Tinh chế kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B

Tinh chế kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  NGUYỄN THỊ KIM HIỀN TINH CHẾ KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT VIRUS VIÊM GAN B LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  TINH CHẾ KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT VIRUS VIÊM GAN B LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực PGS TS NGUYỄN LÊ TRANG TS NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN THỊ KIM HIỀN KHÓA: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  PURIFICATION OF HEPATITIS B SURFACE ANTIGEN GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Dr NGUYEN LE TRANG NGUYEN THI KIM HIEN Dr.NGUYEN NGOC HAI TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 LỜI CẢM ƠN Với tất lịng kính trọng, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trƣờng Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, tất quý Thầy Cô truyền đạt kiến thức cho em suốt trình học trƣờng Con xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Lê Trang - ngƣời thầy dạy dỗ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình thực khố luận Viện Pasteur Em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Ngọc Hải hết lòng hƣớng dẫn dạy dỗ, động viên, quan tâm, ủng hộ em hồn thành khố luận Em xin chân thành cảm ơn Th.s Nguyễn Thị Nguyệt Thu, KS Đỗ Thị Châm, KS Võ Thị Mỹ Duyên, CN Lạc Ngọc Thêm, CN Lại Ngọc Diễm, chị Sim phịng Miễn Dịch, Viện Pasteur nhiệt tình giúp đỡ, dạy bảo em nhiều điều suốt thời gian thực khoá luận Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Đốc Viện Pasteur – TpHCM cho phép tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập nghiên cứu Viện Tôi xin cảm ơn bạn lớp CNSH 28 chia xẻ vui buồn thời gian học nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ thời gian thực tập Sinh viên thực Nguyễn Thị Kim Hiền i TÓM TẮT NGUYỄN THỊ KIM HIỀN, Đại Học Nông Lâm Tp.HCM Tháng 7/2006 “TINH CHẾ KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT VIRUS VIÊM GAN B” Hội đồng hƣớng dẫn: PGS.TS NGUYỄN LÊ TRANG TS.NGUYỄN NGỌC HẢI Việt Nam nƣớc có nguy cao nhiễm virus viêm gan Bạn, với tỷ lệ ngƣời mang HBsAg cộng đồng dân chúng từ 15 – 26% Do đó, nguồn kháng nguyên tự nhiên ngƣời bệnh mang HBsAg nhiều Đồng thời, HBsAg kháng nguyên đƣợc sản xuất gấp bội so với loại kháng nguyên khác Mặc khác HBsAg lại đặc hiệu để chẩn đốn bệnh viêm gan B Vì vậy, chúng tơi tiến hành tinh chế kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B để phục vụ cho nhu cầu sản xuất kháng thể để tạo sinh phẩm chuẩn đoán nhƣ dùng làm vaccine phòng bệnh Sau tiến hành đề tài, đạt đƣợc kết sau:  HBsAg đƣợc tinh chế với hoạt tính kháng nguyên HBsAg so với hàm lƣợng protein tổng số 32,35.103 mUI/ OD  Độ tinh khiết sản phẩm 44 lần  HBsAg đƣợc tinh chế tốt, kết đƣợc thể gel điện di: dung dịch HBsAg thu đƣợc có chứa băng có trọng lƣợng phân tử từ 25 – 28 kDa tƣơng ứng với định kháng nguyên HBsAg Đề tài bƣớc quan trọng để tiến hành tạo sinh phẩm chẩn đoán phát virus viêm gan B máu ii MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh sách chữ viết tắt iv Danh sách hình v Danh sách bảng vi PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích – Yêu cầu PHẦN TỔNG QUAN 2.1 Lịch sử phát HBV 2.2 Phân loại HBV 2.3 Hình dạng - Cấu trúc HBV 2.3.1 Hình dạng HBV 2.3.2 Cấu trúc gen HBV 2.4 Quá trình chép nhân lên HBV 2.5 Phƣơng pháp xét nghiệm để phát HBV 10 2.5.1 Phƣơng pháp chẩn đoán huyết học 10 2.5.2 Phƣơng pháp chẩn đoán dựa chức gan 10 2.5.3 Phƣơng pháp chẩn đoán huyết học hoá miễn dịch.10 2.6 Các kiểu lây truyền HBV 12 2.7 Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg) 12 2.7.1 Bản chất HBsAg 12 2.7.2 Tầm quan trọng HBsAg 12 2.7.3 Các phân typ HBsAg 13 2.7.4 Tinh khiết HBsAg 14 2.7.5 Định lƣợng HBsAg 14 iii PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Thời gian địa điểm thực 15 3.2 Vật liệu nghiên cứu 15 3.2.1 Dụng cụ 15 3.2.2 Thiết bị 15 3.2.3 Hoá chất cách chuẩn bị dung dịch 15 3.2.3.1 Hoá chất 15 3.2.3.2 Cách chuẩn bị dung dịch 16 3.3 Bố trí thí nghiệm 20 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 3.4.1 Phƣơng pháp tủa phân đoạn ammonium sulfate 21 3.4.1.1 Nguyên tắc 21 3.4.1.2 Tiến hành 23 3.4.2 Phƣơng pháp tinh chế protein hệ thống gel lọc - cột Sephacryl 300 23 3.4.2.1 Nguyên tắc 23 3.4.2.2 Tiến hành 24 3.4.3 Phƣơng pháp tinh chế protein sắc ký lực - cột Sepharose CL – 4B Dextran sulfate 25 3.4.3.1 Nguyên tắc 25 3.4.3.2 Tiến hành 26 3.4.4 Phƣơng pháp định lƣợng protein đo mật độ quang – OD 280nm 26 3.4.4.1 Nguyên tắc 26 3.4.4.2 Tiến hành 26 3.4.5 Phƣơng pháp điện di SDS - polyacrylamide gel kiểm tra mức độ tinh chế 26 3.4.5.1 Nguyên tắc 26 3.4.5.2 Tiến hành 28 iv 3.4.6 Phƣơng pháp định lƣợng HBsAg 28 3.4.6.1 Khái niệm 28 3.4.6.2 Nguyên tắc hoạt động 28 3.4.6.3 Mục đích 29 3.4.6.4 Xác định kết 29 3.4.6.5 Đánh giá kết thí nghiệm 29 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Kết định lƣợng kháng nguyên HBsAg huyết 30 4.2 Kết giai đoạn tủa phân đoạn ammonium sulfate 30 4.3 Kết tinh chế HBsAg phƣơng pháp sắc ký lọc gel - cột Sephacryl S300 32 4.4 Kết tinh chế HBsAg phƣơng pháp sắc ký lực - cột Sepharose CL – 4B Dextran sulfate 34 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38 5.1 Kết luận 38 5.2 Đề nghị 38 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮC HBV Hepatitis B Virus HBsAg Hepatitis B surface Antigen HBcAg Hepatitis B core Antigen HBeAg Hepatitis B e Antigen kb kilo base kDa kilo Dalton p protein gp glycoprotein DNA Desoxyribose Nucleic Acid RNA Ribose Nucleic Acid TB tế bào KN kháng nguyên ALT Alanine Aminotransfease, SGPT SDS – PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel PEG Polyethylene Glycol DTT Dithiothretol APS Ammonium persulfate TEMED Tetra – methylenediamine OD Optical Density MW Molecular Weight IgG Immunoglobulin G IgM Immunoglobulin M PCR Polymerase Chain Reaction vi DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Các dạng HBV Hình 2.2 Tổ chức genome HBV Hình 2.3 Mơ hình Virus tồn vẹn (virion) Hình 2.4 Lƣợc đồ vịng đời HBV Hình Quá trình chép nhân lên HBV Hinh 3.1 Quá trình thẩm tích 22 Hình 3.2 Sắc ký lọc gel 24 Hình 3.3 Sắc ký lực 25 Hình 3.4 Nguyên tắc hoạt động kit Architect®HBsAg (Abbott) 28 Hình 4.1 Kết điện di SDS – PAGE -15 % sau tủa phân đoạn ammonium sulfate bão hồ 30 Hình 4.2 Đồ thị sắc ký lọc gel thực máy AKTA với cột Sepharyl S 300 32 Hinh 4.3 Kết điện di SDS – PAGE 5- 15 % sau qua cột Sepharyl S 300 33 Hình 4.4 Đồ thị sắc ký lực thực máy AKTA với cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate 35 Hình 4.5 Kết điện di 15% SDS - PAGE DTT sau qua cột S Sepharose CL – 4B Dextran sulfate 36 vii 26 3.4.3.2 Tiến hành Cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate (dung tích cột V = 20 ml), cân cột dung dịch đệm a, tiến hành cho mẫu V = 20 ml (phần dung dịch thu đƣợc giai đoạn 3.4.2.2) qua cột Sau mẫu qua cột hết, cho đệm a qua đến dịch rửa hết protein Tiến hành đẩy phần protein bám khỏi cột dung dịch đệm b Dịch khỏi cột đƣợc thu ml/ đoạn, tốc độ dòng 1ml/ phút, đo mật độ quang OD 280 nm dịch thu đƣợc Tiến hành thu phần bám cột V = 36 ml  Trích phần dung dịch thu đƣợc (V = 36 ml)  pha loãng 105 lần  định lƣợng kiểm tra HBsAg kit miễn dịch kit Architect®HBsAg (Abbott)  Điện di gel 15% SDS – PAGE - DTT  Đo OD 280nm xác định hàm lƣợng protein tổng số 3.4.4 Phƣơng pháp đo mật độ quang OD 280 nm – xác định hàm lƣợng protein tổng số 3.4.4.1 Nguyên tắc [ ] Phân tử protein hấp thụ ánh sáng cực đại bƣớc sóng 280nm Sự hấp thụ có đƣợc chủ yếu amino acid có nhân thơm nhƣ phenylalanine, tryptophan…Tuy nhiên, protein có thành phần số lƣợng amino acid khác nên protein có hệ số tắt (extintion) tƣơng ứng Hệ số tỷ số độ hấp thụ quang bƣớc sóng 280 nm (A280) nồng độ protein 3.4.4.2 Tiến hành Mật độ quang dung dịch đƣợc đo máy quang phổ bƣớc sóng 280 nm 3.4.5 Phƣơng pháp điện di thạch SDS - polyacrylamide gel - kiểm tra mức độ tinh chế 3.4.5.1 Nguyên tắc [ ] [ ] Kỹ thuật điện di dựa tảng phân tử mang điện tích (DNA, RNA, protein…) có khả di chuyển đặt chúng điện trƣờng.Tốc độ di 27 chuyển protein phƣơng pháp điện di dựa vào khác biệt: đặc tính, kích thƣớc lỗ gel, trọng lƣợng phân tử, cƣờng độ điện trƣờng, thời gian điện di, nhiệt độ… Những phân tử có kích thƣớc lớn di chuyển chậm phân tử có kích thƣớc nhỏ qua lỗ gel có kích thƣớc định Các thành phần đƣợc sử dụng để xây dựng nên giá thể đa phân (polymer) là: acrylamide, N, N’- methylene - bis - (acrylamide), tetramethylenediamine (TEMED) ammonium persulfate (APS) Khi tan nƣớc, APS tạo nên gốc tự theo chế: (S2O8)2-  2SO4 Các gốc tự hoạt hoá phân tử acrylamide N, N’- methylene – bis (acrylamide) tạo thành mạng lƣới polymer liên kết chéo phân tử Khi đó, mạng lƣới tạo nên vi lỗ phụ thuộc vào hai thông số: (1) nồng độ acrylamide, ( 2) mức độ liên kết chéo Nếu nồng độ acrylamide cao lỗ tạo nên nhỏ TEMED đƣợc thêm vào nồng độ 0,4% để xúc tác cho việc tạo gel Hệ thống đệm giúp trì pH thùng chứa đệm, gel có vai trị nhƣ chất điện phân cho phép dẫn dòng điện ngang qua điện trƣờng SDS có vai trị làm biến tính protein SDS kết hợp với vùng kị nƣớc protein tách chúng thành tiểu phần, đồng thời làm âm tính hố tiểu phần Ngồi ra, tiểu phần protein gắn kết với liên kết disulfite, liên kết bị bẻ gãy có mặt SDS β-Mercaptoethanol hay DTT tạo thành nhóm – SH Những nhóm sau bị khoá tác nhân alkyl hoá để chống lại tái tạo liên kết disulfite Để tăng hiệu phân tách, ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp điện di không liên tục cách dùng hai hệ gel gồm:  Lớp gel tập trung (lớp trên): có vai trò làm cho đại phân tử tập trung lại vạch xuất phát (bề mặt tiếp xúc hai lớp gel), nồng độ acrylamide thấp  Lớp gel phân tích (lớp dƣới): lớp dùng để phân tách đại phân tử mẫu, nồng độ acrylamide cao 28 3.4.5.2 Tiến hành Chuẩn bị gel polyacrylamide có nồng độ - 15 % với thành phần đuợc ghi phần 3.2.3.2 Lần lƣợt đổ gel theo thứ tự gel phân tích trƣớc, gel tập trung sau Các giếng cho mẫu vào đƣợc tạo cách đặt lƣợc vào lớp gel tập trung Sau gel đặc lại, tiến hành lấy lƣợc ra, lắp gel vào bình điện di, cho dung dịch đệm điện di vào Thực trình điện di, mẫu đƣợc cho vào giếng, tiến hành chạy (I = 50mA, U = 90V), xử lý gel sau điện di cách nhuộm gel với thuốc nhuộm Coomassie khoảng 10 phút Sau đó, tiến hành tẩy cách ngâm gel dung dịch tẩy đến gel trở nên suốt 3.4.1 Phƣơng pháp định lƣợng HBsAg Dùng kit Architect®HBsAg (Abbott) 3.4.1.1 Khái niệm Đây thử nghiệm miễn dịch sử dụng vi hạt phát quang phƣơng pháp hoá học Vi hạt đƣợc gắn với kháng thể HBsAg đơn dòng, dùng để định lƣợng HBsAg huyết hay huyết tƣơng 3.4.1.2 Nguyên tắc hoạt động Cơ chất  phát quang 29 3.4.6.3 Mục đích kit Architect®HBsAg (Abbott)  Chuẩn đốn bệnh viêm gan  Giám sát tình trạng nhiễm bệnh  Chuẩn đốn bệnh cấp tính hay mãn tính 3.4.6.4 Xác định kết 3.4.6.4.1 Bố trí  Chuẩn: – 250 UI/ ml  HBsAg + (1)  HBsAg + (2)  Chứng âm  Mẫu > 250 UI/ ml  pha loãng 1/500 3.4.6.4.2 Xác định kết Dựa vào đƣờng chuẩn 3.4.6.5 Đánh giá kết thí nghiệm  OD < 0,05 UI/ ml: mẫu không phản ứng (HBsAg -)  OD > 0,05 UI/ ml: mẫu phản ứng  Kiểm tra lại: xem độ lặp lại test trung hoà dùng kháng thể HBsAg ngƣời trung hoà: HBsAg (+) 30 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết định lƣợng HBsAg huyết Hoạt tính kháng nguyên HBsAg 1ml dung dịch huyết ban đầu pha loãng 105 lần định lƣợng kit miễn dịch là: 0,573 mUI Vậy hoạt tính kháng nguyên HBsAg 113,5 ml huyết ban đầu là: 0,573 113,5.105 = 6505.103 mUI 4.2 Kết sau giai đoạn tủa phân đoạn ammonium sulfate bão hoà Với mục tiêu tinh chế kháng ngun HBsAg huyết chúng tơi tiến hành loại protein không mong muốn khỏi huyết Do đó, chúng tơi sử dung phƣơng pháp tủa phân đoạn ammonium sulfate nhằm mục đích loại protein albumin huyết Đồng thời để xác định hoạt tính kháng nguyên HBsAg dung dịch sau tủa ammonium sulfate tiến hành định lƣợng miễn dịch dung dịch kit Architect®HBsAg (Abbott) Kết định lƣợng hoạt tính HBsAg 1ml dung dịch sau tủa pha loãng 105 lần là: 1,89 mUI Vậy 15 ml dung dịch sau tủa ammonium sulfate là: 1,89.15.105 = 2830.103 mUI Hình 4.1 Kết điện di SDS – PAGE - 15 % sau tủa phân đoạn ammonium sulfate bão hồ 31 Giếng Mẫu Lƣợng mẫu(µg) Albumin chuẩn 5,3 Huyết HBsAg(+++) 5,1 Dung dịch sau tủa (NH4)2SO4 5,5 Albumin chuẩn 5,3 Huyết HBsAg (+++) 9,75 Dung dịch sau tủa (NH4)2SO4 10,36 Bảng 4.1 Kết sau trình tủa phân đoạn ammonium sulfate bão hoà Giai đoạn V Hoạt tính Hoạt OD OD Hoạt tính/ Độ tinh OD khiết (mUI/OD) (lần) Sau tủa (NH4)2SO4 KN(mUI) tính (%) 113,5 Huyết (ml) 6505.103 100 8830,3 100 0,736.103 15 2830.103 43,5 2058 23 1,37.103 (%) 1,86 (V(ml) : thể tích dung dịch protein thu đƣợc sau giai đoạn.) Nhận xét Dựa vào hình 4.1, ta thấy có khác biệt giếng Giếng 3, dung dịch huyết qua tủa không chứa vạch protein Albumin, giếng 2, dung dịch huyết ban đầu lại chứa vạch protein Albumin.Kết với bảng 4.1 cho thấy:  Giai đoạn tủa phân đoạn ammonium sulfate loại đƣợc phần lớn albumin có huyết  Từ 113,5 ml huyết ban đầu, sau tủa phân đoạn ammonium sulfate thu đƣợc 15 ml dịch chứa HBsAg Vậy thể tích dung dịch protein đƣợc đặc đáng kể  Hoạt tính kháng nguyên HBsAg so với protein tổng số theo giá trị OD tăng từ 0,736.103 lên đến 1,37.103 (mUI/ OD) mức độ tinh khiết giai đoạn 1,86 lần 32 4.3 Kết tinh chế HBsAg phƣơng pháp sắc ký lọc - cột gel Sephacryl S300 Do kháng nguyên HBsAg có trọng lƣợng phân tử lớn 3.106 Da, lớn loại protein huyết với mục tiêu loại protein có trọng lƣợng phân tử nhỏ nên sử dụng gel lọc Sepharryl S300 để loại protein có lƣợng phân tử nhỏ, tập trung protein có trọng lƣợng phân tử lớn Gel lọc Sephacryl S300 có kích thƣớc lỗ 104- 1,5.106Da Do protein có trọng lƣợng phân tử lớn kích thƣớc lỗ gel trƣớc (protein kháng nguyên HBsAg), protein có kích thƣớc nhỏ kích thƣớc lỗ sau đẩy dung dịch đẩy Hình 4.2 Đồ thị sắc ký lọc gel thực máy Explorer với cột Sepharcyl S 300 Kết định lƣợng hoạt tính kháng nguyên HBsAg 1ml dung dịch sau qua gel lọc pha lỗng 105 lần kit Architect®HBsAg (Abbott) là: 1,5 mUI Vậy hoạt tính kháng nguyên 20 ml dung dịch thu đƣợc sau qua gel lọc là: 1,5.20.105 = 3000.103 mUI 33 Hình 4.3 Kết điện di – 15% SDS – PAGE sau qua cột Sephacryl S 300 Giếng 1: Huyết HBsAg (+++) Giếng 2: Huyết sau tủa NH42SO4 Giếng 3: Đoạn A11 (peak A) sau Sephacryl Giếng 4: Đoạn A12 (peak B) sau Sephacryl Giếng 5: Đoạn B8 (peak C) sau Sephacryl S300 Giếng 6: Đoạn B5 (peak D) sau Seephacryl S300 Bảng 4.2 Kết sau trình thực sắc ký lọc gel Sephacryl S 300 OD OD (%) Hoạt tính/ OD (mUI/OD) 100 8830,3 100 0,736.103 2830.103 43,5 2058 23 1,37.103 1,86 3000.103 46 118,26 1,3 25,36.103 34,4 Giai đoạn V (ml) Hoạt tính Hoạt KN(mUI) tính (%) Huyết 113,5 6505.103 (NH4)2SO4 15 Sepharyl 20 Độ tinh khiết (lần) V (ml) l thể tích dung dịch protein thu đƣợc sau giai đoạn 34 Nhận xét Dựa vào kết trình điện di hình 4.3 với sắc ký đồ hình 4.2 chạy 7ml mẫu cho thấy: Ống A11, A12 tƣơng ứng với peak A, B protein có trọng lƣợng phân tử lớn kích thƣớc gel lọc nên trƣớc so với đoạn B8 B5 tƣơng ứng peak C, peak D chứa protein có trọng lƣợng phân tử nhỏ nên sau Do đó, chúng tơi kết luận sau giai đoạn sắc ký lọc gel, chúng tơi đã:  Loại đƣợc protein có trọng lƣợng phân tử nhỏ  Tập trung protein có trọng lƣợng phân tử lớn (peak A v peak B)  Dung dịch thu đƣợc sau qua gel lọc có hàm lƣợng kháng nguyên HBsAg hàm lƣợng protein tổng số (theo giá trị OD) đạt 25,36.103 (mUI/ OD) độ tinh chế giai đoạn đạt 34,4 lần Do đó, chúng tơi dùng dịch protein thu đƣợc peak A B ( V= 20 ml) để tiếp tục tinh chế cho giai đoạn 4.4 Kết tinh chế HBsAg phƣơng pháp sắc ký lực - cột Serpharose CL – 4B dextran sulfate Cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate cột sắc ký lực, cho dung dịch protein có chứa HBsAg qua, cột giữ lại HBsAg cột nhờ có lực với dextran sulfate gắn gel Sau đẩy dung dịch đẩy ta thu đƣợc HBsAg (peak thứ phần bám cột) Dung dịch thu đƣợc (phần bám cột) sau qua cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate sau định lƣợng miễn dịch xác định hàm lƣợng kháng nguyên HBsAg kit Architect®HBsAg (Abbott) chúng tơi thu đƣợc kết quả: Hàm lƣợng kháng nguyên HBsAg 1ml pha loãng 105 lần là: 0,39 mUI Vậy 36 ml dịch thu đƣợc có hàm lƣợng là: 0,39.36.105 = 1404.103 mUI 35 Hình 4.4 Đồ thị sắc ký lực thực máy Explorer với cột Sepharose CL - 4B dextran sulfate Do HBsAg có trọng lƣợng phân tử lớn 3.106 Da nên sử dụng phƣơng pháp điện di 15% SDS – PAGE – DTT, với mục đích sử dụng DTT để cắt phân tử protein có cấu trúc phức tạp dung dịch thu đƣợc sau qua cột (phần bám cột) thành đoạn có cấu trúc đơn giản phân tách đƣợc gel 36 Hình 4.5 Kết điện di 15% SDS - PAGE – DTT sau qua cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate Giếng Mẫu Lƣợng mẫu(µg) Đoạn bám Sepharose dextran sulfate (E14) 21,37 Đoạn bám Sepharose dextran sulfate (E14) 21,37 Đoạn bám Sepharose dextran sulfate (E14) 21,37 Đoạn bám Sepharose dextran sulfate (E14) 21,37 Marker Lysozyme Albumin 5,3 Marker: hãng Invitrogen Vị trí Trọng lƣợng phân tử (kDa) Myosin 250 Phosphorylase 148 Glutamin dehydrogenase 60 Carbonic anhydrase 42 Myoglobin – blue 30 Myoglobin – red 22 Lysozyme 17 Aprotinin Insulin – B chain 37 Bảng 4.3 Kết thu đƣợc sau toàn trình tinh chế HBsAg Giai đoạn V (ml) Hoạt tính KN (mUI) Hoạt tính ( %) OD OD (%) Hoạt tính/ OD (mUI/OD) Huyết 113,5 6505.103 (NH4)2SO4 15 Sephacryl Sepharose CL 4B – dextran sulfate Độ tinh khiết (lần) 100 8830,3 100 0,736.103 2830.103 43,5 2058 23 1,37.103 1,86 20 3000.103 46 118,26 1,3 25,36.103 34,4 36 1406.103 21,6 43,4 0,49 32,35.103 44 Nhận xét Dựa vào kết điện di hình 4.5 với thang chuẩn (marker), rút kết luận: Dung dịch sau qua cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate:  Chứa phân tử protein có trọng lƣợng phân tử từ 25 – 28 kDa, trùng với kết tác giả khác nghiên cứu chạy điện di với HBsAg đƣợc tinh chế  Hàm lƣợng kháng nguyên HBsAg so với hàm lƣợng protein tổng số tăng lên đáng kể 32,35.103 mUI/ OD  Độ tinh chế đạt 44 lần so với ban đầu 38 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua thời gian tƣơng đối ngắn thực đề tài Phịng Miễn Dịch, Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh, với mục tiêu khoá luận “tinh chế kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg)” Với kết thực nghiệm đạt đƣợc trên, đạt số kết sau:  HBsAg đƣợc tinh chế với hoạt tính kháng nguyên HBsAg so với hàm lƣợng protein tổng số 32,35.103 mUI/ OD  HBsAg đƣợc tinh chế với độ tinh chế 44 lần Kết tƣơng đƣơng với kết tinh chế tác giả khác giới  HBsAg đƣợc tinh chế tốt, kết đƣợc thể gel điện di: dung dịch HBsAg thu đƣợc chứa băng có trọng lƣợng phân tử từ 25 – 28 kDa tƣơng ứng với định kháng nguyên HBsAg 5.2 Đề nghị Vì thời gian thực đề tài có hạn, nên chúng tơi tinh chế HBsAg Do đó, chúng tơi có đề nghị sau:  Kiểm tra độ đặc hiệu dịch thu đƣợc phƣơng pháp Western Blot để đánh giá xác kháng nguyên HBsAg  Tiếp tục tinh chế HBsAg với độ tinh chế cao để sử dụng làm kháng nguyên gây miễn dịch súc vật thí nghiệm để thu kháng thể tƣơng ứng  Và tƣơng lai tạo sinh phẩm dùng chẩn đoán phát virus viêm gan B máu 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT TS.BS Trần Hữu Hầu, 2001 Tìm hiểu viêm gan virus B NXB Y học, TpHCM PGS.TS Nguyễn Thanh Bảo, 2004 Virut học ĐH Y Dƣợc TpHCM – Khoa Y Bộ môn Vi Sinh, NXB Y học TpHCM PGS.TSKH Nguyễn Thu Vân, 2002 Viêm gan virut B văcxin dự phòng NXB Y học, Hà Nội Nguyễn Thu Vân, Hồng Thuỷ Ngun Howard A.Fields,1992 Tình trạng nhiễm loại virus viêm gan A, B, C, D nhóm người khác việc nghiên cứu ứng dụng sản xuất vaccine viêm gan B Việt Nam.Tạp chí vệ sinh phòng dịch, tập II, số TIẾNG NƢỚC NGOÀI Terrance G Cooper, 1977 The tools of biochemistry David Freifelder, 1976 Physical biochemistry Pharmacia Fine Chemicals Ion exchance chromatography: Principle and methods Amersham Pharmacia Biotech Affinity chromatography: Principle and methods Melnick J W., 1981 Historical aspects of hepatitis B vaccine (P Maupas and P Guesry, eds) INSERM Symposium No 18, Elsevier/ North – Holland Biomedical Press, Amsterdam 10 Darrel L Peterson, 1981 Isolation and characterization of major protein and glycoprotein of hepatitis B surface antigen Journal of biological chemistry 11 Monica Einarsson, Lennar Kaplan and Govan Utle, 1978 Purification of hepatitis B surface antigen by affinity chromatography 40 12 Lin JY, Hsieh YS, Chu SC The isolation and purification of pre – S2 containing Hepatitis B virus surface Antigen by Chemical Affinity Chromatography Insitute of Biochemistry 13 Amersham Pharmacia Biotech Gel Permeation Chromatography: Principle and Methods INTERNET 14 15 16 17 18 19 20 21 http://www.infekt.ch http://www.dgk.de/web/dgk_content/de/bildarchiv_erreger.htm http://www.socgenmicrobiol.org.uk/JGVDirect/18197/18197ft.htm http://courses.cm.utexas.edu/jrobertus/ch339k/overheads-1.htm http://www virolory-online.com http://www tamm.ebc.ee/~iilves/ hepatiit/hepatiit.html www-micro.msb.le.ac.uk/ 3035/HBV.html http://www.dgk.de/web/dgk_content/de/bildarchiv_erreger.htm ... nƣớc b? ??t… HBsAg kháng nguyên b? ??n vững 2.7.3 Các phân typ HBsAg Kháng nguyên HBsAg có định kháng nguyên đặc hiệu nhóm a hai cặp định kháng nguyên: d y; w r Cả ba định kháng nguyên có mặt ba dạng... HBV  1963: Blumberg phát loại kháng thể phản ứng với loại kháng nguyên mẫu huyết thổ dân Úc b? ?? viêm gan Và đƣợc gọi kháng nguyên Úc Châu (Au)  1967: phát Au, kháng nguyên b? ?? mặt virus gây viêm. .. chuẩn đoán HBV Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên, tiến hành đề tài: ? ?Tinh chế kháng nguyên b? ?? mặt virus viêm gan B? ?? 2 1.2 Mục đích Tinh chế HBsAg tinh khiết từ dung dịch huyết có HBsAg (+ +