Đánh giá tình trạng nhiễm tomato spotied wilt virus trên cà chua tại tỉnh Tiền Giang

Đánh giá tình trạng nhiễm tomato spotied wilt virus trên cà chua tại tỉnh Tiền Giang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÀ CHUA TẠI TỈNH TIỀN GIANG BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TOMATO SPOTTED WILT VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT – PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HỒNG PHƢỚC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÀ CHUA TẠI TỈNH TIỀN GIANG BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TOMATO SPOTTED WILT VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT – PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN NGUYỄN HỒNG PHƢỚC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY EVALUATION ON THE STATUS QUO OF TOMATO SPOTTED WILT VIRUS AFFECTING TOMATO PLANT IN TIEN GIANG PROVINCE BY ELISA AND FORMULATING THE RT – PCR PROCESS TO DIAGNOSE TOMATO SPOTTED WILT VIRUS Graduation thesis Major: Biotechnology Professor: Student: BUI CACH TUYEN NGUYEN HONG PHUOC Term: 2003 – 2007 HCMC, 9/2007 iv LỜI CẢM TẠ  Em xin chân thành cảm tạ: PGS.TS. Bùi Cách Tuyến đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu giúp em hoàn thành khóa luận. Ban Giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh, Ban Chủ nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận này. Ban Giám đốc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh và toàn thể Anh Chị đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp em hoàn thành tốt khóa luận. TS. Lê Đình Đôn cùng quý Thầy – Cô trong và ngoài trƣờng đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và làm khóa luận.  Em xin cám ơn chị Dƣơng, chị Hƣng, chị Hạnh, anh Lẫm, anh Trƣờng, anh Vũ đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.  Cảm ơn tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học K29 niên khóa 2003 – 2007, đã luôn gắn bó, chia sẻ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện khóa luận.  Con vô cùng biết ơn cha mẹ đã dạy bảo, nuôi dƣỡng con đƣợc nhƣ ngày hôm nay, cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2007. Sinh viên Nguyễn Hồng Phƣớc v TÓM TẮT KHÓA LUẬN  Nguyễn Hồng Phƣớc, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 9 năm 2007, “Đánh giá tình trạng nhiễm Tomato Spotted Wilt Virus trên cà chua bằng kỹ thuật ELISA và xây dựng quy trình chẩn đoán Tomato Spotted Wilt Virus bằng kỹ thuật RT – PCR” đƣợc thực hiện từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2007 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh thuộc Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trƣờng (RIBET), Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.  Nội dung thực hiện: Thu mẫu có triệu chứng nhiễm TSWV tại xã Bình Ninh và xã Hòa Định huyện Chợ Gạo, xã Bình Nhì và xã Thạnh Nhật thuộc thị xã Gò Công. Xác định tỉ lệ nhiễm TSWV trên cà chua tại các xã Bình Ninh, Hòa Định, Bình Nhì, Thạnh Nhật thuộc tỉnh Tiền Giang bằng kỹ thuật DAS – ELISA. Mẫu biểu hiện dƣơng tính mạnh đƣợc chọn để thực hiện phản ứng RT – PCR. Từ đó tìm ra quy trình RT – PCR chẩn đoán bệnh TSWV.  Kết quả đạt đƣợc: 1. Xác định tỷ lệ nhiễm TSWV tại các địa bàn nhƣ sau: Huyện Chợ Gạo Xã Hòa Định 12,0 % Xã Bình Ninh 13,16 % Thị xã Gò Công Xã Bình Nhì 14,29 % Xã Thạnh Nhật 10,0 % 2. Bƣớc đầu tìm đƣợc quy trình RT – PCR một bƣớc để chẩn đoán bệnh TSWV. vi SUMMARY  This is Nguyen Hong Phuoc studying at Nong Lam University and finishing the thesis on 9th 2007. The thesis entiled “Evaluation on the status quo of Tomato Spotted Wilt Virus affecting tomato plant in Tien Giang province by ELISA and formulating the RT – PCR process to diagnose Tomato Spotted Wilt Virus” This research was conducted from 3th, 2007 to 8th, 2007 in the laboratory of biotechnology and chemistry of Nong Lam University.  The contents of this are as follows: Collecting the samples with Tomato Spotted Wilt Virus symptoms in Binh Ninh and Hoa Dinh villages of Cho Gao district, Binh Nhi and Thanh Nhat of Go Cong town. Diagnosing Tomato Spotted Wilt Virus in tomato at Binh Ninh, Hoa Dinh, Binh Nhi anh Thanh Nhat villages of Tien Giang province by DAS – ELISA kit. Samples of Tomato Spotted Wilt Virus with positive reaction are selected to conduct the RT – PCR. The RT – PCR protocol to diagnose Tomato Spotted Wilt Virus was tested.  The results of this research are as follows: 1. DAS – ELISA result data show that: Cho Gao district: Hoa Dinh village: 12,0 % Binh Ninh village: 13,16 % Go Cong town: Binh Nhi village: 14,29 % Thanh Nhat village: 10,0 % 2. Finding out the one step RT – PCR process to diagnose Tomato Spotted Wilt Virus. vii MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG LỜI CẢM TẠ iv TÓM TẮT KHÓA LUẬN v SUMMARY vi MỤC LỤC vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT x DANH SÁCH CÁC HÌNH . xi DANH SÁCH CÁC BẢNG . xii DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ xiii Chƣơng 1. MỞ ĐẦU . 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích . 2 1.3. Yêu cầu . 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3 2.1. Sơ lƣợc về cây cà chua . 3 2.1.1. Nguồn gốc và phân bố 3 2.1.2. Phân loại học . 4 2.1.3. Đặc điểm thực vật học . 4 2.1.4. Giá trị dinh dƣỡng . 5 2.2. Sơ lƣợc về bệnh hại cà chua . 6 2.2.1. Đặc điểm chung bệnh do virus 6 2.2.2. Sự lan truyền bệnh virus thực vật . 7 2.2.3. Sơ lƣợc về TSWV . 8 2.2.3.1. Nguồn gốc TSWV 8 2.2.3.2. Cấu trúc TSWV 9 2.2.3.3. Phân loại TSWV 10 2.2.3.4. Dãy ký chủ của TSWV 11 viii 2.2.3.5. Con đƣờng truyền bệnh 11 2.2.3.6. Hình thức tấn công và gây bệnh . 12 2.2.3.7. Điều kiện phát triển 13 2.2.3.8. Triệu chứng bệnh . 13 2.2.3.9. Khống chế bệnh do TSWV . 14 2.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh . 16 2.3.1. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng . 16 2.3.2. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị 17 2.3.3. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử . 17 2.3.4. Phƣơng pháp ELISA . 18 2.3.5. Phƣơng pháp RT – PCR 19 2.3.5.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR 19 2.3.5.2. Nested PCR 20 2.3.5.3. RT – PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction) . 20 2.4. Một số kết quả nghiên cứu về TSWV 23 2.4.1. Nghiên cứu nƣớc ngoài . 23 2.4.2. Nghiên cứu trong nƣớc . 23 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 24 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24 3.2. Vật liệu . 24 3.2.1. Dụng cụ và thiết bị 24 3.2.1.1. Dụng cụ 24 3.2.1.2. Máy móc, thiết bị . 25 3.2.2. Hoá chất 25 3.2.2.1. Hoá chất dùng trong kỹ thuật ELISA . 25 3.2.2.2. Hóa chất dùng trong kỹ thuật RT – PCR . 26 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 28 3.3.1. Nội dung nghiên cứu . 28 3.3.2. Phƣơng pháp lấy mẫu 28 ix 3.3.3. Phƣơng pháp phát hiện TSWV . 30 3.3.3.1. Phƣơng pháp ELISA 30 3.3.3.2. Phƣơng pháp RT – PCR . 32 3.3.3.3. Đổ gel điện di . 38 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 4.1. Kết quả phát hiện TSWV bằng kỹ thuật ELISA 40 4.1.1. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại hai xã thuộc huyện Chợ Gạo 40 4.1.2. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại hai xã thuộc thị xã Gò Công . 41 4.1.3. Tỉ lệ nhiễm bệnh TSWV của huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công 42 4.1.4. Tỉ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng . 43 4.2. Kết quả phát hiện TSWV bằng kỹ thuật RT – PCR . 44 4.2.1. Kết quả kiểm tra sản phẩm RNA 44 4.2.2. Kết quả điện di sản phẩm cDNA 45 4.2.3. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi . 46 4.2.4. Kết quả phản ứng RT – PCR . 46 4.2.4.1. Phản ứng RT – PCR hai bƣớc 46 4.2.4.2. Phản ứng RT – PCR một bƣớc . 46 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 48 5.1. Kết luận 48 5.2. Đề nghị . 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 50 x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TSWV: Tomato Spotted Wilt Virus RNA: Ribonucleic acid RNase: Ribonuclease DNA: Deoxyribonucleic acid DNase: Deoxyribonuclease cDNA: Complementary Deoxyribonucleotide acid bp: Base pair DEPC: Diethyl pyrocarbonate ddNTP: Dideoxyribonucleoside triphosphate dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay DAS – ELISA: Direct double antibody sandwich PCR: Polymerase chain reaction RT-PCR: Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction PBS-T: Phosphate buffer saline with TWEEN – 20 p-NPP: p – nitrophenyl phosphate Ta: Annealing temperature Tm: Melting temperature UV: Ultra violet OD: Optical density [...]... tôi tiến hành đề tài Đánh giá tình trạng nhiễm Tomato Spotted Wilt Virus trên cà chua tại tỉnh Tiền Giang bằng kỹ thuật ELISA và xây dựng quy trình chẩn đoán Tomato Spotted Wilt Virus bằng kỹ thuật RT - PCR” nhằm góp phần kiểm soát dịch bệnh 1.2 Mục đích Chẩn đoán bệnh TSWV trên cà chua tại Tiền Giang bằng kỹ thuật ELISA Xây dựng hoàn chỉnh quy trình chẩn đoán Tomato Spotted Wilt Virus bằng kỹ thuật... bệnh virus thì trên cây cà chua vùng nhiệt đới có rất nhiều loại virus gây hại nhƣ : Bệnh khảm vàng: TMV (Tomato Mosaic Virus) Bệnh khảm mảng lồi lõm: CMV (Cucumber Mosaic Virus) Bệnh đốm héo: TSWV (Tomato Spotted Wilt Virus) Bệnh xoăn ngọn cà chua: TLCV (Tomato Leaf Curl Virus) Bệnh xoăn vàng ngọn: TYLCV (Tomato Yellow Leaf Curl Virus) Bệnh đốm hình nhẫn: TRSV (Tomato Black Ring Virus) Bệnh lùn lụi cà. .. mg = 3330 I.U 6 2.2 Sơ lƣợc về bệnh hại cà chua Bệnh hại cà chua là trở ngại lớn trong sản xuất cà chua ở nhiều vùng trên thế giới, có khoảng 200 bệnh cà chua đƣợc biết đến do những nguyên nhân khác nhau, nhƣng có thể chia làm 2 nhóm nguyên nhân chính gây bệnh trên cà chua là bệnh do ký sinh và bệnh không do ký sinh Bệnh do ký sinh gồm có: bệnh do nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng… Bệnh không do ký sinh... – PCR 1.3 Yêu cầu Thu mẫu cà chua có triệu chứng nhiễm bệnh TSWV Nắm vững kỹ thuật và các bƣớc tiến hành DAS – ELISA Lấy mẫu có phản ứng dƣơng tính mạnh với DAS – ELISA tiến hành phản ứng RT – PCR 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc về cây cà chua 2.1.1 Nguồn gốc và phân bố Cà chua có nguồn gốc ở Peru, Ecuado và Bolivia Những loài cà chua hoang dại gần gũi với cà chua trồng trọt ngày nay vẫn... Elliott và cộng sự,2000) 10 Hình 2.1 Cấu trúc virus TSWV 2.2.3.3 Phân loại TSWV TSWV thuộc họ Bunyaviridae, họ Bunyaviridae có 5 giống là: Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus và Tospovirus Trong đó Tospovirus là một trong mƣời virus gây bệnh cây phổ biến nhất TSWV đƣợc phân là đại diện duy nhất của nhóm đơn thân xuất xứ từ nhóm Tomato Spotted Wilt Virus (Mathews, 1979) Năm 1989, TSWV đƣợc... cà chua có bộ nhiễm sắc thể lƣỡng bội 2n = 24, cây thân thảo hằng niên hoặc lƣu niên, là cây tự thụ phấn Rễ cà chua thuộc loại rễ chùm, có khả năng phát triển rộng và sâu rất nhanh Rễ cà chua có thể ăn sâu tới 1 – 1,5 m (điều kiện tối hảo), hệ rễ phát triển chủ yếu ở tầng đất 0 – 30 cm Rễ cà chua phát triển rất mạnh ở giai đoạn cây con, khi rễ chính bị đứt thì rễ phụ phát triển rất nhanh Thân cây cà. .. nguyên thủy của chi Tospovirus mới trong họ Bunyaviridae Ngƣời ta dựa trên đặc tính huyết thanh và trình tự nucleotide mà chia ra làm 6 loài: Tomato Spotted Wilt Virus (nhóm huyết thanh I) Groundnut Ring Spot Virus GRSV (nhóm huyết thanh II) Tomato Chlorotic Spot Virus TCSV (nhóm huyết thanh III) Impatiens Necrotic Spot Virus INSV (nhóm huyết thanh IV) Groundnut Bud Necrosis Virus GBNV (nhóm huyết thanh... trên cà chua ở Úc, sau đó đƣợc mô tả chính xác là bệnh gây ra bởi virus (Brittlebank, 1919) Đến năm 1920, bệnh đã lan tràn trên khắp lãnh thổ Australia và nhiều vùng trên thế giới Bên cạnh ớt, cà chua và các loại hoa màu chính yếu nhạy cảm với TSWV thì còn có cây họ cúc, khoai tây, đậu phụng, thuốc lá, rau diếp, và một số loại hoa màu khác 9 Vào những năm 1960, TSWV đã gây ra nhiều thiệt hại cho cà. .. giống nguyên thủy tại những nơi này và các giống hiện đại đã kết luận rằng Mehico là quê hƣơng của cà chua trồng ngày nay (PROSEA, 1999; Trần Khắc Thi và Mai Thị Phƣơng Anh, 2003) Đầu thế kỷ 16 cà chua đƣợc phát hiện trồng ở Ý, Đức, Pháp, Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha Ngày nay cà chua là loại rau ăn quả dùng làm thực phẩm, đƣợc trồng phổ biến ở nhiều nƣớc trên thế giới, là loại rau có giá trị dinh dƣỡng... là nhóm môi giới (vectơ) truyền bệnh virus quan trọng nhất và gây thiệt hại kinh tế rất lớn trên đồng ruộng Một loại côn trùng thƣờng chỉ là môi giới truyền bệnh cho một loại virus mà thôi 8 Các dạng tồn tại của virus trong cơ thể côn trùng: Nhóm virus không bền vững là những virus không có khả năng tồn tại trong cơ thể côn trùng từ vài phút tới 1 giờ Đó là những virus lây bệnh nhanh chóng trong khoảng . Đánh giá tình trạng nhiễm Tomato Spotted Wilt Virus trên cà chua tại tỉnh Tiền Giang bằng kỹ thuật ELISA và xây dựng quy trình chẩn đoán Tomato. Đánh giá tình trạng nhiễm Tomato Spotted Wilt Virus trên cà chua bằng kỹ thuật ELISA và xây dựng quy trình chẩn đoán Tomato Spotted Wilt Virus