nghiên cứu độ lặp lại, độ tái lặp Tiến hành thí nghiệm xử lý số liệu nồng độ 12500 CFU/25g/25ml, lặp lại lần Định lượng Coliform Phát định lượng E.coli giả định kỹ thuật đếm số có xác suất lớn MPN.3,4 Nghiên cứu giới hạn phát LOD - Nền mẫu (nước): mẫu thử nhiễm chủng nồng độ CFU/25 ml, CFU/25 ml, 10 CFU/25 ml, 20 CFU/25 ml, 200 CFU/25 ml vào 25 ml nước vô trùng mẫu thử nhiễm chủng có nồng độ vi khuẩn nêu - Nền mẫu (thịt xay đóng hộp): mẫu thử nhiễm chủng nồng độ 40 CFU/25 g, 50 CFU/25 g, 100 CFU/25 g, 200 CFU/25 g vào 25 g mẫu mẫu thử nhiễm chủng có nồng độ vi khuẩn nêu Nền mẫu (rau đóng hộp): mẫu thử nhiễm chủng nồng độ 40 CFU/25 g, 50 CFU/25 g, 100 CFU/25 g, 200 CFU/25 g vào 25 g mẫu mẫu thử nhiễm chủng để có nồng độ vi khuẩn nêu Nghiên cứu độ lặp lại, độ tái lặp Tiến hành thí nghiệm xử lý số liệu nồng x mẫu, mẫu thử nhiễm chủng có nồng độ vi khuẩn nêu - Nền mẫu (rau đóng hộp): mẫu thử nhiễm chủng nồng độ 20 CFU/ g, 100 CFU/ g, 200 CFU/ g, 500 CFU/ g vào 25 g mẫu x 4, độ 200 CFU/ 25 g/25 ml, lặp lại lần Thẩm định phương pháp định lượng Coliform E.coli màng lọc.5 Nghiên cứu giới hạn phát LOD Nền mẫu nước: mẫu thử nhiễm chủng 114 TCNCYH 129 (5) - 2020 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC nồng độ CFU/100 ml, CFU/100 ml, 10 CFU/100 ml, 20 CFU/100 ml vào 25 ml nước vô trùng x mẫu, mẫu thử nhiễm chủng có nồng độ vi khuẩn nêu Nghiên cứu độ lặp lại, độ tái lặp Tiến hành thí nghiệm xử lý số liệu nồng độ 20 CFU/ 100 ml, lặp lại lần Thẩm định phương pháp phát Salmonella nuôi cấy6 kỹ thuật khuếch đại chuỗi gen PCR.12 Nghiên cứu giới hạn phát LOD có nồng độ vi khuẩn nêu - Nền mẫu (rau đóng hộp): mẫu thử nhiễm chủng nồng độ CFU/25 g vào 25 g mẫu x mẫu, mẫu thử nhiễm chủng có nồng độ vi khuẩn nêu - Nền mẫu (bột ngũ cốc uống liền): mẫu thử nhiễm chủng nồng độ CFU/25 g vào 25 g mẫu x 2, mẫu thử nhiễm chủng có nồng độ vi khuẩn nêu - Nền mẫu (sữa tiệt trùng): mẫu thử nhiễm chủng nồng độ CFU/25 ml vào 25 ml mẫu - Nền mẫu (nước): mẫu thử nhiễm chủng nồng độ CFU/25 ml, CFU/25 ml, CFU/25 ml vào 25 ml nước vô trùng x mẫu, mẫu thử nhiễm chủng có nồng độ vi khuẩn nêu - Nền mẫu (thịt lợn xay đóng hộp): mẫu thử nhiễm chủng nồng độ CFU/25 g, CFU/25 g, CFU/25 g vào 25 g mẫu x mẫu, mẫu thử nhiễm chủng có nồng độ vi khuẩn nêu - Nền mẫu (rau đóng hộp): mẫu thử nhiễm chủng nồng độ CFU/25 g, CFU/25 g, CFU/25 g vào 25 g mẫu x mẫu, mẫu thử nhiễm chủng có nồng độ vi khuẩn nêu Nghiên cứu độ xác AC, độ nhạy SE, độ đặc hiệu SP - Nền mẫu (nước): mẫu thử nhiễm chủng nồng độ CFU/25 ml vào 25 ml nước vô trùng x mẫu, mẫu thử nhiễm chủng có nồng độ vi khuẩn nêu - Nền mẫu (thịt lợn xay đóng hộp): mẫu thử nhiễm chủng nồng độ CFU/25 g vào 25 g mẫu x mẫu, mẫu thử nhiễm chủng x 2, mẫu thử nhiễm chủng có nồng độ vi khuẩn nêu Tương ứng với mẫu bổ sung chủng chuẩn bị trên, chuẩn bị thêm mẫu không nhiễm chủng điều kiện Tiến hành phân tích 10 mẫu chứng dương 10 mẫu chứng âm theo qui trình để tìm độ nhạy, độ đặc hiệu, độ phương pháp Thời gian địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành năm 2019 Labo Trung tâm, Viện Đào tạo Y học dự phòng Y tế công cộng Đạo đức nghiên cứu: Không áp dụng III KẾT QUẢ Thẩm định phương pháp đếm khuẩn lạc 30oC kỹ thuật đổ đĩa Độ lệch chuẩn lặp lại Sr mẫu nước, thịt, rau tương ứng 3,8 %; 2,9% 4,0 % Độ lệch chuẩn tái lặp SR mẫu nước, thịt, rau tương ứng 10,2 %; 8,9% 7,7 % Giới hạn định lượng phương pháp 3,7 CFU/ ml/g Bảng Thẩm định phương pháp đếm khuẩn lạc 30oC kỹ thuật đổ đĩa Kết Thông số đánh giá Sr TCNCYH 129 (5) - 2020 Nền mẫu nước Nền thịt Nền rau 0,038 0,029 0,040 Tiêu chí PTN 0,14 115 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Kết Thơng số đánh giá Tiêu chí PTN Nền mẫu nước Nền thịt Nền rau RSDr 0,039 0,041 0,026 < 0,05 SR 0,102 0,089 0,077 0,16 RSDR 0,059 0,051 0,044 < 0,10 LOD50% (CFU/ ml/g) 0,772 1,222 1,222 1,3 LOQ (CFU/ ml/g) 2,316 3,666 3,666 3,7 U 0,203 0,178 0,153 0,203 Thẩm định phương pháp định lượng Coliform kỹ thuật MPN Bảng Thẩm định phương pháp định lượng Coliform kỹ thuật MPN Kết Thơng số đánh giá Tiêu chí PTN Nền mẫu nước Nền thịt Nền rau Sr 0,033 0,037 0,042 0,14 RSDr 0,032 0,021 0,117 < 0,05 SR 0,070 0,032 0,111 0,16 RSDR 0,080 0,036 0,125 < 0,13 LOD95% (MPN/ml/g) 0,36 0,36 0,36 0,36 LOQ (MPN/ ml/g) 1,08 1,08 1,08 1,08 U 0,167 0,109 0,239 0,239 Độ lệch chuẩn lặp lại Sr mẫu nước, thịt, rau tương ứng 3,3 %; 3,7 % 4,2 % Độ lệch chuẩn tái lặp SR mẫu nước, thịt, rau tương ứng 7,0 %; 3,2 % 11,1 % Giới hạn định lượng phương pháp 1,08 MPN/ml/g Thẩm định phương pháp phát định lượng E.coli giả định kỹ thuật MPN Bảng Phát định lượng E.coli giả định kỹ thuật MPN Kết Thơng số đánh giá Tiêu chí PTN Nền mẫu nước Nền thịt Nền rau Sr 0,038 0,043 0,041 0,14 RSDr 0,107 0,041 0,113 < 0,12 SR 0,098 0,069 0,115 < 0,16 RSDR 0,111 0,077 0,128 < 0,15 LOD95% (MPN/ml/g) 0,36 0,36 0,36 0,36 LOQ (MPN/ ml/g) 1,08 1,08 1,08 1,08 U 0,215 0,163 0,246 0,246 116 TCNCYH 129 (5) - 2020 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Độ lệch chuẩn lặp lại Sr mẫu nước, thịt, rau tương ứng 3,8 %; 4,3 % 4,1 % Độ lệch chuẩn tái lặp SR mẫu nước, thịt, rau tương ứng 9,8 %; 6,9 % 11,5 % Giới hạn định lượng phương pháp 1,08 MPN/ml/g Thẩm định phương pháp định lượng Coliform E.coli màng lọc (Bảng 4) Bảng Thẩm định phương pháp định lượng Coliform E.coli màng lọc Thông số đánh giá Kết Tiêu chí PTN E.coli Coliform Sr 0,043 0,040 0,14 RSDr 0,083 0,060 < 0,10 SR 0,098 0,087 0,16 RSDR 0,076 0,066 < 0,10 LOD50% (CFU/ 100 ml) 0,3 0,3 LOQ (CFU/ 100 ml) 0,9 0,9 0,195 0,175 0,195 U Độ lệch chuẩn lặp lại Sr E.coli coliform tương ứng 4,3 % 4,0 % Độ lệch chuẩn tái lặp SR của E.coli coliform tương ứng 9,8 % 8,7 % Giới hạn định lượng phương pháp < CFU/ 100 ml Thẩm định phương pháp phát Salmonella nuôi cấy PCR (Bảng 5) Bảng Thẩm định phương pháp phát Salmonella nuôi cấy PCR Kết Thông số đánh giá Nền mẫu nước Nền thịt Nền rau Tiêu chí PTN LOD50% (CFU/ 25ml/25g) 0,47 0,45 0,35 90 SE (%) 100 100 100 > 90 SP (%) 100 TT > 90 Độ xác AC, độ nhạy SE, độ đặc hiệu SP mẫu nước, thịt , rau 100 % Giới hạn phát 50 % ba mẫu mức < CFU/ 25 ml/ 25 g IV BÀN LUẬN Trong nghiên cứu cho thấy thơng số thẩm định tiêu hiếu khí mẫu nước, mẫu thịt, mẫu rau bổ sung chủng vi sinh vật đích có kết sàn sàn tiêu chí cơng bố phịng thí nghiệm đạt so với u cầu tiêu chuẩn quốc gia (tiêu TCNCYH 129 (5) - 2020 chuẩn) TCVN 4884-1:2015 (ISO 4833-1:2013)2 tương ứng Các giá trị độ lệch chuẩn lặp lại, độ lệch chuẩn tương đối lặp lại mẫu có xu hướng nhỏ độ lệch chuẩn tái lặp, độ lệch chuẩn tương đối tái lặp tuân theo qui luật chung phù hợp Giới hạn phát 117 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC giới hạn định lượng phương pháp mẫu thịt xay đóng hộp nhỏ nhiều so với ngưỡng quy chuẩn kỹ thuật quốc gia (quy chuẩn) Theo quy chuẩn, mẫu thịt sản phẩm chế biến từ thịt sử dụng trực tiếp khơng cần qua xử lý nhiệt có giới hạn cho phép tổng số vi sinh vật hiếu khí x 105 CFU/ g; E.coli x 101 CFU/g.14 Đối với thông số thẩm định mẫu nước, mẫu thịt, mẫu rau bổ sung chủng vi sinh vật đích tiêu Coliform MPN có bước tăng sinh chọn lọc kiểm tra tính chất sinh vật hóa học để xác định E.coli Các giá trị độ lệch chuẩn lặp lại, độ lệch chuẩn tương đối lặp lại mẫu nhỏ độ lệch chuẩn tái lặp, độ lệch chuẩn tương đối tái lặp theo xu hướng, hợp lý chung Tuy nhiên, độ lệch chuẩn lặp lại, giới hạn phát giới hạn định lượng, thơng số cịn lại mẫu rau có xu hướng cao hai mẫu cịn lại giải thích tính chất vật lý đặc trưng mẫu khả đồng kết sàn sàn tiêu chí cơng bố phịng thí nghiệm đạt so với yêu cầu quy chuẩn tiêu chuẩn tương ứng Tuy nhiên, giới hạn phát giới hạn định lượng, thơng số cịn lại mẫu rau có xu hướng cao hai mẫu cịn lại giải thích tính chất đặc trưng mẫu khả đồng mẫu rau không tối ưu mẫu nước mẫu thịt xay đóng hộp Các giá trị độ lệch chuẩn lặp lại, độ lệch chuẩn tương đối lặp lại mẫu nhỏ độ lệch chuẩn tái lặp, độ lệch chuẩn tương đối tái lặp theo xu hướng, hợp lý chung Ở mẫu thịt, độ lệch chuẩn lặp lại (3,7 %) lớn độ lệch chuẩn tái lặp (3,2 %) khác biệt nghĩ nhiều đến độ ổn định kỹ thuật cán phân tích qui cho khác biệt có ý nghĩa thống kê Các thơng số thẩm định mẫu nước, mẫu thịt, mẫu rau bổ sung chủng vi sinh vật đích tiêu E.coli MPN có kết gần giống với kết tiêu Coliform MPN Điều giải thích kỹ thuật xác định Coliform MPN E.coli MPN tiến hành mẫu, chủng vi sinh vật bổ sung vào mẫu E.coli q trình thí nghiệm có nhiều điểm tương đồng bước chuẩn bị mẫu, xử lý mẫu, bước nuôi cấy ban đầu bước đọc kết quả, khác mẫu không tối ưu mẫu nước mẫu thịt xay đóng hộp Giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp mẫu thịt xay đóng hộp nhỏ nhiều so với ngưỡng quy chuẩn 0,36 MPN/ g cho LOD 1,08 MPN/ g cho LOQ gía trị chuyển đổi sang CFU/ g cho kết tương tự (Theo quy chuẩn, mẫu thịt sản phẩm chế biến từ thịt sử dụng trực tiếp không cần qua xử lý nhiệt có giới hạn cho phép E.coli x 101 CFU/g; ).14 Phương pháp màng lọc cho thấy thông số thẩm định mẫu nước bổ sung chủng vi sinh vật đích có kết tương đồng Điều giải thích Coliform E.coli tiến hành mẫu nước, chủng vi sinh vật bổ sung vào mẫu E.coli q trình thí nghiệm giống hoàn toàn bước ban đầu chuẩn bị mẫu, xử lý mẫu, bước nuôi cấy ban đầu bước đọc kết quả, khác bước kiểm tra tính chất sinh vật hóa học để xác định E.coli bổ sung vào mẫu nước phân tích Giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp E Coli Coliform đạt so với yêu cầu quy chuẩn kỹ thuật quốc gia chất lượng nước sử dụng cho mục đích sinh hoạt (Coliform < 3; E.coli