Dƣới kính hiển vi điện tử CMV có dạng hình cầu, đƣờng kính 28nm. Virion của CMV không có vỏ (Hình 2.8). Có nhiều loại virion nhƣng kích thƣớc tƣơng đối giống nhau. Các nucleocapsid của CMV giống nhau và không phát hiện đƣợc thông qua thuốc nhuộm. Có 32 capsomer trên một nucleocapsid. CMV có nhiều chủng loại gây bệnh trên
nhiều loại cây trồng khác nhau. Bao gồm các chủng Y, M, S, Q. Chúng khác nhau về đặc tính sinh học.
Hình 2.8 Cấu tạo của CMV
(Nguồn: Smith, T, J., Chase, E., Schmidt, T., Perry, K., 2000).
Virion chứa 18% nucleic acid. Virion chứa 3 đoạn RNA sợi đơn positive - sense thẳng (RNA1, RNA2 và RNA3). Phân tử lƣợng 5,8 - 6,7x10-6. Cucumovirus cần 3 RNA sợi đơn có chức năng để gây nhiễm là RNA 1, 2 và 3. Chiều dài tổng cộng của genome là 8.621 nucleotide. Đoạn RNA lớn nhất có kích thƣớc là 3.383 nucleotide (RNA1); đoạn thứ 2 là 3.012 nucleotide (RNA2); đoạn thứ ba là 2.199 nucleotide (RNA3); đoạn thứ tƣ là 1000 nucleotide (RNA4). MRNA mã hóa cho protein vỏ (RNA4, một đoạn của RNA3). Tỷ lệ cơ bản của các nucleic acid là 24% Guanine; 23% Adenine; 23% Cytosine; 30% Uracil. Đầu 5’ của genome có một mũ hay còn gọi là protein liên kết với genome (VPg). Trình tự mũ là m7G5’ppp5 (trên cả 4 RNAs). CMV không có poly A ở đầu 3’. Đầu 3’ của tất cả các RNA của CMV đều có cấu trúc giống tRNA (cấu trúc nhận tyrosine). Không tìm thấy nucleic acid nào trong virion mà không thuộc genome của virus. Nucleic acid của genomic và subgenomic đều đƣợc đóng gói. Sub - genomic mRNA đƣợc tìm thấy
trong các tế bào nhiễm. Genome đƣợc chia thành ba loại phân tử khác nhau (mỗi loại chứa một phân tử RNA1, hoặc một phân tử RNA2, hay một trong hai phân tử RNA3 và RNA4). Mảnh RNA thứ tƣ (RNA4) mã hóa một protein là một protein vỏ đƣa tin, thành phần RNA thứ 5 là CARNA 5 (RNA5 kết hợp với CMV) nhƣng cũng đƣợc gọi là RNA vệ tinh
Virion chứa 82% protein. CMV mã hóa cho 5 protein trên 3 RNA. RNA1 chỉ là RNA đơn cistron, mã hóa cho protein 1a. Protein này cần cho sự tái bản của virus và chứa methyl transferase và helicase motif (Kadaré và Haenni, 1997; Rozanov và cộng sự,
1992). RNA2 mã hóa cho 2a protein có kích thƣớc là 31kDa, một polymerase của virus (Ishihama and Barbier, 1994; O’Reilly và Kao, 1998), và 2b protein, đƣợc biểu hiện từ sự dƣ thừa của subgenomic RNA là RNA 4A (Ding và cộng sự, 1994). Khung đọc (ORF) 2b đƣợc đè lên (overprinted) đầu carboxy của khung đọc 2a. Khung đọc này không đƣợc tìm thấy trong tất cả các thành viên của giống Bromoviridae mặc dù có một khung đọc ở vị trí tƣơng tự đƣợc tìm thấy ở Tobacco streak virus, một thành viên của giống Ilarvirus. 2b
protein của dòng CMV thuộc nhóm phụ thứ II đƣợc thấy là ức chế sự yên lặng sau dịch mã của ký chủ (post - transcriptional gene silencing (PTGS)) (Béclin và cộng sự, 1998; Brigneti., và cộng sự, 1998). RNA3 mã hóa cho protein di chuyển (movement protein) (MP) có kích thƣớc là 9,9kDa đƣợc biểu hiện từ đầu 5’ của khung đọc và protein vỏ (coat protein) (CP) đƣợc biểu hiện từ subgenomic RNA4. Cả hai protein này đều cần cho sự di chuyển của CMV (Canto và cộng sự, 1997). Virion không chứa lipid. Nucleic acid có thể gây nhiễm (không cần protein vỏ hay mRNA4 cho sự nhiễm).
CMV có thể che dấu một phân tử ký sinh khác là RNA vệ tinh (satellite RNA (satRNA)). SatRNA của CMV không mã hóa một protein nào mà nó phụ thuộc vào RNA để có hoạt động sinh học. SatRNA của CMV là những RNA thẳng, nhỏ, không có khả năng mã hóa (Garcisa - Arenal và Palukaitis, 1999; Roossinck và cộng sự, 1992).
2.2.2.6 Tính chất lý hóa của CMV
Tỷ trọng nổi là 1,367g/cm3 trong CsCl (sau khi cố định với formaldehyde). Điểm đẳng điện ở pH 5,5 (dòng Q). Tỷ số A260/A280 là 1,7. TIR: 55 - 70o
C. LIV: 1 - 10 ngày. DEP: log10 chia cho 3 - 6. Khả năng nhiễm qua nhựa không thay đổi khi xử lý với di - ethyl ether. Khả năng nhiễm vẫn duy trì hoặc giảm khi phân giải với protease nhƣng vẫn duy trì khi xử lý với phenol hay chất tẩy rửa (detergent).
2.2.2.7 Sự truyền bệnh
Virus truyền chủ yếu qua tiếp xúc cơ học từ cây bệnh sang cây khỏe thông qua vết thƣơng cơ giới. Virus truyền qua khoảng 10 loại Cucusta.
Virus có thể truyền từ cây lâu năm và cây dại sang các cây trồng khác nhờ côn trùng môi giới. Chúng lan truyền chủ yếu nhờ rệp đào theo kiểu kém bền vững (Lucas, 1975; Agrios, 1997; Davis và Nielsen, 1999; Hull, 2002). Trên 60 loại côn trùng là vectơ
của virus này, gồm Acyrthosiphon pisum, Aphis craccivora và Myzus persicae (chúng
truyền bệnh qua những gai nhỏ).
Vì dãy kí chủ rộng của CMV mà nhiều loài cỏ có thể là nguồn chứa CMV và góp phần vào sự truyền bệnh của virus này. Nhìn chung CMV cần một thời kì tạo vỏ trong khoảng 1 phút nhƣng khả năng truyền bệnh giảm xuống và bị mất sau vài giờ. Hiệu quả truyền bệnh khác nhau tùy theo loại virus, dòng virus, loài cây kí chủ, điều kiện môi trƣờng và thời gian trong năm. Sự nhiễm virus của cà chua bởi rệp không phổ biến vì cà chua không phải là kí chủ yêu thích của rệp. Rệp thƣờng định cƣ trên dƣa chuột, dƣa hấu và bí. Ngƣời ta thấy, CMV đƣợc truyền dễ dàng bằng cơ học nhƣng vì không phải là virus bền vững nhƣ TMV nên CMV không đƣợc truyền bởi những công nhân tiếp xúc với cây bệnh. CMV không truyền qua hạt cà chua.
2.2.2.8 Điều kiện phát triển của bệnh do CMV
Nguồn bệnh có thể tồn tại quanh năm. Bệnh lan truyền mạnh vào mùa đông và mùa xuân khi rệp xuất hiện nhiều. Bệnh hại nặng trên một số cây rau vụ đông trồng muộn. Cây non mẫn cảm với bệnh hơn cây trƣởng thành.
2.2.2.9 Triệu chứng
Hình 2.9 Triệu chứng điển hình của CMV ở cà chua
(Nguồn: AVRDC - the World Vegetable Center, 2004).
Triệu chứng của CMV có thể bị nhầm lẫn với các triệu chứng do virus khác gây ra nhƣ: TEV (Tobaco Etch Virus), TMV. Tuy nhiên, quan sát kỹ ta thấy trên lá cà chua triệu chứng biểu hiện rõ ràng hơn. Cà chua bị nhiễm CMV biểu hiện những thay đổi bệnh lý. Đầu tiên, trên lá xuất hiện đốm và khảm nhẹ, chúng tăng lên dần cùng với sự phát triển của bệnh. Những lá mới hình thành có hình dạng sợi kéo dài ra một cách bất thƣờng (thùy lá co lại hình sợi) (Hình 2.9). Triệu chứng này có thể tƣơng tự nhƣ triệu chứng gây ra bởi TMV - dạng lá dƣơng xỉ. Ở dạng lá dƣơng xỉ, phiến lá non không bị ức chế hoàn toàn nhƣ
ở dạng lá non có hình sợi nhƣng nó dài và hẹp bất thƣờng. Những triệu chứng gây ra bởi CMV có thể là triệu chứng chuyển tiếp: lá ở tầng dƣới và lá non ở trên đỉnh có biểu hiện triệu chứng nặng; ngƣợc lại lá ở tầng giữa có thể biểu hiện bình thƣờng. Cây bệnh có màu vàng, lùn, khoảng cách giữa các đốt ngắn lại. Những dòng độc có thể gây ra hoại tử dọc theo mạch dẫn của lá, những sọc hoại tử dọc theo thân và chết đầu rễ. Hoa bị biến dạng, thƣờng không cho quả. Nếu cây hình thành quả thì quả nhỏ, màu nhợt nhạt, lớn chậm. Nếu cây bị nhiễm cả CMV và TMV thì không đậu quả. Cây nhiễm bệnh càng sớm thì thiệt hại càng nặng. Mức độ thiệt hại phụ thuộc vào số cây bị nhiễm.
SatRNA có thể có ảnh hƣởng rất lớn lên triệu chứng gây ra bởi CMV từ yếu cho đến nghiêm trọng (Yoshida và cộng sự, 1985). Một vài RNA vệ tinh có tác động tăng cƣờng triệu chứng nhƣ cây lùn hơn hay có loại RNA vệ tinh gây mất diệp lục, có loại gây hoại tử nghiêm trọng. Một vụ bùng phát mạnh của những vết bệnh lý bị hoại tử nặng đã ảnh hƣởng đến hàng ngàn hecta cà chua ở miền Nam của Ý vào năm 1988 gắn liền với sự xuất hiện của CMV và RNA vệ tinh. Mặt khác nhiều vệ tinh lại loại bỏ một phần hay toàn bộ triệu chứng bình thƣờng của CMV tạo ra một cây bị nhiễm nhƣng trông vẫn khoẻ mạnh.
Bên trong tế bào, virion đƣợc tìm thấy trong không bào và trong tế bào chất của cây. Thể vùi có mặt trong các tế bào nhiễm. Thể vùi là những tinh thể trong tế bào chất (thƣờng có hình thoi, hình lục giác hay hình cầu) hoặc xuất hiện nhƣ những thể rỗng, chúng chứa virion.
2.2.2.10 Phòng trừ
- Dùng giống kháng bệnh, giống sạch bệnh.
- Vì hầu hết sự nhiễm ban đầu đều xuất phát từ những cây cỏ lâu năm nên việc loại bỏ những cây cỏ này thì có lợi hơn là phun thuốc diệt côn trùng. Việc loại bỏ những cây cỏ lâu năm hay cây hai năm chính đang sống ở gần cây trồng có thể làm giảm áp lực lên virus. Áp dụng thuốc diệt côn trùng và xịt dầu khoáng đƣợc sử dụng để khống chế virus này cũng nhƣ những virus đƣợc truyền theo kiểu không bền vững khác. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Phun thuốc trừ rệp. Khử trùng phƣơng tiện thu hái. Hạn chế gây vết thƣơng, xây xát trong quá trình chăm sóc.
- Chăm sóc để cây sinh trƣởng phát triển tốt, bảo vệ cây, tránh nhiễm CMV vào giai đoạn cây con.
2.3 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh virus trên thực vật 2.3.1 Phƣơng pháp chẩn đoán nhanh bằng cây chỉ thị 2.3.1 Phƣơng pháp chẩn đoán nhanh bằng cây chỉ thị
Đối với virus, có 2 nhóm chỉ thị: Nhóm chỉ thị theo bộ phận và nhóm chỉ thị theo hệ thống. Trong đó, nhóm chỉ thị theo bộ phận là những cây chỉ thị mà khi ta truyền bệnh nhân tạo sẽ có vết chết cục bộ ngay trên bề mặt lá mà không di chuyển đến những bộ phận khác của cây. Ví dụ nhƣ cây cà độc dƣợc (Datura stramonium) khi bị nhiễm TMV sẽ xuất hiện những vết đốm chết hình tròn trên mặt lá sau khi lây bệnh từ 3 - 5 ngày trong điều kiện nhiệt độ 25 - 30oC. Nhóm chỉ nhóm thị theo hệ thống là những cây chỉ thị mà khi ta truyền bệnh nhân tạo sẽ tạo sự chết hệ thống trên toàn cây.
2.3.2 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng chỉ thị màu
Đây là phƣơng pháp chẩn đoán có độ chính xác thấp, thƣờng chỉ đạt 70 - 90%. Chính vì vậy phƣơng pháp này chỉ sử dụng cho việc chẩn đoán ban đầu. Phổ biến là phƣơng pháp nhuộm màu bằng sunfat đồng. Các tế bào của cây họ bầu bí, cà khi bị nhiễm bệnh sẽ bị nhuộm màu nâu đỏ còn tế bào của cây khỏe chỉ có màu nâu hay không nhuộm màu. Ngƣời ta thƣờng dùng CuSO4.5H2O 3% để chẩn đoán cây nhiễm CMV.
2.3.3 Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng
Triệu chứng ngoài: Các triệu chứng phổ biến là cây lùn hoặc thấp, khảm, vàng úa, úa vàng mạch dẫn, sáng gân lá, đốm vòng, chết hoại lƣu dẫn hoặc chết tế bào, biến dạng lá hoặc thân, khối u bên ngoài trên lá hoặc rễ, nứt cánh hoa hay hoa.
Triệu chứng bên trong: Sự thay đổi tế bào và mô có thể quan sát qua kính hiển vi quang học hay kính hiển vi điện tử. Ngƣời ta còn quan sát những cấu trúc khác nhau do virus sản sinh ra, thƣờng là những thể vùi.
2.3.4 Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào kháng huyết thanh
Nguyên tắc của phƣơng pháp là khi đƣa một protein lạ vào cơ thể động vật, cơ thể động vật sẽ sinh ra một kháng thể để chống lại sự xâm nhập đó, gọi là phản ứng miễn dịch
của cơ thể động vật. Ứng dụng phản ứng miễn dịch này, ngƣời ta đã đƣa những kháng nguyên virus thực vật vào cơ thể động vật rồi lấy kháng huyết thanh ra để thực hiện việc chẩn đoán, phát hiện bệnh hại thực vật.
Các phƣơng pháp chẩn đoán bằng huyết thanh thông thƣờng nhƣ làm phản ứng trên lam kính hiển vi, làm phản ứng kết tủa trong ống nghiệm, làm phản ứng huyết thanh trên nền thạch, phƣơng pháp khuếch tán gel miễn dịch và phƣơng pháp điện di miễn dịch.
Phƣơng pháp miễn dịch liên kết enzym (enzym linked immunosorbent assay - ELISA) có độ tin cậy cao hơn phƣơng pháp huyết thanh thông thƣờng. Thực chất, ELISA là phƣơng pháp kháng huyết thanh cao cấp, sử dụng kháng thể globulin và nghiên cứu chẩn đoán protein.
Kháng thể sẽ đƣợc cố định trên bề mặt giếng trong một đĩa (microtitre plate) và dịch chiết từ cây đƣợc cho vào giếng. Nếu virus đang nghiên cứu có mặt trong cây thì nó sẽ kết hợp với kháng thể đã đƣợc cố định trên bề mặt. Bất kỳ phần nào của dịch chiết mà không đƣợc kết hợp sẽ bị rửa trôi đi trƣớc khi thêm kháng thể thứ cấp vào. Kháng thể thứ cấp cho phép phát hiện virus một cách gián tiếp bởi vì có một enzyme dính vào. Enzyme này sẽ tác động lên một cơ chất (substract) và làm đổi màu của cơ chất. Sự thay đổi màu này sẽ đƣợc phát hiện bằng máy đo ảnh phổ (spectrophotometer).
Sử dụng phƣơng pháp ELISA có các thuận lợi nhƣ:
- Đơn giản: Chỉ sử dụng đĩa ELISA và một vài thiết bị liên quan. - Nhanh
- Rẻ
- Có thể sử dụng kit. Hiện nay, hầu nhƣ ngƣời ta chỉ sử dụng kit.
- Có thể kiểm tra nhiều mẫu cùng một lúc (27 mẫu với 1 lần lặp lại trên mỗi đĩa) Có 3 phƣơng pháp ELISA cơ bản.
2.3.4.1 Phƣơng pháp Direct ELISA.
- Ƣu điểm: Đơn giản nhất - Nhƣợc điểm:
+ Độ đặc hiệu bị giới hạn vì thƣờng thì kháng nguyên có ít nhất là 2 epitope (trình diện kháng nguyên) mà phƣơng pháp này chỉ sử dụng 1 kháng thể gắn vào một epitope.
+ Tốn công: phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối tƣợng.
2.3.4.2 Phƣơng pháp Indirect ELISA
- Ƣu điểm: Kháng thể gắn enzyme có thể sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên nên tiện lợi và kinh tế hơn, dễ dàng thƣơng mại hóa.
- Nhƣợc điểm: Độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác nhau. Điều này dẫn đến kết quả khác nhau giữa các thí nghiệm và do đó cần phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết thanh khác nhau để kết quả có thể tin tƣởng đƣợc.
2.3.4.3 Phƣơng pháp Sanwich ELISA.
Có thể chia thành 2 hệ thống:
Direct Sanwich ELISA hay DAS - ELISA (Double antibody (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
sandwich - ELISA)
- Ƣu điểm: Có thể phát hiện sự khác biệt nhỏ giữa các kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện khác nhau.
- Vì phƣơng pháp này có ƣu điểm hơn hẳn những phƣơng pháp khác mà chúng tôi chọn phƣơng pháp này để chẩn đoán bệnh virus đang nghiên cứu.
Chú ý: nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện giống nhau có thể dẫn đến vấn đề nếu có sự giới hạn vị trí kết hợp sẵn có để phát hiện. Mối quan hệ về kích thƣớc và vị trí không gian của các epitope cũng có ảnh hƣởng đến thử nghiệm.
Indirect Sanwich ELISA
Chuyên biệt hơn Direct sanwich ELISA do antispecies kháng thể đƣợc gắn enzyme không phản ứng với kháng thể bắt kháng nguyên.
Ngoài ELISA, còn hai phƣơng pháp đáng tin cậy nữa là: tissue blot immunoassay (TIBA) và quartz crystal microbalance (QCM) immunosensor.
2.3.4.4 Tissue blot immunoassay (TIBA):
Cũng giống nhƣ ELISA, TIBA sử dụng kháng thể chống lại virus. Nhựa từ cây đƣợc chuyển lên một màng nylone hay nitrocellulose và virus đƣợc phát hiện nhờ vào
mẫu dò đƣợc đánh dấu. Quy trình này không cần nhiều thao tác nhƣ ELISA, nhanh, nhạy, đơn giản (không cần dịch chiết của virus), không đắt tiền (chỉ cần số lƣợng trang thiết bị tối thiểu), thích hợp cho khảo sát 1000 - 2000 mẫu trên ngày. Kit cũng đã sẵn có cho nhiều virus.
2.3.4.5 Quartz crystal microbalance (QCM) immunosensor
Trong kỹ thuật phát hiện virus thực vật mới này, một đĩa tinh thể thạch anh đƣợc phủ với kháng thể chuyên biệt cho virus. Cho một điện thế qua đĩa sẽ làm cho đĩa hơi bị lệch vì ảnh hƣởng của áp lực điện. Sự hấp thu các phần tử virus lên bề mặt tinh thể sẽ làm thay đổi tần số dao động cộng hƣởng theo kiểu phụ thuộc vào nồng độ. Do đó, có thể định lƣợng virus. Phát triển kỹ thuật này với mục tiêu là độ nhạy của nó bằng ELISA nhƣng nhanh hơn ELISA và kinh tế. Có thể phát hiện ở nồng độ 1ng phần tử virus trong nhựa thô của cây.
2.3.5 Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào trình tự của đoạn DNA.
2.3.5.1 Phƣơng pháp RFLP - PCR (Restriction Fragenzymt Length Polymorphirm - PCR)
RFLP đƣợc sử dụng trong sự kết hợp với PCR để nhận dạng ra sự khác biệt giữa các virus dựa vào sự có mặt hay vắng mặt của những vị trí nhận biết của enzym cắt giới hạn (restriction enzyme). Sau khi thực hiện PCR, sản phẩm khuếch đại sẽ đƣợc cắt với