Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh Virus

Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh Virus trên cây cà chua

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM BỆNH VIRUS (CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS VÀ TOMATO SPOTTED WILT VIRUS) TRÊN CÀ CHUA (Solanum lycopersicum) Ở TỈNH LÂM ĐỒNG BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2001-2005 Sinh viên thực hiện : LÂM NGỌC HẠNH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO TÓM TẮT ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM BỆNH VIRUS (CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS VÀ TOMATO SPOTTED WILT VIRUS) TRÊN CÀ CHUA (Solanum lycopersicum) Ở TỈNH LÂM ĐỒNG BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS BÙI CÁCH TUYẾN LÂM NGỌC HẠNH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 iii LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm tạ: Gia đình là chỗ dựa về vật chất và tinh thần cho tôi trong suốt thời gian học tập và làm luận văn. Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM. Ban Chủ Nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng toàn thể quý Thầy Cô trong bộ môn. PGS. TS. Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn tôi hoàn thành luận văn này. PGS. TS. Trần Thị Dân, TS. Đinh Duy Kháng, TS. Bùi Minh Trí, TS. Lê Đình Đôn, anh Nguyễn Đức Toàn đã tận tình giúp đỡ tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp này. Các thầy cô đã cho tôi nhiều kiến thức bổ ích. Anh Nguyễn Văn Sơn cùng các anh chị trong Chi Cục Bảo vệ Thực vật tỉnh Lâm Đồng đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn. Chú Nguyễn Văn Sang và các anh chị trong Phòng Nông Nghiệp huyện Đơn Dƣơng, anh Nguyễn Tấn Ngọc cùng các anh chị trong Phòng Nông Nghiệp huyện Đức Trọng đã tận tình hỗ trợ, chỉ dẫn tôi. Các thầy cô, anh chị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trƣờng Đại học Nông Lâm đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt luận văn. Tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 27 và tất cả các anh chị, bạn bè đã gắn bó, góp sức cùng tôi trong suốt thời gian học tập và làm luận văn vừa qua. iv TÓM TẮT Lâm Ngọc Hạnh. Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. Tháng 9/2005. ”Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus và Tomato Spotted Wilt Virus) trên cà chua (Solanum lycopersicum) ở tỉnh Lâm Đồng bằng kỹ thuật ELISA và bƣớc đầu xây dựng quy trình chẩn đoán virus Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT-PCR” đƣợc tiến hành tại huyện Đơn Dƣơng, huyện Đức Trọng và Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm, từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005. Thí nghiệm đƣợc thực hiện gồm 3 nội dung chính. 1. Mẫu đƣợc thu theo triệu chứng bệnh virus, mỗi ruộng 5 mẫu kết hợp với điều tra sơ bộ tình hình bệnh trên cà chua ở 21 thôn và 2 thị trấn thuộc huyện Đơn Dƣơng và Đức Trọng. Từ đó, đánh giá tình hình bệnh virus trên cà chua ở địa bàn nghiên cứu. 2. Xác định tác nhân gây bệnh virus chính trên cà chua (TMV, CMV, TSWV) bằng phƣơng pháp DAS-ELISA sử dụng kháng thể đa dòng. Mẫu đƣợc phân tích là những lá cà chua có triệu chứng bệnh virus. Mỗi mẫu lá đƣợc kiểm tra trên 3 virus để xác định có virus nào trong 3 virus trên nhiễm riêng lẻ hay đồng thời lên mẫu đang nghiên cứu hay không. 3. Mẫu dƣơng tính TMV đƣợc chọn để thực hiện RT-PCR nhằm bƣớc đầu xây dựng quy trình RT-PCR để chẩn đoán TMV. Từ đó, khẳng định lại kết quả ELISA đồng thời sản phẩm thu đƣợc từ RT-PCR sẽ đƣợc dùng cho những nghiên cứu xa hơn. Kết quả thu đƣợc: - Điều tra sơ bộ tình hình bệnh ở Đơn Dƣơng và Đức Trọng cho thấy tại thời điểm nghiên cứu cà chua ở Đức Trọng bị tàn phá nặng nề bởi bệnh virus trong khi cà chua ở Đơn Dƣơng vẫn tốt. - Kết quả DAS-ELISA cho thấy dịch bệnh virus ở Đức Trọng chủ yếu là do CMV gây ra. TMV có gây bệnh nhƣng ít hơn. TSWV chƣa gây bệnh ở khu vực này vào thời điểm nghiên cứu. - Bƣớc đầu tìm đƣợc một quy trình RT-PCR tạo ra sản phẩm khá đặc hiệu nhƣng chƣa khẳng định đƣợc đó là sản phẩm khuếch đại từ khuôn mẫu nào. v SUMMARY This is Lam Ngoc Hanh studying at Nong Lam University and finishing the thesis on 9 th , 2005. The thesis entitled “Diagnosing Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus and Tomato Spotted Wilt Virus by DAS-ELISA and formulating the RT-PCR process to diagnose Tobacco Mosaic Virus in Viet Nam”. This research was conducted from 3 th , 2005 to 8 th , 2005 at Don Duong, Duc Trong districts and in the laboratory of biotechnology and chemistry of Nong Lam University. The objects of this research are as follows: - Collecting the samples with the virus symptoms, 5 samples per each field and generally investigating the virus infection on tomato in Don Duong and Duc Trong districts so that the virus disease incidence in Don Duong and Duc Trong districts can be evaluated. - Diagnosing pathogens in tomato such as Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus and Tomato Spotted Wilt Virus by DAS-ELISA kit using polyclonal antibodies from rabbit. The samples tested are tomato leaves appearing the virus symptoms. Each sample is tested for Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus and Tomato Spotted Wilt Virus. - Samples of Tobacco Mosaic Virus positive are seleted to conduct the RT-PCR. We try to formulate the RT-PCR process used to both diagnose Tobacco Mosaic Virus and confirm DAS-ELISA results. The results of this research are as follows: - Through the general investigation on tomato in Don Duong and Duc Trong districts, we find out that tomato in Duc Trong have been severely destroyed by viruses. - DAS-ELISA result data show that Cucumber Mosaic Virus is the key pathogen creating virus disease epidemic in Duc Trong on 3 th , 2005 while Tobacco Mosaic Virus appears mildly and Tomato Spotted Wilt Virus is not found now in these areas. - Finding out the RT-PCR process that can amplify the pretty specific product but the product has not been confirmed yet. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Lời cảm tạ . . i Tóm tắt ii Tóm tắt bằng tiếng Anh iii Mục lục . . iv Danh sách các chữ viết tắt viii Danh sách các bảng, biểu đồ ix Danh sách các hình . x PHẦN I. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích yêu cầu . 2 1.2.1. Mục đích . 2 1.2.2. Yêu cầu . 2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Cà chua . 3 2.1.1. Sơ lƣợc về cà chua . 3 2.1.2. Tình hình phát triển của cà chua trên thế giới 3 2.1.3. Tình hình sản xuất cà chua ở Đà Lạt 4 2.2. Bệnh hại trên cà chua . 4 2.2.1. Sơ lƣợc về Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) . 6 2.2.1.1 Lịch sử của bệnh do TSWV gây ra . 6 2.2.1.2 Phân loại của TSWV 7 2.2.1.3 Phân bố về địa lý và tầm quan trọng về kinh tế 7 2.2.1.4 Dãy kí chủ của TSWV 8 2.2.1.5 Cấu tạo của TSWV . 8 2.2.1.6 Tính chất của TSWV 9 2.2.1.7 Vector truyền 9 vii 2.2.1.8 Điều kiện phát triển của bệnh do TSWV 10 2.2.1.9 Triệu chứng bệnh 11 2.2.1.10 Khống chế bệnh do TSWV . 11 Cây kháng 11 Quản lý TSWV . 12 2.2.2. Sơ lƣợc về Tobacco Mosaic Virus (TMV) . 14 2.2.2.1 Lịch sử của bệnh . 14 2.2.2.2 Phân loại của TMV . 14 2.2.2.3 Sự phân bố của TMV 14 2.2.2.4 Ký chủ của TMV 14 2.2.2.5 Đặc điểm cấu tạo của TMV 14 2.2.2.6 Tính chất của TMV . 16 2.2.2.7 Đặc điểm truyền bệnh 17 2.2.2.8 Sự phát sinh phát triển của TMV . 17 2.2.2.9 Triệu chứng bệnh do TMV . 17 2.2.2.10 Phòng trừ 19 2.2.3. Sơ lƣợc về Cucumber Mosaic Virus (CMV) . 19 2.2.3.1 Lịch sử của bệnh do CMV 19 2.2.3.2 Phân loại CMV . 20 2.2.3.3 Phạm vi phân bố . 21 2.2.3.4 Ký chủ . 21 2.2.3.5 Đặc điểm cấu tạo của CMV 21 2.2.3.6 Tính chất lý hóa của CMV . 23 2.2.3.7 Sự truyền bệnh 24 2.2.3.8 Điều kiện phát triển của bệnh . 24 2.2.3.9 Triệu chứng 25 2.2.3.10 Phòng trừ . 25 2.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh virus trên thực vật 26 2.3.1. Phƣơng pháp chẩn đoán nhanh bằng cây chỉ thị 26 viii 2.3.2. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng chỉ thị màu . 26 2.3.3. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng học 26 2.3.4. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào kháng huyết thanh . 27 2.3.4.1 Phƣơng pháp Direct ELISA. . 28 2.3.4.2 Phƣơng pháp Indirect ELISA 28 2.3.4.3 Phƣơng pháp Sanwich ELISA. . 28 Direct Sanwich ELISA hay DAS-ELISA (Double antibody sandwich-ELISA) 28 Indirect Sanwich ELISA 28 2.3.4.4 Tissue blot immunoassay (TIBA) . 28 2.3.4.5 Quartz crystal microbalance (QCM) immunosensor 28 2.3.5. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào trình tự đoạn DNA. . 29 2.3.5.1 Phƣơng pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphirm) 29 2.3.5.2 Phƣơng pháp PCR hay RT-PCR đối với RNA . 29 2.3.5.3 Các kỹ thuật liên quan đến PCR khác . 29 2.3.5.4 Phƣơng pháp sử dụng probe đánh dấu . 29 2.3.5.5 Array . 29 2.4. Phƣơng pháp DAS-ELISA và phƣơng pháp RT-PCR . 30 2.4.1. Phƣơng pháp DAS-ELISA . 30 2.4.2. Phƣơng pháp RT-PCR . 30 2.5. Một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về bệnh do CMV, TMV và TSWV gây ra trong thời gian gần đây 32 2.5.1. Ở nƣớc ngoài 32 2.5.2. Ở Việt Nam 33 PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 34 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện . 34 3.1.1. Thời gian thực hiện đề tài 34 3.1.2. Địa điểm thực hiện đề tài . 34. ix 3.2. Vật liệu . 34 3.2.1. Dụng cụ 34 3.2.2. Hóa chất 34 3.3. Phƣơng pháp . 35 3.3.1. Điều tra và lấy mẫu . 35 3.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 35 3.3.2.1 Chẩn đoán bằng DAS-ELISA . 35 3.3.2.2 Chẩn đoán bằng RT-PCR . 36 Ly trích RNA . 36 Phản ứng reverse transcriptase (RT) tạo cDNA 37 Phản ứng PCR 38 3.3.2.3 Phân tích sản phẩm PCR . 44 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 4.1. Phản ứng ELISA . 46 4.1.1. Kết quả ELISA . 46 4.1.2 Tỷ lệ các mẫu nhiễm hỗn hợp virus CMV và TMV so với các mẫu nhiễm chỉ CMV hay TMV 47 4.1.3. Tỷ lệ bệnh theo tuổi cây thể hiện trong số mẫu điều tra 48 4.1.4. Tỷ lệ bệnh theo địa điểm thể hiện trong số mẫu điều tra . 49 4.1.5. Tỷ lệ bệnh theo giống cà thể hiện trong số mẫu điều tra 51 4.1.6. Triệu chứng thực tế trong các mẫu thí nghiệm 52 4.1.7. Tỷ lệ bệnh theo loại triệu chứng quan sát đƣợc . 53 4.2. Kết quả của phản ứng RT-PCR 57 Kết quả RT-PCR sử dụng cặp primer 1 . 57 Kết quả RT-PCR sử dụng 2 cặp primer 2 và 3 . 62 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 70 5.1. Kết luận 70 5.2. Đề nghị . 71 PHẦN VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 1 2 x PHỤ LỤC 1 Thành phần các dung dịch trong phản ứng ELISA . 76 PHỤ LỤC 2 Thành phần các chất trong kit tổng hợp iScriptTM. . 77 PHỤ LỤC 3 Thành phần các hóa chất trong phản ứng PCR . 78 PHỤ LỤC 4 Hình chụp các đĩa chứa mẫu phân tích bằng ELISA 79 PHỤ LỤC 5 Bảng câu hỏi điều tra . 80 PHỤ LỤC 6 Danh sách các trình tự tƣơng đồng với TMV dòng ở Trung Quốc dùng để thiết kế primer. . 81 [...]... phòng chống bệnh virus cho cây trồng Xuất phát từ tình hình phát triển của cà chua và bệnh virus trên cà chua mà chúng tôi thực hiện đề tài: Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus và Tomato Spotted Wilt Virus) trên cà chua (Solanum 2 lycopersicum) ở tỉnh Lâm Đồng bằng kỹ thuật ELISA và bƣớc đầu xây dựng quy trình chẩn đoán virus Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ... gồm: bệnh khảm vàng (TMV: Tomato Mosaic Virus) , bệnh khảm mảng lồi lõm (CMV: Cucumber Mosaic Virus) , bệnh đốm héo (TSWV: Tomato Spotted Wilt Virus) , bệnh xoăn ngọn cà chua (TLCV: Tomato Leaf Curl Virus) , bệnh xoăn vàng ngọn (TYLCV: Tomato Yellow Leaf Curl Virus) , bệnh đốm hình nhẫn (TRSV: Tomato Black Ring Virus) , bệnh lùn bụi cà chua (TBSV: Tomato Bushy Stunt Virus) và virus X, Y của khoai tây (5) Bệnh. .. VIẾT TẮT CMV: Cucumber Mosaic Virus TMV: Tobacco Mosaic Virus TSWV: Tomato Spotted Wilt Virus CTV: Citrus Tristeza Virus TLCV: Tomato Leaf Curl Virus (bệnh xoăn ngọn cà chua) TYLCV: Tomato Yellow Leaf Curl Virus (bệnh xoăn vàng ngọn), TRSV: Tomato Black Ring Virus (bệnh đốm hình nhẫn) TBSV: Tomato Bushy Stunt Virus (bệnh lùn bụi cà chua) PV Y: Potato Virus Y PV X: Potato Virus X DMSO: dimethyl sufoxide... phát hiện CMV (Cucumber Mosaic Virus) , TMV (Tobacco Mosaic Virus) và TSWV (Tomato Spotted Wilt Virus) trong mẫu lá nghi ngờ bệnh virus bằng kỹ thuật DAS - ELISA (double antibody sanwich - enzyme linked immunosorbent assay) Từ đó, đánh giá tình hình bệnh ở khu vực nghiên cứu - Bƣớc đầu xây dựng quy trình chẩn đoán TMV bằng RT - PCR 1.2.2 Yêu cầu - Xác định tỉ lệ bệnh do các virus TMV, CMV, TSWV gây ra... nhiều bệnh, bao gồm bệnh do ký sinh (nhƣ nấm, vi khuẩn, virus, mycoplasma, tuyến trùng) và bệnh không do ký sinh (nhƣ độ ẩm của đất, nhiệt độ, ánh sáng không thích hợp hay bởi sự mất cân bằng dinh dƣỡng) Bệnh do virus gây ra là khó khống chế nhất và có thể tạo ra tổn thất rất nặng nề khi bệnh lan ra thành dịch Trong 10 năm trở lại đây, bệnh virus thực vật đã lan rộng hơn và xuất hiện nhiều dịch bệnh virus. .. bọ phấn càng cao thì tỷ lệ cây bị bệnh xoăn lá càng nhiều Bệnh phát triển nhiều trong điều kiện thời tiết ấm áp, nhiệt độ từ 20 - 30oC, nhiều nắng, ít mƣa Tỷ lệ mắc bệnh và tính nghiêm trọng của bệnh thay đổi từ mùa này sang mùa khác vì những mối quan hệ phức tạp (2) Bệnh virus hại cà chua Bệnh virus hại cà chua là 1 tập đoàn có rất nhiều bệnh hại, trong đó các loại virus quan trọng gây ra rất nhiều... 1980 để mô tả tình cảnh bi kịch do bệnh AIDS gây ra Sau đó, thuật ngữ này dƣờng nhƣ trở nên thích hợp với tình hình dịch bệnh virus trên cây trồng Ba virus điển hình cho thuật ngữ này là CMV, TMV, CTV vì ba virus này phân bố rất rộng về địa lý, rất dễ gây ra dịch bệnh cho những cây trồng quan trọng về kinh tế TSWV (có khi đƣợc gọi là “Super virus ) trong những năm gần đây lại gây dịch bệnh nghiêm trọng... tƣợng có giá trị kinh tế cao là cà chua và thuốc lá Ngƣời ta xếp TSWV vào loại “re - emerging plant virus Hiện nay, ba virus CMV, TMV, TSWV đang gây bệnh rất nguy hiểm trên cà chua 2.2.1 Sơ lƣợc về Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) 2.2.1.1 Lịch sử của bệnh do TSWV gây ra Trƣớc đây, virus TSWV đƣợc báo cáo dƣới nhiều tên khác nhau, ví dụ: virus đồng thau cà chua (Tomato Bronzing Virus) , Kromnek Virus, ... bị phá bỏ vì bệnh virus Ƣớc tính vào tháng 3 năm 2005 có khoảng 27 ha cà chua bị nhiễm bệnh virus (gần 100%) ở Đức Trọng (Nguồn: Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật Tỉnh Lâm Đồng) 2.2 Bệnh hại trên cà chua Bệnh cà chua trở thành yếu tố giới hạn trong sản xuất cà chua ở nhiều vùng trên thế giới Gần 200 bệnh cà chua đã đƣợc biết đến do những nguyên nhân khác nhau gây ra 5 Có 2 nhóm nguyên nhân gây bệnh chính trên... hơn những triệu chứng gây ra bởi ký sinh và gây khó khăn thêm cho việc chẩn đoán bệnh cho cây trồng Riêng đối với bệnh virus thì trên cây cà chua vùng nhiệt đới có rất nhiều loại virus gây hại nhƣ CMV (Cucumber Mosaic Virus) , TMV (Tobacco Mosaic Virus) , TSWV (Tomato Spotted Wilt Virus) , CTV (Citrus Tristeza Virus) Các virus này gây ra những triệu chứng tƣơng đối giống nhau là lá vàng loang lổ, xoăn, . Chí Minh. Tháng 9/2005. Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus và Tomato Spotted Wilt Virus) trên cà chua (Solanum. chống bệnh virus cho cây trồng. Xuất phát từ tình hình phát triển của cà chua và bệnh virus trên cà chua mà chúng tôi thực hiện đề tài: Đánh giá tình trạng