Kỹ thuật miễn dịch đồng vị phĩng xạ (RIA) đã đƣợc sử dụng trƣớc đây để định lƣợng HBsAg trong huyết thanh. Bộ thuốc thử RIA bán trên thị trƣờng cĩ thể xác định đƣợc 2 ng/ml HBsAg thuộc phân typ ad và 6 ng/ml HBsAg thuộc phân typ ay.
Phần lớn các bộ thuốc thử HBsAg do Mỹ điều chế cĩ thể xác định đƣợc hàm lƣợng HBsAg thuộc phân týp ad thấp hơn so với phân typ ay.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện
Thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phịng Miễn Dịch, Khoa sản xuất vaccine và sinh phẩm, Viện Pasteur Tp.HCM.
Thời gian: từ 15/02/2006 - 30/06/06.
3.2. Vật liệu nghiên cứu 3.2.1. Dụng cụ 3.2.1. Dụng cụ
Pipetman và đầu tip các loại, erlen, bercher, eppendorf, ống nhựa 5ml, 15ml…
3.2.2. Thiết bị
Máy quang phổ Spectrophotometer U-3310
Máy ly tâm lạnh MEGAFUGE 1.0 R, Heraeus Instruments.
Máy lọc nƣớc Titertek( Microtutration)
Máy đo pH METTLER TOLEDO MP220
Máy khuấy từ CAT M6/1
Cân phân tích Explorer OHAUS
Máy vortex Minishaker MS1
Bộ điện di SNEW
Máy AKTA Explorer , Amersham Bioscience.
3.2.3. Hố chất và cách chuẩn bị các dung dịch 3.2.3.1. Hố chất Ammonium sulfate (NH4)2SO4 Sodium citrate NaCl NaN3 Glycerin Sephacryl S300
Sepharose CL – 4B – Dexxtran sulfate
N-N’- Methylene- bis- acrylamide Tris base SDS Glycine Coomassie R250 Methanol Acid acetic DTT APS TEMED 3.2.3.2. Cách chuẩn bị các dung dịch Dung dịch (NH4)2SO4 100%S: (NH4)2SO4 767g Thêm vào 1lít nƣớc cất. Bảo quản trong chai nhựa.
Dung dịch đệm a
(Sodiumcitrate 0,027M, NaCl 0,05M, NaN3 0,05%, pH= 7,4) Sodiumcitrate 6,986 g NaCl 2,922 g NaN3 1g
Hồ tan trong 800 ml nƣớc cất, lọc qua giấy lọc
Dùng dung dịch NaOH 1M chỉnh pH = 7,4, thêm nƣớc cất vào đủ 1l dung dịch.
Dung dịch đệm b
(Sodiumcitrate 0,027M, NaCl 0,6M, NaN3 0,05%, pH= 7,4)
Dung dịch đệm c
(Sodiumcitrate 0,027M, NaN3 0,05%, pH= 7,4)
Các dung dịch b, c: cách chuẩn bị tƣơng tự dung dịch a.
Cách chuẩn bị dung dịch cho điện di SDS - PAGE
Dung dịch 40%T:
Acrylamide 38,93 g N- N’- Methylene- bis- acrylamide 1,07 g
Hồ tan vào khoảng 80 ml nƣớc, thêm vào một ít MB1, khuấy từ trong 30 phút.
Cho thêm nƣớc vào đủ 100 ml.
Dung dịch 9,5 % T:
Acrylamide 6,3 g N- N’- Methylene- bis- acrylamide 3,2 g
Tiến hành tƣơng tự dung dịch 40% T.
Dung dịch đệm phân giải (1,5 M Tris):
Tris - base 18,15 g
Hồ vào khoảng 70 ml nƣớc, dùng HCl chỉnh pH = 8,8. Cho thêm nƣớc vào đúng 100 ml, bảo quản ở 40C.
Dung dịch đệm tập trung:
Tris - base 3 g
Hồ vào khoảng 35 ml nƣớc cất, dùng HCl chỉnh pH = 6,8. Thêm nƣớc vào đúng 50 ml, bảo quản ở 40C.
Dung dịch SDS 10 %
SDS: 10 g
Hồ trong 1 lít nƣớc cất, bảo quản nhiệt độ thƣờng.
Đệm bình điện di 4X:
Tris- base 12 g Glycine 57,6 g
Hồ tan vào nƣớc cất và chỉnh đúng 1000 ml, bảo quản ở 40 C.
Dung dịch nhuộm protein :
Coomassie R250 2,5 g
Methanol 600 ml Acid acetic 90 ml
Trộn đều bột màu với hai dung dịch hữu cơ này để hồ tan trƣớc khi cho nƣớc vào và chỉnh đúng 1000 ml. TEMED: 2 µl / ml Dung dịch tẩy: Methanol 50 ml Acid acetic 75 ml Nƣớc cất đủ 1000 ml APS: 100 mg/ ml. Pha trƣớc khi sử dụng 15 µg / 4ml
Bề mặt gel phân giải:
isobutanol
hoặc dung dịch đệm phân giải 0,5 ml dung dịch SDS 10 % 20 µl H2O 1,48 ml Dung dịch xanh – DTT: Glycerol 2 ml SDS 10 % 2,5 ml DTT 15 mg Bromophenol 80 µl Đệm tập trung 2 ml H2O vừa đủ 10 ml
Các thành phần cần thiết cho điện di 15% SDS – PAGE - DTT
Gel phân tích (Running gel)
Dung dịch glycerol 1,5 g
Dung dịch đệm phân giải 1,5 ml
Dung dịch SDS 10% 60 µl
Dung dịch 40% T 2,25 ml
H2O 0,99 ml
TEMED 8 µl
Gel tập trung (Stacking gel) Dung dịch 9,5 % T 2 ml Dung dịch đệm tập trung 1 ml Dung dịch SDS 10 % 40 µl H2O 0,96 ml TEMED 15 µl APS 30 µl
Các thành phần cần thiết cho điện di 5 – 15% SDS – PAGE
Gel phân tích
%T 5% 15%
Dung dịch glycerol (ml) 0,6 0,6
Dung dịch đệm phân giải (ml) 0,75 0,75
Dung dịch SDS 10% (μl) 30 30 Dung dịch 40%T (ml) 0,375 1,125 Nƣớc (ml) 1,245 0,495 TEMED (μl) 8 8 APS (μl) 15 15 Gel tập trung Dung dịch 9,5%T 2ml Dung dịch đệm tập trung 1ml Dung dịch SDS 10% 40μl H2O 0,96 ml TEMED 15μl APS 30μl
Chuẩn bị mẫu: Lấy 1 thể tích mẫu : 1 thể tích xanh glycerol SDS
Xử lý mẫu : đun cách thuỷ trong 10phút
Tiến hành chạy điện di với :
o Cƣờng độ dịng điện I = 50 mA
o Hiệu điện thế U = 90 V
o Thời gian t = 2giờ 30 phút Sau khi chạy điện di, tiến hành nhuộm gel trong dung dịch nhuộm 10 phút
3.3 Bố trí thí nghiệm
Quy trình tổng quát tinh chế HBsAg
Giai đoạn 1 : Thu mẫu
Huyết thanh HBsAg (+++)
Tủa phân đoạn bằng Ammonium sulfate
Định lƣợng miễn dịch HBsAg
Định lƣợng protein Điện di 5 – 15% SDS – PAGE
Tinh chế HBsAg bằng sắc ký lọc - cột gel Sephacryl S300
Tinh chế HBsAg bằng sắc ký ái lực - cột Sepharose CL – 4B Dextran sulfate Định lƣợng miễn dịch HBsAg
Định lƣợng protein Điện di 5 – 15% SDS – PAGE
Định lƣợng miễn dịch HBsAg
Mẫu huyết thanh chứa HBsAg (+ + +) thu từ phịng xét nghiệm của Viện Pasteur Tp.HCM (LAM).
Bảo quản mẫu trong glycerin 10% và NaN3 0,05%, pH= 7,4,ở -200C. Khi tiến hành, thực hiện tan băng ở 40C, ly tâm 3000 vịng/ phút, thu dịch nổi. Phần dịch nổi thu đƣợc bảo quản trong tủ lạnh.
Trích một phần dịch nổi tiến hành pha lỗng 105 lần định lƣợng HBsAg trong mẫu bằng kit miễn dịch kit Architect®HBsAg (Abbott).
Đ o mật độ quang OD 280 nm xác định hàm lƣợng protein tổng số.
Giai đoạn 2: Tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate bão hồ.
Giai đoạn 3: Tinh chế sản phẩm bằng sắc ký lọc - cột gel Sephacryl S300.
Giai đoạn 4: Tinh chế sản phẩm bằng sắc ký ái lực - cột Sepharose CL – 4B -
Dextran sulfate.
Sau mỗi giai đoạn, tiến hành định lƣợng HBsAg trong dịch thu đƣợc bằng kit miễn dịch, đo mật độ quang OD 280 nm xác định hàm lƣợng protein tổng số và điện di trên gel polyacrylamide dung dịch thu đƣợc.
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.1. Phƣơng pháp tủa phân đoạn bằng muối ammonium sulfate 3.4.1.1. Nguyên tắc [ 5 ] [ 17 ]
Đây là phƣơng pháp hay đƣợc sử dụng nhất. Khi các phân tử muối ammonium sulfate ở dạng hồ tan, cĩ rất nhiều phân tử nƣớc bao quanh các phân tử muối này. Mặc khác trong dung dịch, protein đƣợc bao quanh bởi các phân tử nƣớc. Vì vậy, khi các nồng độ muối trong dung dịch gia tăng thì muối sẽ lấy những phân tử nƣớc này do đĩ cĩ ít phân tử nƣớc tƣơng tác với protein. Đến một lúc nào đĩ sẽ khơng đủ nƣớc để duy trì dung dịch protein nên tạo thành tủa.
Tuy nhiên, các protein khác nhau cĩ độ tan khác nhau và khả năng tủa cũng khác nhau theo sự thay đổi của nồng độ muối, lực ion, pH của mơi trƣờng…
V C C V C V C i i 0 0 0
Trong đĩ : C0: nồng độ ammonium sulfate trong dung dịch ban đầu. V0: thể tích dung dịch ban đầu.
Ci: nồng độ ammonium sulfate trong dung dịch lúc sau. Cα: nồng độ dung dịch ammonium sulfate thêm vào. Vα: thể tích dung dịch ammonium sulfate thêm vào.
Thực tế trong hầu hết các trƣờng hợp, hoạt tính enzyme đƣợc tìm thấy khi tủa ở 35% S - 45% S và 45% S - 55% S.
Do đĩ, chúng tơi tiến hành tủa huyết tƣơng qua 2 giai đoạn : 30% S
50%S.
Hai ƣu điểm của tủa bằng muối ammonium sulfate Cĩ thể loại đến 75% protein thơ.
Dung dịch protein đƣợc cơ đặc.
Để hồ tan protein, cách tốt nhất và đơn giản nhất là làm giảm nồng độ muối trong tủa. Để tránh pha lỗng mẫu, cơng việc cĩ thể tiến hành bằng bao thẩm tích.
Đây là loại bao làm bằng vật liệu polymer, trên bao chứa những vi lỗ cho phép sự khuếch tán xảy ra đối với các phân tử cĩ kích thƣớc nhỏ. Các phân tử protein cĩ kích thƣớc lớn hơn lỗ sẽ khơng thấm đƣợc qua màng nên đƣợc giữ lại trong bao. Nồng độ muối trong bao thẩm tích giảm dần đến khi đạt mức cân bằng giữa trong và ngồi màng thẩm tích.
(http://courses.cm.utexas.edu/jrobertus/ch339k/overheads-1.htm) Hình 3.1. Quá trình thẩm tích
Từ 113,5 ml dịch nổi thu đƣợc sau khi ly tâm ở giai đoạn 1, tiến hành tủa bằng
dung dịch muối ammonium sulfate 100% bão hồ. Nhỏ từ từ 49 ml ammonium sulfate trong điều kiện lạnh, sau đĩ bảo quản ở 4oC trong 24h, lúc này, dung dịch đạt nồng độ cuối là 30% bão hồ, ly tâm thu đƣợc 144 ml dịch nổi.
Sau đĩ, tiếp tục tủa 144 ml dịch nổi với 57,6 ml ammonium sulfate 100% bão
hồ để dung dịch đạt nồng độ 50% bão hồ. Ly tâm thu tủa, rửa tủa nhiều lần bằng ammonium sulfate 50% bão hồ để tủa trắng hồn tồn, thu đƣợc 8 ml tủa
Thẩm tích tủa trong đệm PBS 1X, NaN3 0,05%, pH = 7, tủa tan, ly tâm 3000 vịng / phút, thu 15 ml dung dịch protein.
Từ 15 ml dịch protein thu đƣợc Tiến hành định lƣợng HBsAg
Trích một phần trong dịch thu đƣợc pha lỗng 105 lần trong đệm định lƣợng miễn dịch bằng kit Architect®HBsAg (Abbott).
Đo mật độ quang OD 280 nm của dịch thu đƣợc bằng máy quang phổ ở bƣớc sĩng 280 nm xác định hàm lƣợng protein tổng số.
3.4.2. Phƣơng pháp tinh chế dung dịch protein bằng hệ thống gel lọc - cột Sephacryl S300
3.4.2.1. Nguyên tắc [ 5] [ 13 ]
Là phƣơng pháp dùng để phân tách các phân tử cĩ kích thƣớc, trọng lƣợng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel.
Sắc ký lọc dùng những vật liệu là những vi hạt gel cĩ khả năng ngậm nƣớc rất cao. Các hạt gel này là những sợi polymer (polyside, polyacrylamide…) dài, cĩ những cầu nối liên kết ngang để làm giảm bớt độ mềm, chịu đƣợc sức ép khi bị nén mà khơng bị biến dạng, vẫn cho phép dung mơi lƣu thơng.
Trên bề mặt cũng nhƣ phía trong các hạt gel, kích thƣớc của các kẽ khơng gian trống giữa các sợi polymer cho phép các phân tử tan trong dung mơi cĩ thể thấm vào khơng gian trong hạt gel và do đĩ cĩ thể di chuyển quanh co trong cấu trúc của hạt gel.
Hình 3.2. Sắc ký lọc gel
(http://courses.cm.utexas.edu/jrobertus/ch339k/overheads-1.htm)
Khi cho hỗn hợp chứa những phân tử cĩ kích thƣớc khác nhau qua cột sắc ký, chứa những lỗ cĩ kích thƣớc giới hạn nhất định thì các phân tử cĩ kích thƣớc lớn hơn khơng khuếch tán qua lỗ. Do đĩ, chúng sẽ ra khỏi cột trƣớc. Những phân tử nhỏ khuếch tán vào trong lỗ gel và di chuyển trong lỗ gel. Sau đĩ, chúng sẽ đƣợc đẩy ra khỏi cột bằng một dung dịch đẩy.
Sepharyl S 300: là gel agarose, cĩ khả năng phân tách những protein cĩ kích thƣớc từ 104 – 1,5.106Da.
Vì vậy khi cho dung dịch chứa HBsAg qua cột, những phân tử lớn sẽ ra khỏi cột trƣớc. Những phân tử cĩ trọng lƣợng phân tử nhỏ hơn sẽ đi vào trong gel nên ra sau.
3.4.2.2. Tiến hành
Cột gel Sephacryl S300 (dung tích cột V = 180 ml (gel)), rửa cột bằng dung dịch đệm a. Từ 15 ml dịch nổi thu đƣợc ở giai đoạn 3.4.1.2 chúng tơi tiến hành cho qua cột. Khi mẫu qua cột hết, tiến hành rửa cột bằng đệm a đến khi dịch rửa đi ra hết protein (kiểm tra bằng phƣơng pháp Bradford). Cho dung dịch đệm b qua cột để đẩy phần protein bám trên cột ra.
Dịch ra khỏi cột đƣợc đo mật độ quang OD 280 nm để đo hàm lƣợng protein tổng số và thể hiện độ hấp thu dƣới dạng sắc ký đồ, dịch đƣợc thu tự động bằng máy thu, mỗi phân đoạn 5ml, tốc độ dịng 2ml/ phút.
Dựa trên sắc ký đồ hình 4.2
Tiến hành thu các phân đoạn thuộc peak A (ống A11) và ống A10 đƣợc
V = 20 ml.
Trích một phần trong dung dịch thu đƣợc (V= 20ml) pha lỗng 105 lần
định lƣợng kiểm tra hoạt tính HBsAg bằng kit miễn dịch kit Architect®HBsAg (Abbott)
Điện di trên SDS – PAGE 5 – 15% các peak A (ống A11), peak B (ống A12), peak C (ống B8), peak D (ống B5) thu đƣợc.
3.4.3. Phƣơng pháp tinh chế dung dịch protein bằng sắc ký ái lực- cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate
3.4.3.1. Nguyên tắc [ 5 ] [ 8 ]
Trong phƣơng pháp này các chất mang trên cột chứa các nhĩm hố học cĩ ái lực đặc biệt với sản phẩm. Vì vậy khi cho một hỗn hợp các chất trong đĩ cĩ chứa sản phẩm đi qua cột, sản phẩm mục tiêu đƣợc gắn một cách chuyên biệt vào chất mang và tất cả các thành phần khác khơng cĩ ái lực với chất mang sẽ đi qua cột nhờ một đệm rửa. Sau đĩ, sản phẩm sẽ đƣợc thu nhờ dung dịch đẩy.
Hình 3.3. Sắc ký ái lực
3.4.3.2. Tiến hành
Cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate (dung tích cột V = 20 ml), cân bằng cột bằng dung dịch đệm a, tiến hành cho mẫu V = 20 ml (phần dung dịch thu đƣợc ở giai đoạn 3.4.2.2) qua cột
Sau khi mẫu qua cột hết, cho đệm a qua đến khi dịch rửa đã hết protein. Tiến hành đẩy phần protein bám ra khỏi cột bằng dung dịch đệm b.
Dịch ra khỏi cột đƣợc thu 2 ml/ đoạn, tốc độ dịng 1ml/ phút, đo mật độ quang OD 280 nm của dịch thu đƣợc.
Tiến hành thu phần bám trên cột V = 36 ml
Trích một phần trong dung dịch thu đƣợc (V = 36 ml) pha lỗng 105 lần định lƣợng kiểm tra HBsAg bằng kit miễn dịch kit Architect®HBsAg (Abbott).
Điện di trên gel 15% SDS – PAGE - DTT .
Đo OD 280nm xác định hàm lƣợng protein tổng số
3.4.4. Phƣơng pháp đo mật độ quang OD 280 nm – xác định hàm lƣợng protein tổng số
3.4.4.1. Nguyên tắc [ 5 ]
Phân tử protein hấp thụ ánh sáng cực đại ở bƣớc sĩng 280nm. Sự hấp thụ này cĩ đƣợc chủ yếu là do các amino acid cĩ nhân thơm nhƣ phenylalanine, tryptophan…Tuy nhiên, mỗi protein sẽ cĩ thành phần và số lƣợng các amino acid khác nhau nên mỗi protein sẽ cĩ một hệ số tắt (extintion) tƣơng ứng. Hệ số này là tỷ số giữa độ hấp thụ quang ở bƣớc sĩng 280 nm (A280) trên nồng độ protein.
3.4.4.2 Tiến hành
Mật độ quang của dung dịch đƣợc đo bằng máy quang phổ ở bƣớc sĩng 280 nm.
3.4.5. Phƣơng pháp điện di trên thạch SDS - polyacrylamide gel - kiểm tra mức độ tinh chế
3.4.5.1. Nguyên tắc [ 5 ] [ 6 ]
Kỹ thuật điện di dựa trên nền tảng các phân tử mang điện tích (DNA, RNA, protein…) cĩ khả năng di chuyển khi đặt chúng trong một điện trƣờng.Tốc độ di
chuyển của một protein trong phƣơng pháp điện di dựa vào sự khác biệt: đặc tính, kích thƣớc lỗ gel, trọng lƣợng phân tử, cƣờng độ điện trƣờng, thời gian điện di, nhiệt độ…
Những phân tử cĩ kích thƣớc lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử cĩ kích thƣớc nhỏ khi đi qua một lỗ gel cĩ kích thƣớc nhất định.
Các thành phần đƣợc sử dụng để xây dựng nên giá thể đa phân (polymer) là: acrylamide, N, N’- methylene - bis - (acrylamide), tetramethylenediamine (TEMED) và ammonium persulfate (APS)
Khi tan trong nƣớc, APS tạo nên các gốc tự do theo cơ chế: (S2O8)2- 2SO4
Các gốc tự do này hoạt hố các phân tử acrylamide và N, N’- methylene – bis (acrylamide) tạo thành mạng lƣới polymer liên kết chéo giữa các phân tử này. Khi đĩ, trong mạng lƣới sẽ tạo nên các vi lỗ phụ thuộc vào hai thơng số: (1) nồng độ acrylamide, ( 2) mức độ liên kết chéo.
Nếu nồng độ acrylamide càng cao thì lỗ tạo nên càng nhỏ. TEMED đƣợc thêm vào ở nồng độ 0,4% để xúc tác cho việc tạo gel. Hệ thống đệm giúp duy trì pH trong thùng chứa đệm, trong gel và cĩ vai trị nhƣ một chất điện phân cho phép dẫn dịng điện ngang qua điện trƣờng..SDS cĩ vai trị làm biến tính protein do SDS kết hợp với vùng kị nƣớc của protein và tách chúng thành các tiểu phần, đồng thời làm âm tính hố các tiểu phần này.
Ngồi ra, nếu các tiểu phần của protein gắn kết với nhau bằng các liên kết