Đánh giá tình trạng nhiễm tomato spotted vilt virus trên cà chua

Đánh giá tình trạng nhiễm tomato spotted vilt virus trên cà chua tại tỉnh tiền giang bằng kỹ thuật elisa và xây dựng quy trình chuẩn đoán tomato spotted vilt virus bằng kỹ thuật pt-pcr

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÀ CHUA TẠI TỈNH TIỀN GIANG

BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TOMATO SPOTTED WILT VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT – PCR

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HỒNG PHƯỚC

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

EVALUATION ON THE STATUS QUO OF TOMATO SPOTTED WILT VIRUS AFFECTING TOMATO PLANT IN TIEN GIANG

PROVINCE BY ELISA AND FORMULATING THE RT – PCR PROCESS TO DIAGNOSE

TOMATO SPOTTED WILT VIRUS

Graduation thesis Major: Biotechnology

Term: 2003 – 2007

HCMC, 9/2007

iv  Em xin chân thành cảm tạ:

PGS.TS Bùi Cách Tuyến đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu giúp em hoàn thành khóa luận

Ban Giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh, Ban Chủ nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận này

Ban Giám đốc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh và toàn thể Anh Chị đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp em hoàn thành tốt khóa luận

TS Lê Đình Đôn cùng quý Thầy – Cô trong và ngoài trường đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và làm khóa luận

 Em xin cám ơn chị Dương, chị Hưng, chị Hạnh, anh Lẫm, anh Trường, anh Vũ đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận  Cảm ơn tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học K29 niên khóa 2003 – 2007, đã luôn gắn bó, chia sẻ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện khóa luận

 Con vô cùng biết ơn cha mẹ đã dạy bảo, nuôi dưỡng con được như ngày hôm nay, cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt thời gian học tập tại trường

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2007 Sinh viên

Nguyễn Hồng Phước

v

 Nguyễn Hồng Phước, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 9 năm

2007, “Đánh giá tình trạng nhiễm Tomato Spotted Wilt Virus trên cà chua

bằng kỹ thuật ELISA và xây dựng quy trình chẩn đoán Tomato Spotted Wilt Virus bằng kỹ thuật RT – PCR” được thực hiện từ tháng 3 đến tháng 8

năm 2007 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh thuộc Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường (RIBET), Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

 Nội dung thực hiện:

Thu mẫu có triệu chứng nhiễm TSWV tại xã Bình Ninh và xã Hòa Định huyện Chợ Gạo, xã Bình Nhì và xã Thạnh Nhật thuộc thị xã Gò Công

Xác định tỉ lệ nhiễm TSWV trên cà chua tại các xã Bình Ninh, Hòa Định, Bình Nhì, Thạnh Nhật thuộc tỉnh Tiền Giang bằng kỹ thuật DAS – ELISA

Mẫu biểu hiện dương tính mạnh được chọn để thực hiện phản ứng RT – PCR Từ đó tìm ra quy trình RT – PCR chẩn đoán bệnh TSWV

 Kết quả đạt được:

1 Xác định tỷ lệ nhiễm TSWV tại các địa bàn như sau: Huyện Chợ Gạo

Xã Hòa Định 12,0 % Xã Bình Ninh 13,16 % Thị xã Gò Công

Xã Bình Nhì 14,29 % Xã Thạnh Nhật 10,0 %

2 Bước đầu tìm được quy trình RT – PCR một bước để chẩn đoán bệnh TSWV

vi

 This is Nguyen Hong Phuoc studying at Nong Lam University and finishing

the thesis on 9th 2007 The thesis entiled “Evaluation on the status quo of

Tomato Spotted Wilt Virus affecting tomato plant in Tien Giang province by ELISA and formulating the RT – PCR process to diagnose Tomato Spotted Wilt Virus” This research was conducted from 3th, 2007 to 8th, 2007 in the laboratory of biotechnology and chemistry of Nong Lam University

 The contents of this are as follows:

Collecting the samples with Tomato Spotted Wilt Virus symptoms in Binh Ninh and Hoa Dinh villages of Cho Gao district, Binh Nhi and Thanh Nhat of Go Cong town

Diagnosing Tomato Spotted Wilt Virus in tomato at Binh Ninh, Hoa Dinh, Binh Nhi anh Thanh Nhat villages of Tien Giang province by DAS – ELISA kit

Samples of Tomato Spotted Wilt Virus with positive reaction are selected to conduct the RT – PCR The RT – PCR protocol to diagnose Tomato Spotted Wilt Virus was tested

 The results of this research are as follows: 1 DAS – ELISA result data show that:

Cho Gao district:

Hoa Dinh village: 12,0 % Binh Ninh village: 13,16 % Go Cong town:

Binh Nhi village: 14,29 % Thanh Nhat village: 10,0 %

2 Finding out the one step RT – PCR process to diagnose Tomato Spotted Wilt Virus

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về cây cà chua 3

2.1.1 Nguồn gốc và phân bố 3

2.1.2 Phân loại học 4

2.1.3 Đặc điểm thực vật học 4

2.1.4 Giá trị dinh dưỡng 5

2.2 Sơ lược về bệnh hại cà chua 6

2.2.1 Đặc điểm chung bệnh do virus 6

2.2.2 Sự lan truyền bệnh virus thực vật 7

2.3.1 Phương pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng 16

2.3.2 Phương pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị 17

2.3.3 Phương pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử 17

2.4.1 Nghiên cứu nước ngoài 23

2.4.2 Nghiên cứu trong nước 23

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24

3.2.2.1 Hoá chất dùng trong kỹ thuật ELISA 25

3.2.2.2 Hóa chất dùng trong kỹ thuật RT – PCR 26

3.3 Phương pháp nghiên cứu 28

3.3.1 Nội dung nghiên cứu 28

3.3.2 Phương pháp lấy mẫu 28

ix

3.3.3.2 Phương pháp RT – PCR 32

3.3.3.3 Đổ gel điện di 38

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

4.1 Kết quả phát hiện TSWV bằng kỹ thuật ELISA 40

4.1.1 Tỉ lệ nhiễm TSWV tại hai xã thuộc huyện Chợ Gạo 40

4.1.2 Tỉ lệ nhiễm TSWV tại hai xã thuộc thị xã Gò Công 41

4.1.3 Tỉ lệ nhiễm bệnh TSWV của huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công 42

4.1.4 Tỉ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng 43

4.2 Kết quả phát hiện TSWV bằng kỹ thuật RT – PCR 44

4.2.1 Kết quả kiểm tra sản phẩm RNA 44

4.2.2 Kết quả điện di sản phẩm cDNA 45

4.2.3 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi 46

x TSWV: Tomato Spotted Wilt Virus RNA: Ribonucleic acid

RT-PCR: Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction PBS-T: Phosphate buffer saline with TWEEN – 20

p-NPP: p – nitrophenyl phosphate Ta: Annealing temperature

Tm: Melting temperature UV: Ultra violet

OD: Optical density

Hình 4.1 Kết quả điện di RNA tổng số 44

Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm cDNA 45

Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm RT – PCR một bước 47

xii

Bảng 2.1 Thành phần dinh dƣỡng trong 100 g thịt trái cà chua (McGlasson, B.,

1993; PROSEA, 1994) 5

Bảng 3.1 Sơ đồ bố trí lấy mẫu 30

Bảng 3.2 số lƣợng mẫu và vị trí lấy mẫu 30

xiii

Đồ thị 4.1 Tỉ lệ nhiễm TSWV tại huyện Chợ Gạo 40Đồ thị 4.2 Tỉ lệ nhiễm TSWV tại thị xã Gò Công 41Đồ thị 4.3 Tỉ lệ nhiễm TSWV huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công 42

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cà chua (Solanum lycopersicum) là cây trồng rất quan trọng, nó không

những phục vụ nhu cầu hằng ngày của con người mà còn đem lại thu nhập cho người dân mà xa hơn nữa là góp phần không nhỏ vào ngân sách nhà nước Chính vì lợi nhuận không nhỏ đó mà cà chua được trồng vào tất cả các mùa trong năm, ở khắp mọi nơi trên thế giới

Tiền Giang với điều kiện khí hậu thích hợp, nước tưới dồi dào và đất đai màu mỡ rất phù hợp để trồng rau màu, trong đó cà chua chiếm diện tích khá lớn, nó như là nguồn thu nhập không thể thiếu của người dân nơi đây Như là một quy luật của tự nhiên, đi đôi với sự gia tăng về diện tích, tăng cường thâm canh thì dịch bệnh gia tăng không kém Dịch bệnh là một trong những trở ngại lớn cho việc canh tác của người dân, dịch bệnh làm thiệt hại không nhỏ cho thu nhập người dân và ngân sách nhà nước Trong số những bệnh hại cây trồng thì bệnh do virus là nguy hiểm nhất do chưa có thuốc trị đặc hiệu, kèm theo là khả năng lây lan rất nhanh, khó nhận biết ở giai đoạn sớm, và khi phát thành bệnh thì đã gây thiệt hại rất lớn không thể kiểm soát được

Trong số những bệnh do virus gây ra thì TSWV gây thiệt hại rất lớn cho

việc canh tác cà chua, thuốc lá và những cây trồng họ Solanaceae Điều đó đặt ra

một nhu cầu cấp thiết làm sao để sớm phát hiện và loại bỏ cây bị nhiễm Đây không chỉ là vấn đề quan trọng đối với các nước Trung Quốc, Mỹ, Brazil, Mehico… mà còn đối với các nước nhiệt đới khác, trong đó có Việt Nam

Ngày nay với sự phát triển vượt bậc khoa học và công nghệ đặc biệt là của công nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử đã giúp cho việc chẩn đoán sớm bệnh một cách nhanh, chính xác nhiều bệnh virus

Xuất phát từ thực tế trên cùng với sự chấp nhận của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh và sự hướng dẫn của

PGS.TS Bùi Cách Tuyến, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá tình trạng nhiễm

Tomato Spotted Wilt Virus trên cà chua tại tỉnh Tiền Giang bằng kỹ thuật ELISA và xây dựng quy trình chẩn đoán Tomato Spotted Wilt Virus bằng kỹ thuật RT - PCR” nhằm góp phần kiểm soát dịch bệnh

1.2 Mục đích

Chẩn đoán bệnh TSWV trên cà chua tại Tiền Giang bằng kỹ thuật ELISA Xây dựng hoàn chỉnh quy trình chẩn đoán Tomato Spotted Wilt Virus bằng kỹ thuật RT – PCR

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về cây cà chua

2.1.1 Nguồn gốc và phân bố

Cà chua có nguồn gốc ở Peru, Ecuado và Bolivia Những loài cà chua hoang dại gần gũi với cà chua trồng trọt ngày nay vẫn còn được tìm thấy ở dọc theo dãy núi Anđơ (Peru), Ecuado và Bolivia (De Candolle,1884)

Tuy nhiên Mehico là đất nước đâu tiên trồng trọt hóa cây trồng này dựa vào 3 chứng cứ: cà chua trồng bắt đầu từ Châu Mỹ; được trồng trọt hóa trước khi chuyển xuống Châu Âu, Châu Á và tổ tiên của cà chua trồng ngày nay là cà chua Anh Đào được tìm thấy ở vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Châu Mỹ, sau đó đến vùng nhiệt đới Châu Á và Châu Phi; những nghiên cứu về enzyme định vị và sự biến đổi di truyền của các dạng cà chua tìm thấy ở Mehico, Trung Mỹ và Peru cũng như nghiên cứu về khoảng cách di truyền giữa các giống nguyên thủy tại những nơi này và các giống hiện đại đã kết luận rằng Mehico là quê hương của cà chua trồng ngày nay (PROSEA, 1999; Trần Khắc Thi và Mai Thị Phương Anh, 2003)

Đầu thế kỷ 16 cà chua được phát hiện trồng ở Ý, Đức, Pháp, Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha Ngày nay cà chua là loại rau ăn quả dùng làm thực phẩm, được trồng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới, là loại rau có giá trị dinh dưỡng rất lớn và phong phú (Tạ Thu Cúc, 2001)

Ở Việt Nam cà chua được trồng chủ yếu tập trung ở vùng đồng bằng trung du Bắc Bộ (Hà Nội, Hà Bắc, Hải Phòng,…) và ở miền Nam (Lâm Đồng, Tiền Giang, Long An, Tây Ninh,…)

2.1.2 Phân loại học

Lớp (Class) Magnoliopsida Lớp phụ (Subclass) Asteridae

Loài (Species) Solanum lycopersicum

Tên tiếng Việt Cà chua

Thân cây cà chua thuộc loại thân bụi Cà chua có đặc tính phân cành rất mạnh (một nách lá có một mầm nách), thân có nhiều đốt Lúc nhỏ toàn thân phủ một lớp lông tơ mềm, chứa nhiều nước, thân dòn dễ gãy, có dạng hình tròn hay hình bầu dục

Lá cà chua thuộc loại lá kép lông chim lẻ, mỗi lá kép có từ 3 – 4 đôi lá chét, ở ngọn có một lá riêng biệt gọi là đỉnh lá Mỗi lá chét có răng cưa sâu nông khác nhau tùy giống, trên mặt lá có một lớp lông tơ

Hoa thuộc loại hoa hoàn chỉnh, hoa tự thụ phấn là chủ yếu, không có mùi thơm và hoa tiết ra nhiều chất độc Số lượng hoa trên chùm thay đổi tùy giống và tùy thời tiết, thường từ 5 – 20 hoa

Quả thuộc loại quả mọng, nhiều nước, chia ra nhiều ô Trọng lượng quả thay đổi rất lớn có thể từ 2 – 3 g đến 200 – 300 g Khi trái còn non có màu xanh, khi chín có màu vàng, vàng da cam đến đỏ

Hạt cà chua nhỏ, dẹp, nhiều lông Bên ngoài hạt được bao bọc bởi một lớp acid amin, trung bình có 50 – 350 hạt trong quả, trọng lượng 1000 hạt là 2,5 – 3,5 g

2.1.4 Giá trị dinh dưỡng

Cà chua là loại rau ăn quả rất được ưa thích vì phẩm chất ngon và chế biến được nhiều cách Cà chua còn cho năng suất cao nên được trồng rộng rãi và canh tác khoảng 200 năm nay ở Châu Âu để làm cây thực phẩm

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng trong 100 g thịt trái cà chua (McGlasson, B., 1993; PROSEA, 1994)

1 mg = 3330 I.U

2.2 Sơ lược về bệnh hại cà chua

Bệnh hại cà chua là trở ngại lớn trong sản xuất cà chua ở nhiều vùng trên thế giới, có khoảng 200 bệnh cà chua được biết đến do những nguyên nhân khác nhau, nhưng có thể chia làm 2 nhóm nguyên nhân chính gây bệnh trên cà chua là bệnh do ký sinh và bệnh không do ký sinh

Bệnh do ký sinh gồm có: bệnh do nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng… Bệnh không do ký sinh thường là do nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng không

thích hợp hay bởi sự mất cân bằng dinh dưỡng…

Riêng đối với bệnh virus thì trên cây cà chua vùng nhiệt đới có rất nhiều loại virus gây hại như :

Bệnh khảm vàng: TMV (Tomato Mosaic Virus)

Bệnh khảm mảng lồi lõm: CMV (Cucumber Mosaic Virus) Bệnh đốm héo: TSWV (Tomato Spotted Wilt Virus)

Bệnh xoăn ngọn cà chua: TLCV (Tomato Leaf Curl Virus)

Bệnh xoăn vàng ngọn: TYLCV (Tomato Yellow Leaf Curl Virus) Bệnh đốm hình nhẫn: TRSV (Tomato Black Ring Virus)

Bệnh lùn lụi cà chua: TBSV (Tomato Bushy Stunt Virus)

(Nguồn: Phạm Văn Biên, Bùi Cách Tuyến và Nguyễn Mạnh Chinh, 2003)

2.2.1 Đặc điểm chung bệnh do virus (Vũ Triệu Mân, 1999)

Virus thực vật thuộc loại ký sinh chuyên tính cao độ Chúng thiếu hệ thống men, hoàn toàn phụ thuộc vào tế bào sống của cây trồng để phát triển và tích lũy số lượng

Virus có thể nhiễm bệnh cho một hay nhiều loài cây và một loài cây có thể nhiễm một hay nhiều virus

Virus không giết chết tế bào mà dùng vật chất của tế bào chủ tạo thành nhiều virus mới Cơ thể thực vật kiệt quệ dẫn đến thoái hóa, suy tàn và có thể chết

Virus thực vật không có cấu tạo tế bào, là những nucleoprotein kích thước rất nhỏ bé, cấu tạo rất đơn giản: là protein và acid nucleic mà chủ yếu là RNA Tuy nhiên, cũng có khoảng 25 loài virus chứa DNA

Protein gồm nhiều loại acid amin tạo thành: Alanin, glycin, lizin, aginin, acid asparaginic, acid glutamic, lesin, sistein, prolin, triptophan Các acid nucleic (RNA hay DNA) sẽ quyết định bản chất protein của chúng

Trọng lượng cơ thể của virus rất khác nhau từ 4,6 triệu Da đến 39 triệu Da Chúng có nhiều hình dạng khác nhau: hình gậy, hình cầu, hình sợi, hình tinh trùng Một số virus trong những điều kiện nhất định của môi trường có thể tạo thành các tinh thể

2.2.2 Sự lan truyền bệnh virus thực vật (Vũ Triệu Mân, 1999)

Đa số virus di chuyển theo bó mạch libe từ trên xuống dưới rồi lại từ dưới lên trên khi các dòng chất dinh dưỡng được vận chuyển về các cơ quan sinh thực Virus di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác bằng các cầu nối nguyên sinh hết sức chậm chạp, di chuyển trong các mô mạch dẫn có tốc độ nhanh hơn

Các con đường truyền bệnh:

Truyền qua nhân giống vô tính: ghép cây, ghép chồi, chiết cành, gốc ghép, cành ghép, cành giâm, nuôi cấy mô thực vật hay nhân giống vô tính từ củ hay thân cây

Truyền qua hạt giống hay phấn hoa cây trồng: có khoảng 100 loài virus có khả năng này, phần lớn tập trung ở họ bầu bí

Truyền bệnh bằng cơ học, tiếp xúc: trồng cây với mật độ dày, giao tán, lá cọ sát nhau giữa cây bệnh với cây khỏe, hay truyền qua vết thương do gió, chăm sóc, thu hái, gia súc

Truyền bệnh bằng côn trùng môi giới (nhện, tuyến trùng): côn trùng là nhóm môi giới (vectơ) truyền bệnh virus quan trọng nhất và gây thiệt hại kinh tế rất lớn trên đồng ruộng Một loại côn trùng thường chỉ là môi giới truyền bệnh cho một loại virus mà thôi

Các dạng tồn tại của virus trong cơ thể côn trùng:

Nhóm virus không bền vững là những virus không có khả năng tồn tại trong cơ thể côn trùng từ vài phút tới 1 giờ Đó là những virus lây bệnh nhanh chóng trong khoảng thời gian từ 15 giây tới 30 phút sau khi chích hút ở cây bệnh và có thể lây ngay

Nhóm virus bền vững là những virus có thể sống bền vững trong cơ thể côn trùng một thời gian từ vài giờ tới vài tuần lễ mới có khả năng truyền bệnh cho cây và có thể truyền bệnh đến suốt đời

Nhóm virus bán bền vững là những virus có kiểu truyền bệnh trung gian giữa hai nhóm trên

Trong mối quan hệ sinh học giữa virus và côn trùng thì virus rất có lợi: Tăng về số lượng, tăng cường tính ký sinh gây bệnh và được đưa vào đúng tầng mô mẫn cảm bệnh Nhưng côn trùng môi giới sẽ bị giảm tuổi thọ, sức sinh sản và sức sống giảm

Truyền bệnh nhờ nấm: đa số các nấm sống trong đất đều có khả năng truyền bệnh virus cho cây

Truyền bệnh bằng dây tơ hồng: đây là thực vật thượng đẳng ký sinh tạo rễ ăn sâu vào thân cây sống để hút nhựa Do vậy, có nhiều loại virus thực vật di chuyển theo thân dây tơ hồng đi từ cây này sang cây khác để gây bệnh

2.2.3 Sơ lược về TSWV 2.2.3.1 Nguồn gốc TSWV

TSWV có phổ ký chủ rất rộng ở cả vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới TSWV được báo cáo đầu tiên vào năm 1915 khi gây thiệt hại rất lớn trên cà chua ở Úc, sau đó được mô tả chính xác là bệnh gây ra bởi virus (Brittlebank, 1919) Đến năm 1920, bệnh đã lan tràn trên khắp lãnh thổ Australia và nhiều vùng trên thế giới Bên cạnh ớt, cà chua và các loại hoa màu chính yếu nhạy cảm với TSWV thì còn có cây họ cúc, khoai tây, đậu phụng, thuốc lá, rau diếp, và một số loại hoa màu khác

Vào những năm 1960, TSWV đã gây ra nhiều thiệt hại cho cà chua trồng tại Hawaii

Năm 1970, lần đầu tiên TSWV được xác định là gây bệnh tại Georgia Năm 1971, TSWV gây bệnh trên cây đậu phộng ở Texas và hủy hoại nặng các cánh đồng trồng đậu phộng vào năm 1985 – 1986

Năm 1989, TSWV gây thiệt hại nặng cho thuốc lá, đậu phộng và cà chua ở miền Nam Georgia Tỉ lệ nhiễm khoảng 59 – 90 % điều này đưa đến hậu quả là nó ảnh hưởng lên các loại hoa màu có giá trị thương mại, và trong thời gian gần đây nó là một trong những loại virus làm ảnh hưởng đến các loại hoa màu nhiều nhất (Lindsey Irons and Emily Sims)

2.2.3.2 Cấu trúc TSWV

Lớp vỏ lipid có chứa 2 loại glycoprotein G1 và G2 bao quanh một genome RNA gồm 3 phần đã được đóng gói chặt chẽ bởi nhiều bản sao của tiểu đơn vị nucleoprotein (N) và 10 – 20 bản sao của protein lớn (L) là polymerase của virus (Van Poelwijk và cộng sự, 1993)

Bộ gene virus là RNA chia làm 3 phần, là loại ambisense ssRNA chứa 5 gen mã hóa ít nhất 6 protein cấu trúc của virus:

LRNA (dài 8.897 nucleotide) là RNA lớn nhất Đó là sợi negative sense và là sợi đơn cistron LRNA mã hóa cho RNA polymerase phụ thuộc RNA

MRNA (4.821 nucleotide) mã hóa 2 protein vỏ (G1 và G2) và một protein phi cấu trúc được xem như là protein di chuyển từ tế bào đến tế bào (NSm)

SRNA (2.916 nucleotide) mã hóa nucleoprotein (N) và một protein phi cấu trúc thứ 2 (NSs)

(Nguồn: Elliott và cộng sự,2000)

Hình 2.1 Cấu trúc virus TSWV 2.2.3.3 Phân loại TSWV

TSWV thuộc họ Bunyaviridae, họ Bunyaviridae có 5 giống là:

Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus và Tospovirus Trong đó Tospovirus là một trong mười virus gây bệnh cây phổ biến nhất

TSWV được phân là đại diện duy nhất của nhóm đơn thân xuất xứ từ nhóm “Tomato Spotted Wilt Virus” (Mathews, 1979) Năm 1989, TSWV được chia thành TSWV dòng L và TSWV dòng I; đến giữa những năm 1989 – 1992, hai dòng này được xác định có đặc tính huyết thanh học khác nhau và chúng được đổi tên thành TSWV (TSWVdòng L) và INSV (TSWV dòng I)

Hiện nay, TSWV được phân loại là nhóm nguyên thủy của chi Tospovirus

mới trong họ Bunyaviridae Người ta dựa trên đặc tính huyết thanh và trình tự nucleotide mà chia ra làm 6 loài:

Tomato Spotted Wilt Virus (nhóm huyết thanh I)

Groundnut Ring Spot Virus GRSV (nhóm huyết thanh II) Tomato Chlorotic Spot Virus TCSV (nhóm huyết thanh III) Impatiens Necrotic Spot Virus INSV (nhóm huyết thanh IV) Groundnut Bud Necrosis Virus GBNV (nhóm huyết thanh V) Wattermelon Silver Molt Virus WMSMV

2.2.3.4 Dãy ký chủ của TSWV

TSWV có phổ ký chủ rất rộng, chúng tấn công trên nhiều cây cảnh, cỏ dại và nhiều cây trồng khác nhau trên toàn thế giới Hiện nay danh sách ký chủ của TSWV khoảng 1000 loài cây, thuộc 15 họ thực vật một lá mầm, 69 họ thực vật hai lá mầm và một họ thực vật có hoa ẩn (German và cộng sự, 1992)

Ký chủ mẫn cảm với TSWV gồm các loại cây trồng quan trọng như ớt, đậu nành, khoai tây, thuốc lá, cà chua, cần tây, rau diếp và nhiều loại cây cảnh Ở những vùng có mùa đông băng giá thì cây kí chủ đa niên là nguồn chứa TSWV đáng kể, các vùng có mùa đông mát mẻ thì cây ký chủ hằng niên là nguồn chứa TSWV để lây lan cho cây trồng

2.2.3.5 Con đường truyền bệnh

TSWV được truyền từ cây này sang cây khác thông qua các loài bọ trĩ Chúng là những côn trùng cực nhỏ (khoảng 0,5 mm) sống cả ở trên hoa, lá và đất Có chín loài bọ trĩ được xem là vector truyền TSWV, trong đó những loài Western

Flower Thrip (Frankliniella occidentalis), F schultzei (Trybom), F fusca (Hind),

Thrips tabaci Lind được xem là vector chính truyền bệnh vì khả năng phân bố rộng

rãi của chúng

Bọ trĩ trưởng thành màu nâu đen hay đen, ấu trùng màu vàng rơm Con cái sinh sản không cần con đực Bọ trĩ đẻ trứng trong những mô mềm của thân, lá hay hoa, ấu trùng vừa nở ra bắt đầu ăn ngay Khi ấu trùng ăn mô bị nhiễm chúng thu virus vào bên trong, thời gian ăn kéo dài thì khả năng mang virus tăng lên đến khi ấu trùng phát triển hoàn thiện chúng sẽ chui vào đất và trở thành nhộng Sau đó chúng trưởng thành, có cánh, nhô lên khỏi mặt đất Ấu trùng bọ trĩ chưa lan truyền bệnh cho cây ngay được mà phải chờ đến khi chúng trưởng thành Những con bọ trĩ trưởng thành có thể mang virus suốt đời nhưng không truyền cho giai đoạn trứng Thế hệ kế tiếp mang virus bằng việc ăn cây bị nhiễm Thời gian từ trứng đến giai

đoạn trưởng thành có thể thay đổi do nhiều yếu tố

khối tế bào chất với màng tế bào và giải phóng virion trưởng thành (Lindsey Irons và Emily Sims)

2.2.3.7 Điều kiện phát triển

Theo Best bệnh thích nghi với thời tiết ấm áp, thời tiết ấm và khô là điều kiện tốt nhất cho bọ trĩ sinh sản Nhiệt độ trung bình trong ngày vào khoảng 25oC kết hợp với lượng mưa giảm là điều kiện tối ưu cho bọ trĩ lẫn TSWV phát triển Bệnh trở thành dịch trong suốt giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng của cây, giai đoạn mà virus được bọ trĩ lan truyền từ cây này sang cây khác dễ dàng

Nhiệt độ cao, ẩm độ thấp là điều kiện rất bất lợi cho bọ trĩ Mưa nhiều và to trong mùa đông cũng làm giảm số bọ trĩ xuống mức thấp, vì vậy dịch bệnh thời điểm này cũng giảm đi

Virus TSWV có thể qua đông trên nhiều loại cây trồng Khi nhiệt độ xuống thấp, bọ trĩ mang virus qua đông dưới dạng côn trùng nằm trong đất Khi xuân đến, thời tiết ấm áp, bọ trĩ sẽ di chuyển từ cỏ dại sang cây trồng để truyền bệnh Do đó, TSWV cứ lây nhiễm từ năm này sang năm khác, từ vụ này đến vụ khác từ những loài bọ trĩ ký sinh trên cây

Cây trồng bị nhiễm bệnh vào giai đoạn đang phát triển thì có thể không ra quả hoặc có quả nhưng rất nhỏ, có các đốm nhỏ hay các vòng hoại tử hay thể khảm trên vỏ quả, làm năng suất giảm và giảm giá trị cảm quan

(Nguồn: Ken Pernezny và cộng sự, 2003)

Tuy nhiên, triệu chứng này có thể giống với các bệnh do các virus khác, vi khuẩn, nấm hay stress môi trường gây ra Vì thế cách chẩn đoán bệnh theo triệu chứng bên ngoài chỉ là cách xác định bệnh nhất thời nên có thể không chính xác

Hình 2.3 Triệu chứng TSWV trên cà chua 2.2.3.9 Khống chế bệnh do TSWV

Hiện nay hai phương pháp chính được sử dụng là sử dụng cây kháng và chiến lược quản lý nhằm giảm tác hại của TSWV

 Sử dụng cây kháng

Sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp cho phép thúc đẩy quá trình nhận dạng, chọn lọc và lai tạo cây mới Những marker phân tử liên kết với tính kháng TSWV đã được tìm thấy trong những dòng cà chua phát triển từ những dòng lai giữa SW 307 (Brommonschenkel, Tanksley và Cho) và cây kháng TSWV

Một số giống cà chua lai kháng TSWV sẵn có trên thị trường:

Giống Amelia (HMX – 0800) do công ty Harris Moran Seed cung cấp Đặc tính của giống này là trái chín khá sớm, trái to, kháng TSWV, tuyến trùng, và 3 nòi nấm Fusarium gây héo Amelia được thử nghiệm ở Mountain Horticultural Crops Research Station ở Fletcher trên 3 năm gần đây và cho kết quả tốt

Giống EX 1405037 do công ty Seminis Seeds cung cấp Đặc tính của giống này là trái cà chua to, chín hơi trễ EX 1405037 không cho kết quả tốt như Amelia ở Mountain Horticultural Crops Research Station ở Fletcher vào năm 2002 vì thời gian chín lâu hơn

Giống BHN 444 và BNN 640 do Seigers và công ty hạt Seedway cung

cấp Đặc tính của giống BHN 444 là cho trái lớn nhưng hình dạng trái hơi thô, giống BHN 640 có tính kháng với ba nòi nấm Fusarium gây héo và kháng TSWV và trái của nó nhỏ hơn nhưng bóng hơn BHN 444

 Chiến lược quản lý TSWV

Hiểu biết rõ về mối quan hệ giữa kí chủ – ký sinh – vectơ đã giúp chúng ta phát triển những biện pháp canh tác nhằm làm giảm đáng kể thiệt hại do TSWV gây ra trên những cây trồng nhạy cảm Nếu sử dụng riêng lẻ từng biện pháp thì hiệu quả sẽ không cao Vì vậy người ta thường kết hợp nhiều biện pháp với nhau để giảm đến mức tối thiểu thiệt hại do virus gây ra Biện pháp quản lý hiệu quả nhất là phòng ngừa, bao gồm các kỹ thuật:

Bảo vệ cây con: cây con rất dễ bị nhiễm TSWV vì vậy cây con cần được trồng ở những nơi có cây trồng nhạy cảm với TSWV, trồng trong nhà kính hoặc sử

dụng màng che cẩn thận Phun thuốc diệt côn trùng đều đặn để làm giảm khả năng sống của bọ trĩ trong vườn ươm

Cần phải loại ra và tiêu hủy nhanh chóng những cây có biểu hiện bệnh và những cây nghi ngờ nhiễm bệnh tiềm ẩn

Tránh trồng độc canh, nên hạn chế trồng cùng một loại cây trồng nhiều lần trên một ruộng đất

Trồng luân canh giữa các loại cây trồng nhạy cảm và không nhạy cảm với TSWV để loại bỏ mầm bệnh

Trồng với mật độ thích hợp sẽ hạn chế được bệnh Sử dụng cây trồng sạch bệnh, cây kháng bệnh

Loại bỏ những nguồn chứa TSWV, cày đất nơi thu hoạch, loại bỏ các loài cỏ dại là ký chủ của TSWV chung quanh đồng ruộng

Nên bỏ hoang các đồng ruộng bị nhiễm bệnh khoảng 1 tháng

Sử dụng nhiều loại thuốc trừ sâu khác nhau, đúng liều lượng và thời gian hợp lý để tiêu diệt được nhiều loài bọ trĩ cùng một lúc và đạt được kết quả tốt nhất

Khống chế bọ trĩ bằng biện pháp sinh học là có hiệu quả và có lợi nhất lại không ảnh hưởng đến môi trường

2.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh

2.3.1 Phương pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng (Vũ Triệu Mân, 2003)

Triệu chứng là những biểu hiện bên ngoài, phản ánh đặc điểm riêng biệt của một loại bệnh do một nguyên nhân nào đó gây ra Đối với bệnh này, chẩn đoán theo triệu chứng bệnh là một phương pháp nhanh chóng, khá chính xác Vì vậy, có thể căn cứ vào triệu chứng bên ngoài điển hình về hình thái vết bệnh, màu sắc vết bệnh, vị trí và bộ phận cây bị bệnh mà chẩn đoán bệnh

Tuy nhiên trong một số trường hợp cũng dẫn đến nhầm lẫn, nhất là trong trường hợp chẩn đoán các bệnh có triệu chứng bên ngoài tương tự nhau nhưng do các tác nhân khác nhau gây ra Triệu chứng bên ngoài vẫn có thể biến đổi ít nhiều

tùy thuộc vào đặc điểm của giống cây, kỹ thuật canh tác và yếu tố ngoại cảnh Do đó, trong những trường hợp phức tạp cần phải tiến hành chẩn đoán bệnh bằng các phương pháp bổ sung khác

2.3.2 Phương pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị (Vũ Triệu Mân, 2003)

Cây chỉ thị là những cây ký chủ nhưng có triệu chứng bệnh rất điển hình và biểu hiện bệnh nhanh chóng Phương pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị là một phương pháp khá chính xác trong nghiên cứu bệnh virus thực vật Đối với virus cây chỉ thị được chia làm hai nhóm:

Nhóm cây nhiễm bộ phận: là những cây chỉ thị mà khi truyền bệnh nhân tạo sẽ có vết chết cục bộ ngay trên bề mặt lá mà không di chuyển đến những bộ phận khác của cây

Nhóm cây nhiễm hệ thống: là những cây chỉ thị mà khi truyền bệnh nhân tạo sẽ tạo sự chết hệ thống trên toàn cây

2.3.3 Phương pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử (Vũ Triệu Mân, 2003)

Trong tế bào ký chủ, virus thường ở dạng kết tinh vô định hình hoặc có hình dạng đặc trưng bởi vô số cá thể virus kết hợp với nhau Các tinh thể này đôi khi rất khó quan sát thấy Vì vậy, để tìm hiểu hình thái và cấu trúc của virus thực vật cũng như mô thực vật bị nhiễm bệnh, người ta sử dụng kính hiển vi điện tử với độ phóng đại lớn

Phương pháp trực tiếp và đơn giản nhất là sử dụng dung dịch chứa virus chiết từ lá cây bệnh hay đã được làm tinh khiết cố định bằng hóa chất trên lưới đồng để quan sát dưới kính hiển vi điện tử

Có thể sử dụng kháng huyết thanh khi dùng phương pháp xem trực tiếp để phân biệt trong trường hợp nghi ngờ mẫu có lẫn virus khác

Ngoài ra người ta còn dùng lát cắt mỏng bằng máy cắt tiêu bản hiển vi và nhuộm mẫu được cắt, sau đó quan sát sự hiện diện của virus trong các tế bào thực vật bị nhiễm bệnh được cắt

2.3.4 Phương pháp ELISA (Vũ Triệu Mân, 2003)

Phương pháp ELISA có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung đều dựa trên cơ sở sự bắt cặp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện

Phương pháp ELISA cho phép phát hiện và định lượng các thành phần như là: peptide, kháng nguyên, kháng thể, enzyme, hormone…1978 Clark và Adam đã thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật ELISA để chuẩn đoán bệnh virus hại khoai tây và từ đó kỹ thuật này được công nhận là có độ chính xác cao hơn các phương pháp huyết thanh học thông thường

Kỹ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml) So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ RIA (Radio Immuno Assay) thì kỹ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn nhưng vẫn đảm bảo độ chính xác như nhau

Thành phần cơ bản của phản ứng ELISA gồm: kháng nguyên, kháng thể, và cơ chất tạo màu Có 3 phương pháp chính làm nền tảng cho tất cả các dạng ELISA là:

ELISA trực tiếp (Direct ELISA): Đây là dạng đơn giản nhất của phương pháp ELISA Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ được phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã được gắn enzyme)

ELISA gián tiếp (Indirect ELISA): Phương pháp này khác ELISA trực tiếp ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không được gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể được gắn với enzyme)

Sandwich ELISA: Đây là một dạng ELISA được sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy Kết quả thí nghiệm được đánh giá thông qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (kháng thể sơ cấp) và kháng thể phát hiện (kháng thể thứ cấp)

Kĩ thuật này cũng được phân làm hai dạng: Direct sandwich ELISA Indirect sandwich ELISA

2.3.5 Phương pháp RT – PCR

2.3.5.1 Nguyên tắc của phương pháp PCR (Bùi Chí Bửu, 1999)

Khi DNA polymerase hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt

Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Do đó nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đủ để thiết kế các mồi bổ sung chuyên biệt Các mồi này bao gồm một mồi xuôi (sens primer hay forward primer) và một mồi ngược (antisens primer hay reverse primer)

PCR được thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo 3 bước sau:

Biến tính phân tử DNA (Denature)

Sự bắt cặp giữa mồi và mạch khuôn (Annealing) Tổng hợp mạch mới (Extension)

Ba bước này hợp thành một chu kì và được lặp lại nhiều lần

Những phản ứng này được thực hiện nhờ một enzyme polymerase chịu

nhiệt (Taq polymerase) và sự thay đổi chu kì nhiệt hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho

quá trình biến tính và bắt cặp

2.3.5.2 Nested PCR (Mc Pherson M.J., 2000)

Đây là dạng cải biến của phương pháp PCR, trong đó phản ứng sẽ được thực hiện lần lượt với hai hay nhiều cặp mồi, sau đó các mồi còn lại sẽ khuếch đại những đoạn nằm bên trong của sản phẩm PCR ban đầu bằng cách sử dụng sản phảm PCR đầu tiên này làm khuôn mẫu

Phương pháp nested – PCR cũng có thể thực hiện với một cặp mồi đầu tiên và một mồi đơn cho phản ứng nested – PCR sau đó Phương pháp này được gọi là Heminested – PCR (HN – PCR)

Với phương pháp này, độ đặc hiệu của phản ứng tăng lên nhiều do mồi “nested” sẽ loại bỏ hầu như tất cả các sản phẩm không đặc hiệu của lần PCR đầu tiên Tuy nhiên sử dụng nhiều mồi nên độ nhạy của phản ứng cũng tăng lên, do đó phản ứng dễ nhiễm hơn so với PCR thông thường Vì vậy phải hết sức cẩn thận khi thao tác ở từng giai đoạn PCR

2.3.5.3 RT – PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction)

Cùng với các phương pháp: Real Time PCR, Nested PCR thì RT – PCR là một cải biến của phương pháp PCR thông thường nhằm đáp ứng những mục đích sử dụng khác nhau

Do Taq polymerase không hoạt động trên RNA nên người ta sử dụng kỹ

thuật RT – PCR Trước hết RNA được chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược Mồi sử dụng trong giai đoạn này có thể là mồi “ngược” của PCR giai đoạn sau, có thể là oligonucleotide T (để bắt cặp với đuôi poly A của mRNA), mà cũng có thể là hexanucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) bắt cặp ngẫu nhiên với một

trình tự ngắn trên RNA Sau đó cDNA được khuếch đại nhờ Taq polymerase Người ta cũng có thể sử dụng Tth polymerase cho cả hai giai đoạn Kỹ thuật RT –

PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lượng rất thấp, không thể phát hiện bằng các phương pháp cổ điển như Northern blot (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

RT – PCR một bước: trong kỹ thuật RT – PCR một bước quá trình tổng

hợp cDNA và quá trình khuếch đại diễn ra trong cùng một phản ứng

Hình 2.4 Quy trình RT – PCR một bước

RT – PCR hai bước: trong kỹ thuật này quá trình tổng hợp cDNA và quá trình khuếch đại diễn ra ở phản ứng tách biệt nhau

Hình 2.5 Quy trình RT – PCR hai bước

 Tổng hợp cDNA trên khuôn RNA gồm ba bước :

Ly trích RNA tổng số, trong đó có RNA của virus

Tổng hợp cDNA reverse transcriptase Tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm, primer để tổng hợp sợi DNA đầu tiên có thể được lai chuyên biệt với một gen đích hay có thể kết hợp với toàn RNA Có ba loại primer có thể dùng trong tổng hợp cDNA

(1) Oligo (dT): kết hợp với đuôi poly A của mRNA của động vật hữu nhũ (2) Primer chuyên biệt với trình tự đã chọn trên RNA đích

(3) Random hexanucleotide: có thể khởi đầu sự tổng hợp cDNA ở nhiều điểm trên RNA khuôn mẫu tạo ra nhiều đoạn bản sao của toàn phân tử RNA Chúng hữu dụng khi RNA đích là quá dài hay chứa quá nhiều cấu trúc bậc hai đến nỗi sự tổng hợp cDNA không bắt đầu hiệu quả bởi oligo (dT) hay primer chuyên biệt Trong hầu hết trường hợp, mục đích của những nhà nghiên cứu là tạo cDNA ban đầu dài và chứa nhiều thành phần của phân tử bổ sung với trình tự RNA đích Do đó primer chuyên biệt là lựa chọn tốt nhất Tiếp đến là oligo (dT) cũng tốt cho sự lựa chọn Random hexamer không chuyên biệt và tạo ra những phân tử cDNA dài, ngắn khác nhau được sử dụng khi những phương pháp kia không hiệu quả

 Khuếch đại cDNA lên nhiều bản bằng PCR Giai đoạn này gồm có 3 bước như sau:

Biến tính: chuyển dây đôi thành dây đơn

Bắt cặp: primer gắn vào vị trí chuyên biệt có trình tự bổ xung với nó trên cDNA khuôn mẫu

Kéo dài: kéo dài chuỗi mới nhờ enzyme polymerase

Ba giai đoạn này lặp lại nhiều lần, để tạo nhiều sản phẩm khuếch đại Ba giai đoạn này xảy ra trong điều kiện nhiệt độ khác nhau (thông thường: 94o

C, 55oC, 72oC) với sự trợ giúp của enzyme polymerase Sự lặp lại theo chu kỳ thường xảy ra khoảng 30 lần để làm tăng các DNA muốn có khoảng 100 triệu lần

Một kỹ thuật mới phát triển là kỹ thuật in situ RT – PCR cho phép khuếch

đại các RNA ngay trên mô và tế bào Kỹ thuật này có nguyên tắc như trên, được

tiến hành trên lát cắt mô, tế bào cố định trên lame, trong thiết bị PCR có bộ phận tạo nhiệt chuyên cho lame

2.4 Một số kết quả nghiên cứu về TSWV

2.4.1 Nghiên cứu nước ngoài

Sonya Broughton, Roger Jones và Brenda Coutts (2004) nghiên cứu về biện pháp quản lý bọ trĩ và bệnh TSWV

John M Sherman, James W Moyer, và Margaret E Daub (1998) khảo sát khả năng chống chịu của cây hoa cúc với sự biểu hiện gene N (Nucleocapsid) của virus TSWV

M T Momol, J E Funderburk, S Olson và J Stavisky (2002) đánh giá hiệu quả của việc sử dụng lớp phủ phản chiếu tia UV và sử dụng Acibenzolar – S – methyl nhằm quản lý TSWV

M D Bandla, L R Campbell, D E Ullman, và J L Sherwood (1997) sử dụng kỹ thuật điện di protein và phản ứng huyết thanh có đánh dấu huỳnh quang để nghiên cứu về sự tương tác giữa Glycoprotein của TSWV với thụ thể tiếp nhận ở thành dạ dày bọ trĩ

2.4.2 Nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu về virus nói chung và TSWV nói riêng còn khá mới, chủ yếu là những nghiên cứu ở các trường Đại học

Nguyễn Ngọc Bích, trường Đại học Nông Lâm Tp HCM (2003) bước đầu nghiên cứu một số bệnh virus (TSWV, CMV, TMV) bằng kỹ thuật DAS – ELISA

Trần Thị Thu Hà, trường Đại học Nông Lâm, Tp HCM (2005) điều tra bệnh TSWV trên cây thuốc lá trong vườn nhân giống cây con tại tỉnh Tây Ninh