(ml) Hoạt tính KN(mUI) Hoạt tính (%) OD OD (%) Hoạt tính/ OD (mUI/OD) Độ tinh khiết (lần) Huyết thanh 113,5 6505.10 3 100 8830,3 100 0,736.103 Sau tủa (NH4)2SO4 15 2830.10 3 43,5 2058 23 1,37.103 1,86
(V(ml) : là thể tích dung dịch protein thu đƣợc sau mỗi giai đoạn.)
Nhận xét
Dựa vào hình 4.1, ta thấy cĩ sự khác biệt giữa các giếng.
Giếng 3, 6 là dung dịch huyết thanh đã qua tủa khơng chứa vạch protein Albumin, trong khi đĩ giếng 2, 5 là dung dịch huyết thanh ban đầu lại chứa vạch protein Albumin.Kết quả này cùng với bảng 4.1 cho thấy:
Giai đoạn tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate đã loại đƣợc phần lớn
albumin cĩ trong huyết thanh.
Từ 113,5 ml huyết thanh ban đầu, sau khi tủa phân đoạn bằng
ammonium sulfate chỉ thu đƣợc 15 ml dịch chứa HBsAg. Vậy thể tích
dung dịch protein đã đƣợc cơ đặc đáng kể.
Hoạt tính kháng nguyên HBsAg so với protein tổng số theo giá trị OD tăng từ 0,736.103 lên đến 1,37.103 (mUI/ OD) và mức độ tinh khiết giai đoạn này là 1,86 lần.
4.3. Kết quả tinh chế HBsAg bằng phƣơng pháp sắc ký lọc - cột gel Sephacryl S300
Do kháng nguyên HBsAg cĩ trọng lƣợng phân tử khá lớn 3.106 Da, lớn nhất trong các loại protein huyết thanh cùng với mục tiêu loại các protein cĩ trọng lƣợng phân tử nhỏ nên chúng tơi sử dụng gel lọc Sepharryl S300 để loại các protein cĩ trong lƣợng phân tử nhỏ, tập trung các protein cĩ trọng lƣợng phân tử lớn.
Gel lọc Sephacryl S300 cĩ kích thƣớc lỗ 104- 1,5.106Da. Do đĩ những protein cĩ
trọng lƣợng phân tử lớn hơn kích thƣớc lỗ gel sẽ ra trƣớc (protein kháng nguyên HBsAg), những protein cĩ kích thƣớc nhỏ hơn hoặc bằng kích thƣớc lỗ sẽ ra sau khi đẩy bằng dung dịch đẩy.
Hình 4.2. Đồ thị sắc ký lọc gel thực hiện trên máy Explorer với cột Sepharcyl S 300
Kết quả định lƣợng hoạt tính kháng nguyên HBsAg trong 1ml dung dịch sau khi qua gel lọc đã pha lỗng 105 lần bằng kit Architect®HBsAg (Abbott) là: 1,5 mUI.
Vậy hoạt tính kháng nguyên trong 20 ml dung dịch thu đƣợc sau qua gel lọc là: 1,5.20.105 = 3000.103 mUI.
Hình 4.3. Kết quả điện di 5 – 15% SDS – PAGE sau khi qua cột Sephacryl S 300 Giếng 1: Huyết thanh HBsAg (+++)
Giếng 2: Huyết thanh sau tủa NH42SO4 Giếng 3: Đoạn A11 (peak A) sau Sephacryl Giếng 4: Đoạn A12 (peak B) sau Sephacryl Giếng 5: Đoạn B8 (peak C) sau Sephacryl S300 Giếng 6: Đoạn B5 (peak D) sau Seephacryl S300
Bảng 4.2. Kết quả sau quá trình thực hiện sắc ký lọc gel trên Sephacryl S 300
Giai đoạn V (ml) Hoạt tính KN(mUI) Hoạt tính (%) OD OD (%) Hoạt tính/ OD (mUI/OD) Độ tinh khiết (lần) Huyết thanh 113,5 6505.10 3 100 8830,3 100 0,736.103 (NH4)2SO4 15 2830.103 43,5 2058 23 1,37.103 1,86 Sepharyl 20 3000.103 46 118,26 1,3 25,36.103 34,4
Nhận xét
Dựa vào kết quả của quá trình điện di hình 4.3 cùng với sắc ký đồ hình 4.2 khi
chạy 7ml mẫu cho thấy:
Ống A11, A12 tƣơng ứng với các peak A, B là những protein cĩ trọng lƣợng phân tử lớn hơn kích thƣớc gel lọc nên ra trƣớc so với đoạn B8 và B5 tƣơng ứng các peak C, peak D chứa những protein cĩ trọng lƣợng phân tử nhỏ nên ra sau.
Do đĩ, chúng tơi kết luận sau giai đoạn sắc ký lọc gel, chúng tơi đã: Loại đƣợc các protein cĩ trọng lƣợng phân tử nhỏ
Tập trung các protein cĩ trọng lƣợng phân tử lớn (peak A v à peak B).
Dung dịch thu đƣợc sau qua gel lọc cĩ hàm lƣợng kháng nguyên HBsAg trên hàm lƣợng protein tổng số (theo giá trị OD) đạt 25,36.103 (mUI/ OD) và độ tinh chế giai đoạn này đạt 34,4 lần.
Do đĩ, chúng tơi dùng dịch protein thu đƣợc của peak A và B ( V= 20 ml) để tiếp tục tinh chế cho giai đoạn tiếp theo.
4.4. Kết quả tinh chế HBsAg bằng phƣơng pháp sắc ký ái lực - cột Serpharose CL – 4B dextran sulfate CL – 4B dextran sulfate (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate là cột sắc ký ái lực, do đĩ khi cho dung dịch protein cĩ chứa HBsAg đi qua, cột sẽ giữ lại HBsAg trên cột nhờ cĩ ái lực với dextran sulfate gắn trên gel. Sau khi đẩy bằng dung dịch đẩy ta sẽ thu đƣợc HBsAg (peak thứ 2 phần bám trên cột).
Dung dịch thu đƣợc (phần bám trên cột) sau khi qua cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate sau khi định lƣợng miễn dịch xác định hàm lƣợng kháng nguyên HBsAg bằng kit Architect®HBsAg (Abbott) chúng tơi thu đƣợc kết quả:
Hàm lƣợng kháng nguyên HBsAg trong 1ml đã pha lỗng 105 lần là:
0,39 mUI.
Hình 4.4. Đồ thị sắc ký ái lực thực hiện trên máy Explorer với cột Sepharose CL - 4B dextran sulfate.
Do HBsAg cĩ trọng lƣợng phân tử lớn 3.106 Da nên chúng tơi đã sử dụng
phƣơng pháp điện di trên 15% SDS – PAGE – DTT, với mục đích sử dụng DTT để cắt phân tử protein cĩ cấu trúc phức tạp trong dung dịch thu đƣợc sau khi qua cột (phần bám trên cột) thành những đoạn cĩ cấu trúc đơn giản cĩ thể phân tách đƣợc trên gel.
Hình 4.5. Kết quả điện di 15% SDS - PAGE – DTT sau khi qua cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate
Giếng Mẫu Lƣợng mẫu(µg) 1 Đoạn bám trên Sepharose dextran sulfate (E14) 21,37 2 Đoạn bám trên Sepharose dextran sulfate (E14) 21,37 3 Đoạn bám trên Sepharose dextran sulfate (E14) 21,37 4 Đoạn bám trên Sepharose dextran sulfate (E14) 21,37 5 Marker 6 Lysozyme 4 Albumin 5,3 Marker: hãng Invitrogen Vị trí Trọng lƣợng phân tử (kDa) 1. Myosin 250 2. Phosphorylase 148 3. Glutamin dehydrogenase 60 4. Carbonic anhydrase 42 5. Myoglobin – blue 30 6. Myoglobin – red 22 7. Lysozyme 17 8. Aprotinin 6 9. Insulin – B chain 4
Bảng 4.3. Kết quả thu đƣợc sau tồn bộ quá trình tinh chế HBsAg Giai đoạn V