OD < 0,05 UI/ ml: mẫu khơng phản ứng (HBsAg -) OD > 0,05 UI/ ml: mẫu phản ứng
Kiểm tra lại: xem độ lặp lại bằng test trung hồ dùng kháng thể HBsAg ngƣời trung hồ: HBsAg (+)
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả định lƣợng HBsAg trong huyết thanh
Hoạt tính kháng nguyên HBsAg trong 1ml dung dịch huyết thanh ban đầu đã pha lỗng 105 lần khi định lƣợng bằng kit miễn dịch là: 0,573 mUI.
Vậy hoạt tính kháng nguyên HBsAg trong 113,5 ml huyết thanh ban đầu là: 0,573. 113,5.105 = 6505.103 mUI.
4.2. Kết quả sau giai đoạn tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate bão hồ
Với mục tiêu tinh chế kháng nguyên HBsAg trong huyết thanh vì vậy chúng tơi tiến hành loại các protein khơng mong muốn ra khỏi huyết thanh. Do đĩ, chúng tơi sử dung phƣơng pháp tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate nhằm mục đích loại protein albumin trong huyết thanh.
Đồng thời để xác định hoạt tính kháng nguyên HBsAg trong dung dịch sau tủa ammonium sulfate chúng tơi tiến hành định lƣợng miễn dịch dung dịch bằng kit Architect®HBsAg (Abbott).
Kết quả định lƣợng hoạt tính HBsAg trong 1ml dung dịch sau tủa đã pha lỗng
105 lần là: 1,89 mUI .
Vậy trong 15 ml dung dịch sau tủa ammonium sulfate là:
1,89.15.105 = 2830.103 mUI
Hình 4.1. Kết quả điện di SDS – PAGE 5 - 15 % sau khi tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate bão hồ
Giếng Mẫu Lƣợng mẫu(µg) 1 Albumin chuẩn 5,3
2 Huyết thanh HBsAg(+++) 5,1 3 Dung dịch sau tủa (NH4)2SO4 5,5 4 Albumin chuẩn 5,3 5 Huyết thanh HBsAg (+++) 9,75 6 Dung dịch sau tủa (NH4)2SO4 10,36
Bảng 4.1. Kết quả sau quá trình tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate bão hồ Giai đoạn V (ml) Hoạt tính KN(mUI) Hoạt tính (%) OD OD (%) Hoạt tính/ OD (mUI/OD) Độ tinh khiết (lần) Huyết thanh 113,5 6505.10 3 100 8830,3 100 0,736.103 Sau tủa (NH4)2SO4 15 2830.10 3 43,5 2058 23 1,37.103 1,86
(V(ml) : là thể tích dung dịch protein thu đƣợc sau mỗi giai đoạn.)
Nhận xét
Dựa vào hình 4.1, ta thấy cĩ sự khác biệt giữa các giếng.
Giếng 3, 6 là dung dịch huyết thanh đã qua tủa khơng chứa vạch protein Albumin, trong khi đĩ giếng 2, 5 là dung dịch huyết thanh ban đầu lại chứa vạch protein Albumin.Kết quả này cùng với bảng 4.1 cho thấy:
Giai đoạn tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate đã loại đƣợc phần lớn
albumin cĩ trong huyết thanh.
Từ 113,5 ml huyết thanh ban đầu, sau khi tủa phân đoạn bằng
ammonium sulfate chỉ thu đƣợc 15 ml dịch chứa HBsAg. Vậy thể tích
dung dịch protein đã đƣợc cơ đặc đáng kể.
Hoạt tính kháng nguyên HBsAg so với protein tổng số theo giá trị OD tăng từ 0,736.103 lên đến 1,37.103 (mUI/ OD) và mức độ tinh khiết giai đoạn này là 1,86 lần.
4.3. Kết quả tinh chế HBsAg bằng phƣơng pháp sắc ký lọc - cột gel Sephacryl S300
Do kháng nguyên HBsAg cĩ trọng lƣợng phân tử khá lớn 3.106 Da, lớn nhất trong các loại protein huyết thanh cùng với mục tiêu loại các protein cĩ trọng lƣợng phân tử nhỏ nên chúng tơi sử dụng gel lọc Sepharryl S300 để loại các protein cĩ trong lƣợng phân tử nhỏ, tập trung các protein cĩ trọng lƣợng phân tử lớn.
Gel lọc Sephacryl S300 cĩ kích thƣớc lỗ 104- 1,5.106Da. Do đĩ những protein cĩ
trọng lƣợng phân tử lớn hơn kích thƣớc lỗ gel sẽ ra trƣớc (protein kháng nguyên HBsAg), những protein cĩ kích thƣớc nhỏ hơn hoặc bằng kích thƣớc lỗ sẽ ra sau khi đẩy bằng dung dịch đẩy.
Hình 4.2. Đồ thị sắc ký lọc gel thực hiện trên máy Explorer với cột Sepharcyl S 300 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả định lƣợng hoạt tính kháng nguyên HBsAg trong 1ml dung dịch sau khi qua gel lọc đã pha lỗng 105 lần bằng kit Architect®HBsAg (Abbott) là: 1,5 mUI.
Vậy hoạt tính kháng nguyên trong 20 ml dung dịch thu đƣợc sau qua gel lọc là: 1,5.20.105 = 3000.103 mUI.
Hình 4.3. Kết quả điện di 5 – 15% SDS – PAGE sau khi qua cột Sephacryl S 300 Giếng 1: Huyết thanh HBsAg (+++)
Giếng 2: Huyết thanh sau tủa NH42SO4 Giếng 3: Đoạn A11 (peak A) sau Sephacryl Giếng 4: Đoạn A12 (peak B) sau Sephacryl Giếng 5: Đoạn B8 (peak C) sau Sephacryl S300 Giếng 6: Đoạn B5 (peak D) sau Seephacryl S300
Bảng 4.2. Kết quả sau quá trình thực hiện sắc ký lọc gel trên Sephacryl S 300
Giai đoạn V (ml) Hoạt tính KN(mUI) Hoạt tính (%) OD OD (%) Hoạt tính/ OD (mUI/OD) Độ tinh khiết (lần) Huyết thanh 113,5 6505.10 3 100 8830,3 100 0,736.103 (NH4)2SO4 15 2830.103 43,5 2058 23 1,37.103 1,86 Sepharyl 20 3000.103 46 118,26 1,3 25,36.103 34,4
Nhận xét
Dựa vào kết quả của quá trình điện di hình 4.3 cùng với sắc ký đồ hình 4.2 khi
chạy 7ml mẫu cho thấy:
Ống A11, A12 tƣơng ứng với các peak A, B là những protein cĩ trọng lƣợng phân tử lớn hơn kích thƣớc gel lọc nên ra trƣớc so với đoạn B8 và B5 tƣơng ứng các peak C, peak D chứa những protein cĩ trọng lƣợng phân tử nhỏ nên ra sau.
Do đĩ, chúng tơi kết luận sau giai đoạn sắc ký lọc gel, chúng tơi đã: Loại đƣợc các protein cĩ trọng lƣợng phân tử nhỏ
Tập trung các protein cĩ trọng lƣợng phân tử lớn (peak A v à peak B).
Dung dịch thu đƣợc sau qua gel lọc cĩ hàm lƣợng kháng nguyên HBsAg trên hàm lƣợng protein tổng số (theo giá trị OD) đạt 25,36.103 (mUI/ OD) và độ tinh chế giai đoạn này đạt 34,4 lần.
Do đĩ, chúng tơi dùng dịch protein thu đƣợc của peak A và B ( V= 20 ml) để tiếp tục tinh chế cho giai đoạn tiếp theo.
4.4. Kết quả tinh chế HBsAg bằng phƣơng pháp sắc ký ái lực - cột Serpharose CL – 4B dextran sulfate CL – 4B dextran sulfate
Cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate là cột sắc ký ái lực, do đĩ khi cho dung dịch protein cĩ chứa HBsAg đi qua, cột sẽ giữ lại HBsAg trên cột nhờ cĩ ái lực với dextran sulfate gắn trên gel. Sau khi đẩy bằng dung dịch đẩy ta sẽ thu đƣợc HBsAg (peak thứ 2 phần bám trên cột).
Dung dịch thu đƣợc (phần bám trên cột) sau khi qua cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate sau khi định lƣợng miễn dịch xác định hàm lƣợng kháng nguyên HBsAg bằng kit Architect®HBsAg (Abbott) chúng tơi thu đƣợc kết quả:
Hàm lƣợng kháng nguyên HBsAg trong 1ml đã pha lỗng 105 lần là:
0,39 mUI.
Hình 4.4. Đồ thị sắc ký ái lực thực hiện trên máy Explorer với cột Sepharose CL - 4B dextran sulfate.
Do HBsAg cĩ trọng lƣợng phân tử lớn 3.106 Da nên chúng tơi đã sử dụng
phƣơng pháp điện di trên 15% SDS – PAGE – DTT, với mục đích sử dụng DTT để cắt phân tử protein cĩ cấu trúc phức tạp trong dung dịch thu đƣợc sau khi qua cột (phần bám trên cột) thành những đoạn cĩ cấu trúc đơn giản cĩ thể phân tách đƣợc trên gel.
Hình 4.5. Kết quả điện di 15% SDS - PAGE – DTT sau khi qua cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate
Giếng Mẫu Lƣợng mẫu(µg) 1 Đoạn bám trên Sepharose dextran sulfate (E14) 21,37 2 Đoạn bám trên Sepharose dextran sulfate (E14) 21,37 3 Đoạn bám trên Sepharose dextran sulfate (E14) 21,37 4 Đoạn bám trên Sepharose dextran sulfate (E14) 21,37 5 Marker 6 Lysozyme 4 Albumin 5,3 Marker: hãng Invitrogen Vị trí Trọng lƣợng phân tử (kDa) 1. Myosin 250 2. Phosphorylase 148 3. Glutamin dehydrogenase 60 4. Carbonic anhydrase 42 5. Myoglobin – blue 30 6. Myoglobin – red 22 7. Lysozyme 17 8. Aprotinin 6 9. Insulin – B chain 4
Bảng 4.3. Kết quả thu đƣợc sau tồn bộ quá trình tinh chế HBsAg Giai đoạn V (ml) Hoạt tính KN (mUI) Hoạt tính ( %) OD OD (%) Hoạt tính/ OD (mUI/OD) Độ tinh khiết (lần) Huyết thanh 113,5 6505.10 3 100 8830,3 100 0,736.103 (NH4)2SO4 15 2830.103 43,5 2058 23 1,37.103 1,86 Sephacryl 20 3000.103 46 118,26 1,3 25,36.103 34,4 Sepharose CL 4B – dextran sulfate 36 1406.103 21,6 43,4 0,49 32,35.103 44 Nhận xét
Dựa vào kết quả điện di hình 4.5 cùng với thang chuẩn (marker), chúng tơi rút ra kết luận:
Dung dịch sau khi qua cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate:
Chứa các phân tử protein cĩ trọng lƣợng phân tử từ 25 – 28 kDa, trùng với các kết quả của các tác giả khác khi nghiên cứu và chạy điện di với HBsAg đã đƣợc tinh chế.
Hàm lƣợng kháng nguyên HBsAg so với hàm lƣợng protein tổng số tăng lên đáng kể 32,35.103
mUI/ OD (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
Qua thời gian tƣơng đối ngắn thực hiện đề tài tại Phịng Miễn Dịch, Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh, với mục tiêu của khố luận là “tinh chế kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg)”. Với các kết quả thực nghiệm đạt đƣợc trên, chúng tơi đạt một số kết quả sau:
HBsAg đã đƣợc tinh chế với hoạt tính kháng nguyên HBsAg so với hàm lƣợng protein tổng số là 32,35.103
mUI/ OD.
HBsAg đƣợc tinh chế với độ tinh chế 44 lần. Kết quả này tƣơng đƣơng với
kết quả tinh chế của các tác giả khác trên thế giới.
HBsAg đƣợc tinh chế khá tốt, kết quả đƣợc thể hiện trên gel điện di: dung dịch HBsAg thu đƣợc chứa các băng cĩ trọng lƣợng phân tử từ 25 – 28 kDa tƣơng ứng với các quyết định kháng nguyên của HBsAg.
5.2. Đề nghị
Vì thời gian thực hiện đề tài cĩ hạn, nên chúng tơi chỉ cĩ thể tinh chế HBsAg. Do đĩ, chúng tơi cĩ đề nghị sau:
Kiểm tra độ đặc hiệu của dịch thu đƣợc bằng phƣơng pháp Western Blot để đánh giá chính xác kháng nguyên HBsAg .
Tiếp tục tinh chế HBsAg với độ tinh chế cao hơn để cĩ thể sử dụng làm kháng nguyên gây miễn dịch trên súc vật thí nghiệm để thu kháng thể tƣơng ứng.
Và trong tƣơng lai tạo bộ sinh phẩm dùng chẩn đốn phát hiện virus viêm gan B trong máu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT .
1. TS.BS Trần Hữu Hầu, 2001. Tìm hiểu viêm gan virus B. NXB Y học, TpHCM.
2. PGS.TS Nguyễn Thanh Bảo, 2004. Virut học. ĐH Y Dƣợc TpHCM – Khoa Y - Bộ mơn Vi Sinh, NXB Y học TpHCM
3. PGS.TSKH Nguyễn Thu Vân, 2002. Viêm gan virut B và văcxin dự phịng. NXB Y học, Hà Nội.
4. Nguyễn Thu Vân, Hồng Thuỷ Nguyên và Howard A.Fields,1992. Tình trạng nhiễm các loại virus viêm gan A, B, C, D trong những nhĩm người khác nhau và việc nghiên cứu ứng dụng sản xuất vaccine viêm gan B ở Việt Nam.Tạp chí vệ sinh phịng dịch, tập II, số 1.
TIẾNG NƢỚC NGỒI
5. Terrance G. Cooper, 1977. The tools of biochemistry. 6. David Freifelder, 1976. Physical biochemistry.
7. Pharmacia Fine Chemicals. Ion exchance chromatography: Principle and methods.
8. Amersham Pharmacia Biotech. Affinity chromatography: Principle and methods.
9. Melnick J. W., 1981. Historical aspects of hepatitis B vaccine. (P. Maupas and P. Guesry, eds). INSERM Symposium No 18, Elsevier/ North – Holland Biomedical Press, Amsterdam.
10.Darrel L. Peterson, 1981. Isolation and characterization of major protein and glycoprotein of hepatitis B surface antigen. Journal of biological chemistry. 11.Monica Einarsson, Lennar Kaplan and Govan Utle, 1978. Purification of
12.Lin JY, Hsieh YS, Chu SC. The isolation and purification of pre – S2 containing Hepatitis B virus surface Antigen by Chemical Affinity Chromatography. Insitute of Biochemistry.
13.Amersham Pharmacia Biotech. Gel Permeation Chromatography: Principle and Methods. INTERNET 14. http://www.infekt.ch 15. http://www.dgk.de/web/dgk_content/de/bildarchiv_erreger.htm 16. http://www.socgenmicrobiol.org.uk/JGVDirect/18197/18197ft.htm 17. http://courses.cm.utexas.edu/jrobertus/ch339k/overheads-1.htm 18. http://www. virolory-online.com 19. http://www. tamm.ebc.ee/~iilves/ hepatiit/hepatiit.html 20. www-micro.msb.le.ac.uk/ 3035/HBV.html 21. http://www.dgk.de/web/dgk_content/de/bildarchiv_erreger.htm