Khảo sát khả năng kháng nấm gây bệnh trên thực vật của tinh dầu tràm (melaleuca alternifolia)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Lê Thanh Khang KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN THỰC VẬT CỦA TINH DẦU TRÀM TRÀ (Melaleuca alternifolia) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 LUẬN VĂN THẠC SỸ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2020 Cơng trình đƣợc hồn thành tại: Trƣờng Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM Cán hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Thu Hƣơng PGS TS Lê Thị Thủy Tiên Cán chấm nhận xét 1: PGS TS Nguyễn Tiến Thắng Cán chấm nhận xét 2: TS Huỳnh Ngọc Oanh Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ Trƣờng Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 14 tháng 01 năm 2020 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: PGS TS Nguyễn Thúy Hƣơng PGS TS Nguyễn Tiến Thắng TS Huỳnh Ngọc Oanh PGS TS Nguyễn Thị Thu Hƣơng TS Hoàng Mỹ Dung Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trƣởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn đƣợc sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC Luận văn tốt nghiệp cao học Lê Thanh Khang LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyên Giám đốc Trung tâm Sâm Dược liệu TP Hồ Chí Minh, Viện Dược liệu PGS TS Lê Thị Thủy Tiên, Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Kỹ thuật hóa học, Trường Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh tận tình hướng dẫn dìu dắt em q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Trong q trình thực luận văn, em ln nhận phối hợp giúp đỡ cá nhân nhiều quan đơn vị khác Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Vũ Phong, Giảng viên Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nơng lâm TP Hồ Chí Minh hướng dẫn em đánh giá hình thái tế bào nấm sợi, cô Nguyễn Kim Minh Tâm, Giảng viên Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Kỹ thuật hóa học, Trường Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh chị Lê Thị An Nhiên, Trung tâm Ứng dụng công nghệ sinh học Đồng Nai hỗ trợ em dòng nấm sợi suốt trình thực luận văn Trong trình thực luận văn vừa qua, em nhận giúp đỡ bảo tận tình chị Trần Nguyễn Mỹ Châu anh chị Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu Dầu Cây có dầu, người giúp đỡ em trình thực luận văn Em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới quý anh chị Viện Nghiên cứu Dầu Cây có dầu tạo điều kiện cho em hoàn thành luận văn Bên cạnh đó, em xin cảm ơn người thân gia đình bạn bè tạo điều kiện động viên giúp đỡ em vật chất tinh thần để em hồn thành luận văn Chân thành cảm ơn! TP Hồ Chí Minh, ngày 04 tháng 12 năm 2019 i Luận văn tốt nghiệp cao học Lê Thanh Khang TÓM LƢỢC Lần đầu tiên, thành phần hóa học hoạt tính kháng nấm gây bệnh thực vật tinh dầu Tràm trà (Melaleuca alternifolia) thu hái tỉnh Long An đƣợc khảo sát Bằng phƣơng pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), thành phần hóa học tinh dầu Tràm trà đƣợc xác định hợp chất eucalyptol với hàm lƣợng 31,54% Hoạt tính kháng nấm gây bệnh thực vật tinh dầu đƣợc đánh giá phƣơng pháp pha loãng đa nồng độ để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Kết thử hoạt tính kháng nấm gây bệnh thực vật cho thấy tinh dầu Tràm trà có khả ức chế tăng trƣởng năm dòng nấm: Aspergillus niger, Corynespora cassiicola, Colletotrichum sp., Fusarium oxysporum Pyricularia oryzae với giá trị MIC từ – μL/mL Từ khóa: Hoạt tính kháng nấm gây bệnh thực vật, Melaleuca alternifolia, tinh dầu Tràm trà ii Luận văn tốt nghiệp cao học Lê Thanh Khang ABSTRACT The chemical composition and plant pathogenic antifungal activity of tea tree essential oils (Melaleuca alternifolia) collected in Long An, Vietnam was surveyed By gas chromatography and mass spectrometry (GC-MS), the main chemical composition in tea tree essential oils was identified to be eucalyptol with a concentration of 31.54% Plant antifungal activity of tea tree essential oils was evaluated with many kinds of dissolvent to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) The results showed that tea tree essential oils had the ability to inhibit the growth of five phytopathogenic fungal strains: Aspergillus niger, Corynespora cassiicola, Colletotrichum sp., Fusarium oxysporum and Pyricularia oryzae with the minimum inhibitory concentrations (MICs) were in the range of – μL mL-1 Keywords: Melaleuca alternifolia, plant pathogenic antifungal activity, tea tree essential oils iii Luận văn tốt nghiệp cao học Lê Thanh Khang LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân cán hƣớng dẫn Các số liệu, kết trình bày luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố luận văn trƣớc TP Hồ Chí Minh, ngày 03 tháng 01 năm 2020 Cán hƣớng dẫn Học viên thực PGS TS Nguyễn Thị Thu Hƣơng Lê Thanh Khang PGS TS Lê Thị Thủy Tiên iv Luận văn tốt nghiệp cao học Lê Thanh Khang MỤC LỤC DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT viii DANH SÁCH HÌNH ix DANH SÁCH BẢNG x MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Tràm trà .3 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Phân loại mô tả thực vật 1.2 Tổng quan tinh dầu tinh dầu Tràm trà 1.2.1 Tinh dầu 1.2.2 Tính chất vật lý tinh dầu 1.2.3 Thành phần hóa học tinh dầu 1.2.4 Các phương pháp chiết xuất tinh dầu 1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình ly trích tinh dầu 1.2.6 Tinh dầu Tràm trà 1.3 Giới thiệu số nấm sợi gây bệnh thực vật .12 1.4 Cơ chế kháng vi sinh vật tinh dầu 15 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 16 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 16 2.1.1 Nguyên liệu 16 2.1.2 Hóa chất thiết bị .16 2.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 18 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu…………………………………………………………… 19 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 v Luận văn tốt nghiệp cao học Lê Thanh Khang 3.1 Khảo sát hiệu ly trích tinh dầu Tràm trà 28 3.2 Khào sát yếu tố ảnh hƣởng đến q trình ly trích tinh dầu 28 3.2.1 Ảnh hưởng thời gian ly trích 28 3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ dung dịch muối NaCl 29 3.2.3 Ảnh hưởng thể tích dung dịch NaCl 30 3.3 Khảo sát việc ly trích tinh dầu Tràm trà phƣơng pháp ứng dụng enyme 31 3.3.1 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/Tràm trà 31 3.3.2 Ảnh hưởng thời gian xử lý Tràm trà với enzyme 32 3.4 Đánh giá chất lƣợng tinh dầu Tràm trà phƣơng pháp phân tích GC-MS 33 3.5 Khảo sát in vitro in vivo hiệu phòng/trị tinh dầu Tràm trà nấm gây bệnh thực vật 36 3.5.1 Khảo sát in vitro hiệu ức chế tinh dầu Tràm trà nấm gây bệnh thực vật 36 3.5.2 Đánh giá hình thái tế bào nấm sợi 40 3.5.3 Khảo sát in vivo hiệu phòng/trị tinh dầu Tràm trà nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư ớt 42 3.6 Khảo sát in vitro in vivo hiệu phòng/trị tinh dầu Tràm trà đƣợc phối hợp với thuốc diệt nấm nguồn gốc tổng hợp nấm gây bệnh thực vật 45 3.6.1 Khảo sát in vitro hiệu ức chế tinh dầu Tràm trà phối hợp với thuốc diệt nấm nguồn gốc tổng hợp nấm gây bệnh thực vật 45 3.6.2 Khảo sát in vivo hiệu phòng/trị tinh dầu Tràm trà phối hợp với thuốc diệt nấm nguồn gốc tổng hợp nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư ớt 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 vi Luận văn tốt nghiệp cao học Lê Thanh Khang Kết luận 50 Kiến nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO .53 vii Luận văn tốt nghiệp cao học Lê Thanh Khang DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT Amu Atomic mass units DĐVN Dƣợc điển Việt Nam GC-MS Gas chromatography–mass spectrometry (sắc ký khí ghép khối phổ) M Khối lƣợng phân tử MIC Minimum inhibitory concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) MFC Minimum fungicidal concentration (Nồng độ ức nấm chế tối thiểu) PDA Potato Dextrose Agar ppm part per million (phần triệu) TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam viii Luận văn tốt nghiệp cao học Lê Thanh Khang Bảng 3.14 Hiệu tinh dầu Tràm trà kết hợp với thuốc diệt nấm carbendazim qua hai biện pháp xử lý trƣớc sau lây bệnh qua thời điểm khảo sát Ngày sau lây bệnh Biện pháp xử lý Trƣớc lây bệnh ngày Sau lây bệnh ngày Trƣớc lây bệnh Sau lây bệnh ngày Trƣớc lây bệnh Sau lây bệnh ngày Trƣớc lây bệnh Sau lây bệnh Đối chứng 9± 2,36a Chiều dài vết bệnh (mm) 1:4 2:3 3:2 4:1 6,8 ± 1,62b 7,3 ± 0,95b 5,7 ± 1,77b 11,8 ± 6,8 ± 2,10b a 3,10 5,9 ± 1,37b 4,8 ± 1,48b 6,0 ± 1,49b 9,7 ± 5,8 ± 1,75c 2,71a 12,1 ± 7,1 ± 1,29c a 2,40 13,4 ± 7,5 ± 1,35b a 3.81 20,1 ± 15,1 ± a 5,79 4,68b Toàn Toàn trái trái Toàn Toàn trái trái 7,3 ± 1,16b 9,9 ± 3,18b 14,5 ± 1,96a 11,7 ± 3,80c 8,4 ± 2,17b Toàn trái 7,8 ± 1,93b 7,8 ± 1,48c Toàn trái 7,6 ± 1,78d Toàn trái Toàn trái 11,3 ± 2,58a 8,1 ± 1,52c 9,8 ± 2,49b 10,7 ± 2,71c 12,2 ± 2,49a Toàn trái ± 1,49c Ghi chú: mẫu tự theo sau giá trị hàng khác khác biệt có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy > 95% 48 Luận văn tốt nghiệp cao học Lê Thanh Khang Xử lý với tinh dầu trƣớc lây bệnh Xử lý với tinh dầu sau lây bệnh 10 mm 10 mm 1:4 2:3 10 mm 10 mm 10 mm 3:2 10 mm 10 mm 10 mm 4:1 10 mm Đối chứng 10 mm Hình 3.6 Hiệu phòng trừ tinh dầu Tràm trà kết hợp với thuốc diệt nấm carbendazim bệnh thán thƣ ớt thiên thời điểm ngày sau lây bệnh 49 Luận văn tốt nghiệp cao học Lê Thanh Khang KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Ly trích tinh dầu từ Tràm trà phƣơng pháp chƣng cất lôi nƣớc có kết hợp hiệu ứng muối để hỗ trợ khuếch tán tinh dầu với hiệu suất chiết điều kiện tối ƣu 6,42% Điều kiện tối ƣu cho q trình ly trích tinh dầu phƣơng pháp chƣng cất lôi nƣớc quy mô phịng thí nghiệm nhƣ:  Thời gian ly trích: 120 phút  Nồng độ muối NaCl: 15%  Thể tích dung dịch muối NaCl: 500 mL Sự gia tăng hàm lƣợng tinh dầu đạt 0,28% có hỗ trợ enzyme macerozyme với:  Tỷ lệ enzyme/Tràm trà: 1%  Thời gian xử lý Tràm tràvới enzyme: Thành phần hố học tinh dầu Tràm trà hợp chất eucalyptol với hàm lƣợng 31,54% Thử nghiệm in vitro hoạt tính kháng nấm gây bệnh thực vật tinh dầu từ Tràm trà năm dòng nấm sợi, kết cho thấy tinh dầu Tràm trà biểu hoạt tính kháng nấm gây bệnh thực vật tốt với khả kháng loại nấm gây hại với nồng độ ức chế tối thiểu nhƣ sau: Aspergillus niger Fusarium oxysum: 10 μL/mL, Corynespora cassiicola: μL/mL, Colletotrichum sp Pyricularia oryzae: μL/mL Thử nghiệm in vivo hoạt tính kháng nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thƣ ớt, nhận thấy tinh dầu Tràm trà nồng độ 10% có hiệu tốt cà hai biện pháp xử lý với tinh dầu Tràm trà trƣớc sau lây bệnh Sự kết hợp tinh dầu Tràm trà thuốc diệt nấm carbendazim cho thấy hiệu việc ức chế nấm gây bệnh thực vật Thông qua mức tỷ lệ tinh dầu Tràm trà carbendazim có nguồn gốc tổng hợp, tác dụng kháng nấm gây bệnh thực vật có tỷ lệ tinh dầu Tràm trà:carbendazim có nguồn gốc tổng hợp 4:1 đối 50 Luận văn tốt nghiệp cao học Lê Thanh Khang với Pyricularia oryzae, 3:2 Corynespora cassiicola, Colletotrichum sp., Fusarium oxysum Thử nghiệm in vivo hoạt tính kháng nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thƣ ớt, nhận thấy biện pháp xử lý với hỗn hợp tinh dầu Tràm trà carbendazim trƣớc sau lây bệnh, tỷ lệ tinh dầu Tràm trà thuốc diệt nấm carbendazim 1:4 cho hiệu tốt thời điểm khảo sát Kiến nghị Tiếp tục khảo sát quy trình chiết xuất tinh dầu phuơng pháp khác nhƣ phƣơng pháp chiết có hỗ trợ vi sóng, chiết công nghệ CO2 siêu tới hạn; nhƣ thử nghiệm in vivo hoạt tính kháng nấm gây bệnh thực vật nhƣ Aspergillus niger, Corynespora cassiicola Pyricularia oryzae Bên cạnh đó, nghiên cứu tiếp tục khảo sát hoạt tính kháng sinh nhiều dịng vi khuẩn nấm gây hại khác 51 Luận văn tốt nghiệp cao học Lê Thanh Khang DANH MỤC BÀI BÁO Thanh Khang Le, Thi Thu Huong Nguyen, Thi Thuy Tien Le Antifungal activity of tea tree essential oils (Meleleuca alternifolia) against phytopathogenic fungi International Journal of Advanced Research - 7(9), 1239 - 1248 (2019) ISBN/ISSN: 2320-5407 52 Luận văn tốt nghiệp cao học Lê Thanh Khang TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Maiden, Betche C (1924), Melaleuca alternifolia J Proc Roy Soc New S Wales 58:195 [2] Guenther E (1968), Australian tea tree oils Report of a field survey Perfum Essent Oil Rec 59: 642-644 [3] Swords G, Hunter GLK (1978), Composition of Australian tea tree oil (Melaleuca alternifolia) J Agric Food Chem 26: 734-737 [4] Brophy JJ, Davies NW, Southwell IA, Stiff IA, Williams LR (1989), Gas chromatographic quality control for oil of Melaleuca terpinen-4-ol type (Australian tea tree) J Agric Food Chem., 37 (5), pp 1330–1335 [5] International Organisation for Standardisation (2004), ISO 4730:2004 Oil of Melaleuca terpinen-4-ol type (tea tree oil) International Organisation for Standardisation Geneva Switzerland [6] Bassett IB, Pannowitz DL, Barnetson RS (1990), A comparative study of teatree oil versus benzoylperoxide in the treatment of acne Med J Aust 153(8): 455-8 [7] Southwell IA, Hayes AJ, Markham J, Leach DN (1993), The search for optimally bioactive australian tea tree oil ActaHortic 344.30 [8] Nenoff P, Haustein UF, Brandt W (1996), Antifungal activity of the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil) against pathogenic fungi in vitro Skin Pharmacol 9(6): 388-94 [9] Rushton RT, Davis NW, Page JC, Durkin CA (1997), The effect of tea tree oil extract on the growth of fungi Lower Extremity 4: 113-116 [10] Christoph F, Kaulfers PM, Stahl-Biskup E (2000), A comparative study of the in vitro antimicrobial activity of tea tree oils s.l with special reference to the activity of beta-triketones Planta Med 66(6): 556-60 53 Luận văn tốt nghiệp cao học Lê Thanh Khang [11] Griffin SG, Markham JL, Leach DN (1999), An agar dilution method for the determination of the minimum inhibitory concentration of essential oils J Essent Oil Res 12: 249-255 [12] D'Auria FD, Laino L, Strippoli V, Tecca M, Salvatore G, Battinelli L, Mazzanti G (2001), In vitro activity of tea tree oil against Candida albicans mycelial conversion and other pathogenic fungi J Chemother 13(4): 377-83 [13] Schnitzler P, Schön K, Reichling J (2001), Antiviral activity of Australian tea tree oil and eucalyptus oil against herpes simplex virus in cell culture Pharmazie 56(4): 343-7 [14] Kiều Tuấn Đạt (2010), Kỹ thuật giâm hom Tràm trà (Melaleuca alternifolia) lấy tinh dầu NXB nông nghiệp [15] Seller R, Berger T, Reichling J, Harkenthaf M (1998), Pharmaceutical and medicinal aspects of Autralian tea tree oil Phytomedicine Vol 5(6) 489 – 495 [16] Peter GW (1991), Melaleuca alternifolia (Maiden & Betche) Cheel New South Wales Flora online [17] Reichling J, Iten F, Seller R (2003), Autralisches teebaumol (Melaleuca alternifolia) pharmazeutische qualitat, wirksamkeit und toxizitat Phytotherapie 3: 32 – 39 [18] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chƣơng, Nguyễn Thƣợng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập Trần Toàn (2003), Cây Thuốc Và Động Vật Làm Thuốc Ở Việt Nam, tập II NXB Khoa Học Và Kỹ Thuật: trang 1006-1008 [19] Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Thị Tâm, Trần Văn Thanh (1998), Bài giảng dƣợc liệu, tập Đại học Dược Hà Nội, NXB Y học, Hà Nội [20] Bagora Bayala, Imaël HN Bassole, Riccardo Scifo, Charlemagne Gnoula, Laurent Morel, Jean-Marc A Lobaccaro and Jacques Simpore (2014), Anticancer activity of essential oils and their chemical components - a review American Journal of Cancer Research, 4(6): 591– 607 54 Luận văn tốt nghiệp cao học Lê Thanh Khang [21] El Asbahani A, Miladi K, Badri W, Sala M, Aït Addi EH, Casabianca H, El Mousadik A, Hartmann D, Jilale A, Renaud FNR, Elaissari A (2014), Essential oils: From extraction to encapsulation International Journal of Pharmaceutics, 5(3): 1-24 [22] Ngô Văn Thu (2011), Bài giảng dƣợc liệu, tập I Trường đại học Dược Hà Nội [23] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phƣơng pháp cô lập hợp chất hữu NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh, trang 31-32 [24] Nguyễn Thiện Chí, Nguyễn Thị Ngọc Châm, Phạm Khánh Ngọc, Đỗ Duy Phúc, Dƣơng Tùng Kha Nguyễn Thị Thu Thủy (2016.), Khảo sát thành phần hóa học hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu trầu không (Piper betel L.), họ hồ tiêu (Piperaceae) Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 45a: 28-32 [25] Carson CF, Hammer KA, Riley TV (1995), Broth micro-dilution method for determining the susceptibility of Escherichia coli and Staphylococcus aureus to the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil) Microbios 82(332): 181-5 [26] Hammer KA, Carson CF, Riley TV (1996), Susceptibility of transient and commensal skin flora to the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil) Am J Infect Control 24(3): 186-9 [27] Inouye S, Tsuruoka T, Watanabe M, Takeo K, Akao M, Nishiyama Y, Yamaguchi H (2000), Inhibitory effect of essential oil on apical growth of Aspergillis fumigatus by vapour contact Mycoses 43: 17 – 23 [28] Bishop SD (1995), Antiviral activity of the essential of Melaleuca alternifolia (Maiden & Betche) Cheel (tea tree) against tobacco mosaic virus Journal of Essential Oil Research 7: 641 – 644 [29] Richard JL (2007), Some major mycotoxins and their mycotoxicoses – An overview International Journal of Food Microbiology, 119: [30] Prakash B, Kedia A, Mishra PK, Dubey NK (2015), Plant essential oils as food preservatives to control moulds, mycotoxin contamination and oxidative 55 Luận văn tốt nghiệp cao học Lê Thanh Khang deterioration of agri-food commodities e Potentials and challenges Food Control, 47: 381 [31] Dixon LJ (2009), Host specialization and phylogenetic diversity of Corynespora cassiicola Phytopathology 99(9) 1015-27 [32] Cao Văn Thu (2013), Vi sinh vật học NXB Giáo Dục Việt Nam, phần III, chƣơng [33] Levy M, Romao J, Marchetti MA, Hamer JE (1991), DNA fingerprinting with a dispersed repeated sequence resolves pathotype diversity in the rice blast fungus The Plant Cell Online, 3: 95 - 102 [34] Zeigler RS (1998), Recombination in Magnaporthe grisea Annual review of phytopathology, 36: 249 - 275 [35] Kumar J, Nelson R, Zeigler R (1999), Population structure and dynamics of Magnaporthe grisea in the Indian Himalayas Genetics, 152: 971 - 984 [36] Thuan NTN, Bigirimana J, Roumen E, Van Der Straeten D, Höfte M (2006), Molecular and pathotype analysis of the rice blast fungus in North Vietnam European journal of plant pathology, 114: 381-396 [37] Gao C, Tian C, Lu Y, Xu J, Luo J, Guo X (2011), Essential oil composition and antimicrobial activity of Sphallerocarpus gracilis seeds against selected foodrelated bacteria Food Control, 22: 517-522 [38] Cowan MM (1999), Plant products as antimicrobial agents Clinical Microbiology [39] Cox SD, Mann CM, Markham JL, Bell HC, Gustafson JE, Warmington JR, Wyllie SG (2000), The mode of antimicrobial action of the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil) Journal of Applied Microbilogy 88: 170 – 175 [40] Inouye S, Watanabe M, Nishiyama Y, Takeo K, Akao M, Yamaguchi H (1998), Antisporulating and respiration - inhibitory effect of essential oil on filamentous fungi Mycoses 41: 403 – 410 56 Luận văn tốt nghiệp cao học Lê Thanh Khang [41] Nguyễn Thị Yến, Trƣơng Văn Tƣơi, Trần Hoàn Nhân, Lƣu Thái Danh Nguyễn Thị Thu Nga (2016), Nghiên cứu xạ khuẩn thuốc hóa học phịng trừ bệnh thán thƣ ớt Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Số chuyên đề: Nông nghiệp (Tập 3): 153-159 [42] Rawat AKS, Tripathl RD, Khan AJ, Balasubrahmanyam VR (1989), Essential Oil Components as Markers for Identification of Piper betle L Cultivars Biochemical Systematics and Ecology 17(1): 35-38 [43] Furter WF, Cook RA (1967), Salt effect in distillation: a Literature Review International Journal of Heat and Mass Transfer 10: 23-36 [44] Nikos Tzortzakis CDEG (2007), Antifungal activity of lemongrass (Cympopogon citratus L.) essential oil against key postharvest pathogens Innovative Food Science & Emerging Technologies Vol 8, pp 253-258 [45] Amit Tyagi AMK (2010), Liquid and vapour-phase antifungal activities of selected essential oils against Candida albicans: microscopic observations and chemical characterization of cymbopogon citratus BMC Complementary and Alternative Medicine Vol 10, 2010 [46] Lopez SCP, Batlle R, Nerin C (2005), Solid-and vapor-phase antimicrobial activities of six essential oils: Susceptibility of selected foodborne bacterial and fungal strains Journal of Agricultural and Food Chemistry Vol 53, pp 6939-6946 [47] Weinhold AR, Hancock JG (2012), Defense at the perimeter: extruded chemicals Plant Diseases, 5: 121-133 [48] Wuryatmo E, Klieber A, Scott ES (2003), Inhibition of citrus postharvest pathogens by vapor of citral and related compounds in culture J Agric Food Chem Vol 51, pp 2637-2640, 2003 [49] Boland GJ (1990), Biological control of plant diseases with fungal antagonists: challenges and opportunities Canadian Journal of Plant Pathology, 12(3): 295-299 57 Luận văn tốt nghiệp cao học Lê Thanh Khang [50] Phạm Văn Kim (2000), Các nguyên lý bệnh hại trồng, khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng, Trƣờng Đại học Cần Thơ: 185 trang Trang web [51] Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia (ACIAR) 58 Luận văn tốt nghiệp cao học Lê Thanh Khang PHỤ LỤC Phụ lục Độ ẩm Tràm trà (%) Độ ẩm Lần 58,48 Lần 59,95 Lần 61,13 Trung bình 59,52 ± 1,08 Phụ lục Kết khảo sát thời gian ly trích tinh dầu Trầu khơng phƣơng pháp chƣng cất lơi nƣớc Thời gian ly trích (phút) 60 120 180 240 Lần 3,88 6,5 7,32 6,99 Hiệu suất chƣng cất tinh dầu Lần (%) 3,63 5,93 6,58 6,75 Lần 3,76 6,82 6,7 6,32 Trung bình 3,7567 6,4167 6,8667 6,6867 Độ lệch chuẩn 0,125 0,4508 0,3972 0,3395 Phụ lục Kết khảo sát ảnh hƣởng nồng độ dung dịch NaCl đến hiệu suất ly trích tinh dầu phƣơng pháp chƣng cất lôi nƣớc Nồng độ dung dịch NaCl (%) Lần Hiệu suất ly trích tinh dầu Lần (%) Lần Trung bình Độ lệch chuẩn 10 15 20 2.62 4,36 6,58 4,98 2,4 3,1 6,16 5,5 2,54 3,28 4,68 6,5 5,56 2,52 3,1267 4,3467 6,4133 5,3467 0,1114 0,1419 0,3402 59 0,223 0,319 Luận văn tốt nghiệp cao học Lê Thanh Khang Phụ lục Kết khảo sát ảnh hƣởng thể tích dung dịch NaCl đến hàm lƣợng tinh dầu ly trích phƣơng pháp chƣng cất lơi nƣớc Nồng độ dung dịch NaCl (%) 200 300 400 500 1,11 1,59 3,17 6,37 1,47 1,66 3,12 6,06 1,63 3,21 5,9 Trung bình 1,1933 1,6267 3,1667 6,11 Độ lệch chuẩn 0,2458 0,0351 0,0451 0,239 Lần Hiệu suất ly trích tinh dầu Lần (%) Lần Bảng 3.2 Đƣờng kính vịng sinh trƣởng hiệu suất kháng Colletotrichum sp tinh dầu Tràm trà Nồng độ tinh dầu Tràm trà ((µL/mL) 10 Lần 2,1 0 Lần 8,9 3,9 0 Lần 8,95 4,1 2,15 0 8,95 4,0 6,25 0 0 0,401 0,081 0 Lần 55,56 76,67 100 100 100 Lần 56,18 77,53 100 100 100 Lần 54,19 75,98 100 100 100 Trung bình 55,31 76,727 100 100 100 Độ lệch chuẩn 1,018 0 Đƣờng kính vịng sinh trƣởng Colletotrichum sp (cm) Trung bình Độ lệch chuẩn Hiệu suất kháng nấm Colletotrichum sp tinh dầu Tràm trà (%) 60 0,777 Luận văn tốt nghiệp cao học Lê Thanh Khang Bảng 3.3 Đƣờng kính vịng sinh trƣởng hiệu suất kháng Pyricularia oryzae tinh dầu Tràm trà Nồng độ tinh dầu Tràm trà ((µL/mL) 10 Lần 4,5 3,9 2,7 0 Lần 4,6 2,6 0 Lần 4,65 3,85 2,75 0 Trung bình 4,583 3,917 2,683 0 Độ lệch chuẩn 0,062 0,062 0,062 0 Đƣờng kính vịng sinh trƣởng Pyricularia oryzae (cm) Lần 13,33 40 100 100 100 Lần 13,04 43,48 100 100 100 Lần 17,2 40,86 100 100 100 Trung bình 14,52 41,45 100 100 100 Độ lệch chuẩn 2,32 1,81 0 Hiệu suất kháng nấm Pyricularia oryzae tinh dầu Tràm trà (%) 61 Luận văn tốt nghiệp cao học Lê Thanh Khang Bảng 3.3 Đƣờng kính vịng sinh trƣởng hiệu suất kháng Fusarium oxysporum tinh dầu Tràm trà Nồng độ tinh dầu Tràm trà ((µL/mL) Đƣờng kính vịng sinh trƣởng Fusarium oxysporum (cm) 10 Lần 4,7 3,9 2,9 2,1 1,2 Lần 4,6 3,96 2,8 2,2 1,1 Lần 4,65 4,0 3,0 2,3 2,1 3,953 2,9 2,2 1,467 0,041 0,082 0,082 Trung bình 4,65 Độ lệch chuẩn 0,041 0,45 0 Lần 17,02 38,3 55,32 74,47 100 Lần 13.,91 39,13 52,17 76,09 100 Lần 13,98 35,48 50,54 54,84 100 Trung bình 14,97 37,64 52,68 68,47 100 Độ lệch chuẩn 1,78 1,91 2,43 11,83 Hiệu suất kháng nấm Fusarium oxysporum tinh dầu Tràm trà (%) 62 ... trừ nấm gây bệnh thực vật, đề tài ? ?Khảo sát khả kháng nấm gây bệnh thực vật tinh dầu Tràm trà (Melaleuca alternifolia)? ?? đƣợc thực nhằm đánh giá khả ức chế số nấm gây bệnh thực vật tinh dầu Tràm. .. 2.2.2.5 Khảo sát in vitro in vivo hiệu phòng/trị tinh dầu Tràm trà số dòng nấm gây bệnh thực vật Khảo sát in vitro hiệu ức chế tinh dầu Tràm trà số dòng nấm gây bệnh thực vật Chuẩn bị nấm: dòng nấm. .. 3.5 Khảo sát in vitro in vivo hiệu phòng/trị tinh dầu Tràm trà nấm gây bệnh thực vật 3.5.1 Khảo sát in vitro hiệu ức chế tinh dầu Tràm trà nấm gây bệnh thực vật Với nồng độ ban đầu 10 µL/mL, tinh