Công nghệ chuyển đổi gen động vật thực vật

1 Mở đầu Mục đích công tác chọn giống nhân giống cải tiến tiềm di truyền trồng, vật nuôi nhằm nâng cao suất, hiệu sản xuất nông nghiệp Trong công tác cải tạo giống cổ truyền chủ yếu sử dụng phương pháp lai tạo chọn lọc để cải tạo nguồn gen sinh vật Tuy nhiên, trình lai tạo tự nhiên, lai thu qua lai tạo chọn lọc mang gen không mong muốn tổ hợp hai nhiễm sắc thể đơn bội giao tử đực giao tử Một hạn chế việc lai tạo tự nhiên thực cá thể loài Lai xa, lai khác loài gặp nhiều khó khăn, lai thường bất thụ sai khác nhiễm sắc thể số lượng lẫn hình thái bố mẹ, cấu tạo quan sinh dục, tập tính sinh học loài không phù hợp với Gần đây, nhờ thành tựu lĩnh vực DNA tái tổ hợp, công nghệ chuyển gen đời cho phép khắc phục trở ngại nói Nó cho phép đưa gen mong muốn vào động vật, thực vật để tạo giống vật nuôi, trồng , kể việc đưa gen từ giống sang giống khác, đưa gen loài vào loài khác Bằng kỹ thuật tiên tiến nêu công nghệ sinh học đại, vào năm 1982 Palmiter cộng chuyển gen hormone sinh trưởng chuột cống vào chuột nhắt, tạo chuột nhắt “khổng lồ“ Từ đến hàng loạt động vật nuôi chuyển gen tạo thỏ, lợn, cừu, dê, bò, gà, cá Trong hướng nhà nghiên cứu tập trung vào mục tiêu: tạo động vật chuyên sản xuất protein quí phục vụ y học; tạo động vật có sức chống chịu tốt (chống chịu bệnh tật, thay đổi điều kiện môi trường ); tạo vật nuôi có tốc độ lớn nhanh, hiệu suất sử dụng thức ăn cao, cho suất cao chất lượng sản phẩm tốt Ðộng vật chuyển gen sử dụng làm mô hình thí nghiệm nghiên cứu bệnh người để nhanh chóng tìm giải pháp chẩn đoán điều trị bệnh hiểm nghèo ung thư, AIDS, thần kinh, tim mạch Những bước phát triển công nghệ chuyển gen vào thực vật bắt nguồn từ thành công công nghệ chuyển gen vào động vật Kể từ năm 1984, lúc người ta bắt đầu tạo trồng chuyển gen đến có bước tiến lớn Nhiều trồng quan trọng chuyển gen đời lúa, ngô, lúa mì, đậu tương, bông, khoai tây, cà chua, cải dầu, đậu Hà Lan, bắp cải Các gen chuyển gen kháng vi sinh vật, virus gây bệnh, kháng côn trùng phá hại, gen cải tiến protein hạt, gen có khả sản xuất loại protein mới, gen chịu hạn, gen bất thụ đực, gen kháng thuốc diệt cỏ Triển vọng công nghệ chuyển gen lớn, cho phép tạo giống vật nuôi, trồng mang đặc tính di truyền hoàn toàn mới, có lợi cho người mà chọn giống thông thường phải trông chờ vào đột biến tự nhiên, luôn có Ðối với phát triển công nghệ sinh học kỷ XXI công nghệ chuyển gen có vị trí đặc biệt quan trọng Có thể nói công nghệ chuyển gen hướng công nghệ cao công nghệ sinh học đại phục vụ sản xuất đời sống I Một số khái niệm Chuyển gen Chuyển gen (transgenesis) đưa đoạn DNA ngoại lai vào genome thể đa bào, sau đoạn DNA ngoại lai có mặt hầu hết tế bào truyền lại cho hệ sau Vì khái niệm chuyển gen sử dụng cho thực vật động vật Nấm men, vi khuẩn tế bào nuôi cấy mang đoạn DNA ngoại lai gọi tế bào tái tổ hợp (recombinant cell) tế bào biến nạp (transformed cell) Chuyển gen khác với liệu pháp gen (gene therapy) Có trường hợp tế bào mầm không mang DNA ngoại lai Thuật ngữ liệu pháp gen mầm (germinal gene therapy) sử dụng Liệu pháp gen mầm chưa thử nghiệm người Các tế bào mầm mang DNA ngoại lai truyền lại cho hệ sau Về mặt lịch sử, thuật ngữ GMO (genetically modified organism)-sinh vật biến đổi gen, sử dụng chủ yếu để thực vật chuyển gen gieo trồng để cung cấp lương thực, thực phẩm cho người động vật Logic xác hơn, GMO đề cập tới tất thể sống biến đổi di truyền, bao gồm vi sinh vật Thuật ngữ GMP (genetically modified plant)-thực vật biến đổi gen GMA (genetically modified animal)- động vật biến đổi gen sử dụng Trong thực tế, đoạn DNA ngoại lai sử dụng để tạo sinh vật chuyển gen hầu hết gen có sẵn trình tự phù hợp với promoter làm cho biểu thành RNA, nói tổng quát protein Sản phẩm phiên mã gen RNA không dịch mã thành protein Ðây trường hợp RNA ngược hướng (antisense RNA), rybozyme gen phiên mã RNA polymerase I III Không thiết DNA ngoại lai luôn hợp vào genome sinh vật chuyển gen DNA ngoại lai tồn thể mà không hợp vào genome Một đoạn DNA tự nhanh chóng bị loại trừ chu trình tế bào khả tái truyền lại cho tế bào Tuy nhiên lý thuyết trì đoạn DNA ngoại lai nhiễm sắc thể nhỏ (minichromosome) có khả tự tái có mặt tế bào Một số genome virus có đặc tính này, ví dụ virus herpes Một vài đoạn nhiễm sắc thể thường tìm thấy tế bào khối u, nhiễm sắc thể tồn thời gian ngắn, mang yếu tố tái truyền cho tế bào Ðộng vật (Thực vật) chuyển gen Ðộng vật (Thực vật) chuyển gen động vật (thực vật) có gen ngoại lai (gen chuyển) xen vào DNA genome Gen ngoại lai phải truyền lại cho tất tế bào, kể tế bào sinh sản mầm Nếu dòng tế bào mầm bị biến đổi, tính trạng bị biến đổi truyền cho hệ thông qua trình sinh sản bình thường Nếu có dòng tế bào sinh dưỡng bị biến đổi, có thể mang tế bào sinh dưỡng bị ảnh hưởng không di truyền lại cho hệ sau Việc chuyển gen ngoại lai vào động vật (thực vật) thành công gen di truyền lại cho hệ sau Cho đến nay, giới người ta thành công việc tạo nhiều thực vật, động vật chuyển gen Ở động vật, không động vật mô hình (chuột), vật nuôi (bò, lợn, dê, cừu, thỏ, gà, cá ) mà loài động vật khác khỉ, muỗi số côn trùng Gen chuyển Gen chuyển (transgene) gen ngoại lai chuyển từ thể sang thể kỹ thuật di truyền Các gen chuyển sử dụng để tạo động vật, thực vật chuyển gen có nguồn gốc từ loài sinh vật khác nhau: động vật, thực vật, vi sinh vật người Ví dụ: gen người đưa vào chuột vật nuôi khác lợn, bò, cừu, chim II Mục đích chuyển gen Nói chung, mục đích chuyển gen thêm thông tin di truyền ngoại lai vào genome, để ức chế gen nội sinh Trong số trường hợp, thay gen hoạt động chức gen hoạt động chức khác cần thiết Gen ngoại lai thể đột biến gen nội sinh gen hoàn toàn khác Sự thêm gen thực để cung cấp sinh vật mang protein Sự thêm gen sử dụng để nghiên cứu chế hoạt động promoter toàn thể Sự kết hợp gen reporter với promoter nguyên tắc chung phương pháp Sự thay gen sử dụng chủ yếu để làm bất hoạt gen biết Trên thực tế, bao gồm thay gen nội sinh thể đột biến bất hoạt Phương pháp dùng thông tin chức sinh học gen trường hợp thêm gen Thực thêm gen bất hoạt gen gây biến đổi sinh vật chuyển gen, mà biến đổi quan sát đánh giá Các thể đột biến gen thay cung cấp thông tin cách thức tinh vi Sự thay gen gen có chức khác hoàn toàn khó thực để đưa marker gen chọn lọc vào genome Vị trí hợp vào genome chọn lọc khả chứa để biểu gen ngoại lai cách chắn III Nguyên tắc việc tạo động (thực vật) chuyển gen Nguyên tắc việc tạo động vật (thực vật) chuyển gen đưa vài gen ngoại lai vào động vật (thực vật) (do người chủ động tạo ra) Các gen ngoại lai phải truyền thông qua dòng mầm tế bào kể tế bào mầm sinh sản động vật (thực vật) chứa vật chất di truyền sửa đổi IV Cơ chế hợp DNA ngoại lai vào genome Trong tất trường hợp, hợp đoạn DNA ngoại lai vào genome thực với tham gia chế sửa sai DNA tế bào Các protein liên quan với chế nhận cấu trúc DNA không bình thường, ghép đôi không tương ứng hai sợi đơn DNA, vùng sợi đơn vị trí mà DNA ngoại lai liên kết với DNA chủ Khi DNA ngoại lai trình tự chung với genome chủ, nhận biết hai DNA bao gồm trình tự DNA ngắn tương đồng nhiều Sự nhận biết cần thiết cho chế sửa sai hoạt động Sau DNA ngoại lai hợp vào genome nhờ trình tái tổ hợp không tương đồng (Hình 1) Sự kiện xảy vị trí khác genome Khi DNA ngoại lai đóng góp trình tự dài tương đồng với genome chủ trình tự nhận biết cách xác Các chế sửa sai gây tái tổ hợp tương đồng nghiêm ngặt làm thay gen nội sinh đích DNA ngoại lai Nếu gen sau bị đột biến gen nội sinh thay gen đột biến (Hình 2) Trong điều kiện tốt nhất, tái tổ hợp tương đồng xảy 100 lần so với tái tổ hợp không tương đồng Sở dĩ số vị trí nhận biết không thức lớn nhiều so với nhận biết tương đồng Thông thường nhận biết tương đồng genome đơn bội DNA ngoại lai phải đến nhân tế bào để hợp vào genome Số phận DNA ngoại lai không giống phụ thuộc vào việc xâm nhập vào tế bào chất vào nhân cách trực tiếp DNA biến nạp vào tế bào nuôi cấy nói chung dạng plasmid vòng Plasmid vòng bị phân cắt DNAse tế bào chất vị trí ngẫu nhiên Phần lớn DNA bị phân hủy tế bào chất Một phần nhỏ đến nhân phiên mã Ở dạng này, DNA ngoại lai không ổn định bị loại trừ tế bào phân chia Một tỉ lệ nhỏ DNA ngoại lai hợp vào genome Trong trình di chuyển từ tế bào chất đến nhân, đoạn DNA ngoại lai liên kết với để tạo dạng polymer gọi đoạn trùng lặp (concatemer) Trong tế bào chất, liên kết đồng hóa trị xảy cách ngẫu nhiên đoạn DNA ngoại lai làm cho gen xếp lại dạng nối tiếp Khi DNA xâm nhập vào nhân cách trực tiếp, đoạn DNA tạo thành đoạn trùng lặp thông qua trình tái tổ hợp tương đồng DNA ngoại lai bị phân cắt cách ngẫu nhiên, tạo đoạn trùm gối lên tái kết hợp tạo đoạn trùng lặp mà gen xây dựng lại tốt Sau khác đoạn DNA ngoại lai cấu tạo chủ yếu dạng nối tiếp Khi đoạn DNA khác xâm nhập đồng thời vào tế bào, chúng tạo thành đoạn trùng lặp chứa vài đoạn Các đoạn trùng lặp lai (hybrid concatemers) hợp vào genome Vì đến bốn gen khác chuyển đồng thời vào tế bào Nói chung, DNA ngoại lai hợp dạng đoạn trùng lặp có kích thước khoảng 100kb, thường chứa từ đến mười đoạn DNA gốc Ðiều thú vị đoạn DNA lớn chuyển vào, đoạn trùng lặp hợp vào thường chứa số kích thước tối ưu để hợp vào genome vào khoảng 100kb Hình 1: Các chế hợp vị trí ngẫu nhiên DNA ngoại lai tiêm vào nhân tế bào DNA tiêm vào cắt cách ngẫu nhiên Các đoạn DNA lệ thuộc vào trình tái tổ hợp tương đồng tạo polymer (các đoạn trùng lặp) gen tiêm vào xếp nối tiếp Các đầu đoạn trùng lặp bị phân hủy DNAse, tạo vùng sợi đơn ngắn nhận biết vị trí bổ sung genome Trong trình tái DNA, chế sửa sai hợp DNA ngoại lai Hình 2: Cơ chế thay gen tái tổ hợp tương đồng DNA nhận biết trình tự tương đồng genome cách xác Cơ chế sửa sai tế bào gây thay đặc hiệu vùng genome đích đoạn DNA ngoại lai Trình tự định vị hai vùng tương đồng hợp trình tự nằm bên vùng tương đồng lại bị loại DNA vi tiêm vào nhân hay tế bào chất dạng thẳng cách cắt plasmid vị trí chọn trước Ðiều làm giảm hội cắt plasmid vị trí ngẫu nhiên dẫn đến tạo thành đoạn trùng lặp chứa gen bị cắt xén bớt Các đoạn DNA sử dụng cho chuyển gen làm thẳng lý khác Cách làm cho loại bỏ trình tự plasmid (giàu GC) mà phá hủy gen chuyển (transgenes) Mặt khác, DNA vòng tiêm vào nhân hợp với tần số thấp nhiều so với DNA thẳng Vì nguy DNA ngoại lai giống chúng chuyển vào tế bào chất vi tiêm (microinjection), chuyển nhiễm (transfection) với tác nhân hóa học biến nạp xung điện (electroporation) Tiêm DNA vào nhân khó kết tần số hợp cao nhiều tình trạng nguyên vẹn DNA ngoại lai trì tốt Tiêm DNA vào nhân phôi luôn thực hiện, đặc biệt loài thú - Tất phân tích cho thấy: Một gen ngoại lai tách chiết sửa đổi kỹ thuật di truyền Gen ngoại lai có mặt tế bào thể bao gồm tế bào mầm sinh sản truyền lại cho hệ sau TRẦN QUỐC DUNG (Chủ biên) NGUYỄN HOÀNG LỘC-TRẦN THN LỆ CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN (ÐỘNG VẬT, THỰC VẬT) Huế, 2006 172 - Cải thiện lợi ích kinh tế xã hội loại bỏ tình trạng đói nghèo nước phát triển Kinh nghiệm năm từ 1996-2003, tổng diện tích 300 triệu trồng biến đổi gen trồng 21 nước toàn cầu, đáp ứng mong mỏi hàng triệu hộ nông dân lớn nhỏ nước công nghiệp phát triển Năm 2003, có chứng cho thấy trồng GM trồng thương mại hóa tiếp tục đem lại lợi ích đáng kể mặt kinh tế, môi trường xã hội cho hộ nông dân lớn nhỏ nước phát triển, diện tích trồng biến đổi gen toàn cầu tiếp tục tăng 10%, mức tăng hàng năm hai số Số hộ nông dân thu lợi từ trồng GM ngày nhiều đạt triệu người năm 2003, tăng so với triệu năm 2002 Đáng ý năm 2003, 85% tổng số triệu người trồng thu lợi từ trồng GM nông dân nghèo trồng Bt, chủ yếu tỉnh Trung Quốc nông dân nghèo Makhathini Flats, thuộc tỉnh KwaZulu Natal Nam Phi 3.2 Trị giá trồng biến đổi gen toàn cầu Năm 2003, trị giá thị trường trồng biến đổi gen toàn cầu ước tính đạt từ 4,5 tới 4,75 tỷ đôla, tăng so với số tỷ đôla năm 2002, chiếm 15% tổng trị giá 31 tỷ đôla thị trường bảo vệ trồng toàn cầu chiếm 13% tổng trị giá 30 tỷ đôla thị trường hạt giống toàn cầu Trị giá thị trường trồng GM toàn cầu dựa giá bán hạt giống biến đổi gen cộng với khoản chi phí công nghệ áp dụng khác Giá trị thị trường trồng GM toàn cầu dự kiến đạt tỷ đôla vào năm 2005 3.3 Nhận định trồng GM triển vọng chúng tương lai Mặc dù tranh cãi trồng biến đổi gen tiếp tục diễn Liên minh châu Âu người ta lạc quan tin diện tích số người trồng biến đổi gen toàn cầu tiếp tục gia tăng năm sau Với tất yếu tố có diện tích trồng GM toàn cầu vòng năm 173 nam Bán cầu Ấn Độ, Brazil tăng diện tích trồng Bt đậu tương chống chịu thuốc diệt cỏ Một số nước Uruguay chuẩn y sản phẩm ngô GM, loại ngô triển khai trồng nước khác Các sản phẩm chuyển gen mang đặc tính góp phần tạo tăng trưởng ổn định, bao gồm gen Bt (cry1Ac cry1Ab) hai đặc tính đưa vào ngô Bắc Mỹ gen cry3Bb1 dùng để kiểm soát sâu đục thân ngô gen cry1Fa2 dùng để kiểm soát tốt sâu bọ cánh phấn giới thiệu Mỹ năm 2003 Ngoài ra, sản phẩm Bt gen ngô kháng côn trùng dự kiến đưa vòng năm tới Do vậy, diện tích trồng ngô biến đổi gen toàn cầu với tính trạng kháng côn trùng chống chịu thuốc diệt cỏ đặc tính tổng hợp tăng đáng kể thời gian ngắn tới Với việc chuẩn y trồng đậu tương biến đổi gen Brazil vụ 2003/2004, diện tích trồng đậu tương biến đổi gen toàn cầu dự kiến có mức tăng trưởng cao thời gian tới Năm 2003, ba nước đông dân châu Á Trung Quốc, Ấn Độ Indonesia (tổng dân số 2,5 tỷ người GDP ba nước 1,5 nghìn tỷ đôla), ba kinh tế lớn châu Mỹ Latinh Argentine, Brazil Mexico (dân số 300 triệu người GDP 1,5 nghìn tỷ đôla) kinh tế lớn châu Phi Nam Phi (dân số 45 triệu người GDP 130 tỷ đôla) tất thức trồng trồng biến đổi gen Tổng số dân nước 2,85 tỷ người với GDP 3.000 tỷ đôla, người nhận lợi ích đáng kể mà trồng biến đổi gen đem lại Mười nước trồng biến đổi gen đứng đầu giới, nước trồng 50.000 năm 2003, có tổng dân số xấp xỉ tỷ người, gần nửa dân số giới GDP 13 nghìn tỷ đôla, khoảng nửa mức GDP toàn cầu 30 nghìn tỷ đôla Trong 174 Bán cầu châu Á, châu Phi, Mỹ La-tinh, bắc Mỹ, châu Âu châu Đại Dương Do vậy, bất đồng trồng biến đổi gen diện tích số lượng người trồng loại năm tiếp tục tăng hai số kể từ chúng giới thiệu vào năm 1996, năm 2003 có triệu nông dân thu lợi từ công nghệ Tài liệu tham khảo Bains W 2003 Biotechnology from A to Z Oxford University Press, Inc New York, USA Birch RG 1997 Plant Transformation: Problems and strategies for practical applications Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology 48: 297-326 Chrispeels MJ and Sadava DE 2003 Plants, Genes, and Crop Biotechnology.2nd Edition Jones and Bartlett Publishers, Massachusetts, USA Ratledge C and Kristiansen B 2002 Basic Biotechnology Cambridge University Press, UK Walker JM and Rapley R 2002 Molecular Biology and Biotechnology 4th Edition The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK Website: http://www.biotechvn.com i Mục lục Mở đầu I Một số khái niệm Chuyển gen 2 Ðộng vật (Thực vật) chuyển gen 3 Gen chuyển II Mục đích chuyển gen III Nguyên tắc việc tạo động (thực vật) chuyển gen IV Cơ chế hợp DNA ngoại lai vào genome Chương 1: Vector sử dụng công nghệ chuyển gen động vật thực vật 10 I Vector 10 II Các đặc tính vector 10 III Các bước tạo dòng phân tử 11 IV Các vector sử dụng để chuyển gen vào động vật thực vật 11 Các vector sử dụng để chuyển gen vào động vật 11 1.1 Vector sử dụng để thêm gen 11 1.2 Vector thay gen 35 1.3 Vector xếp lại gen đích 35 Các vector sử dụng để chuyển gen vào thực vật 39 2.1 Các vector biến nạp vào tế bào thực vật sử dụng Agrobacterium 39 2.2 Cơ chế chuyển T-DNA 44 2.3 Plasmid Agrobacterium vector biến nạp 45 2.4 Các thành phần vector Ti-plasmid 45 ii không gây ung thư 2.5 Các vector biến nạp thực vật không gây ung thư dựa Ti-plasmid 47 2.6 Vector biến nạp thực vật sử dụng A.rhizogenes 54 Chương 2: Các phương pháp chuyển gen 57 I DEAE-dextran 57 II Kỹ thuật calcium phosphat 58 III Chuyển gen qua liposome 59 IV Phương pháp vi tiêm 62 V Phương pháp chuyển gen nhờ vector virus 67 VI Chuyển gen cách sử dụng tế bào gốc phôi 69 VII Chuyển gen trực tiếp vào protoplast 72 VIII Chuyển gen kỹ thuật xung điện 73 IX Chuyển gen súng bắn gen 80 X Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium 84 XI Chuyển gen vào tinh trùng tiến thể tinh trùng 86 XII Kỹ thuật viên gen 91 Chương 3: Các phương pháp xác định diện biểu gen ngoại lai 94 I Southern blot 94 II Northern blot 95 III Western blot 98 IV ELISA Assay) (Enzymee-Linked Immunosorbent 99 V Phương pháp PCR 102 Các thành phần chủ yếu phản ứng PCR 102 2.1 DNA mẫu (DNA template) 102 iii 2.2 Mồi (primer) 102 2.3 Enzyme polymerase chịu nhiệt 104 2.4 Các loại nucleotid 104 2.5 Nước 105 2.6 Dung dịch đệm 105 2.7 Ion Mg2+ 105 Ba giai đoạn chu kỳ phản ứng PCR 105 2.1 Giai đoạn biến tính (denaturation) 106 2.2 Giai đoạn lai (hybridization) 106 2.3 Giai đoạn kéo dài (elongation) 106 Chương 4: Công nghệ chuyển gen động vật 111 I Khái niệm chung 111 Ðộng vật chuyển gen 111 Sự phát triển khoa học chuyển gen vào động vật 111 II Công nghệ tạo động vật chuyển gen 112 Tách chiết, phân lập gen mong muốn tạo tổ hợp gen biểu tế bào động vật 113 1.1 Tách chiết, phân lập gen mong muốn 113 Tạo tổ hợp gen chuyển biểu tế bào động vật 114 Tạo sở vật liệu biến nạp gen 116 Chuyển gen vào động vật 118 Nuôi cấy phôi ống nghiệm (đối với động vật bậc cao) 118 Kiểm tra động vật sinh từ phôi chuyển gen 119 Tạo nguồn động vật chuyển gen cách liên tục 119 III Những hướng nghiên cứu kết đạt đựơc 120 iv lĩnh vực tạo động vật chuyển gen Những hướng nghiên cứu tạo động vật chuyển gen 120 1 Taọ động vật có tốc độ lớn nhanh, hiệu sử dụng thức ăn cao 120 Tạo động vật chuyên sản xuất protein quý dùng y dược 121 Tạo động vật chống chịu bệnh tật thay đổi điều kiện môi trường 127 Nâng cao suất, chất lượng động vật cách thay đổi đường chuyển hóa thể động vật 127 Tạo vật nuôi chuyển gen cung cấp nội quan cấy ghép cho người 130 Tạo động vật chuyển gen làm mô hình nghiên cứu bệnh người 132 Tạo động vật chuyển gen làm mô hình nghiên cứu chất độc học 135 Một số thành tựu lĩnh vực tạo động vật chuyển gen 136 Chuột chuyển gen 137 2 Thỏ chuyển gen 139 Lợn chuyển gen 141 Cừu chuyển gen 142 Dê chuyển gen 143 Bò chuyển gen 143 Gà chuyển gen 143 Khỉ chuyển gen 150 Muỗi chuyển gen 152 2.10 Cá chuyển gen 156 IV Ứng dụng động vật chuyển gen 168 v Trong nghiên cứu 168 Trong nông nghiệp công nghiệp thực phẩm 169 Trong y học 169 Trong công nghiệp 170 V Một vài vấn đề nhận thức xung quanh động vật chuyển gen 170 Chương 5: Công nghệ chuyển gen thực vật 173 I Khái niệm chung 173 Khái niệm thực vật chuyển gen 175 Tóm tắt lịch sử phát triển công nghệ chuyển gen thực vật 176 II Một số nguyên tắc việc chuyển gen 178 Một số nguyên tắc sinh học 178 Phản ứng tế bào với trình chuyển gen 179 Các bước chuyển gen 180 III Các hướng nghiên cứu số thành tựu lĩnh vực tạo thực vật chuyển gen 182 Các hướng nghiên cứu 182 1.1 Cây trồng chuyển gen kháng nấm gây bệnh 183 1.2 Cây trồng chuyển gen kháng vi khuẩn gây bệnh 183 1.3 Cây trồng chuyển gen kháng virus gây bệnh 184 1.4 Cây trồng chuyển gen kháng côn trùng phá hoại 184 1.5 Cây trồng chuyển gen cải tiến protein hạt 184 1.6 Cây trồng chuyển gen sản xuất loại protein 185 1.7 Cây trồng chuyển gen mang tính bất dục đực 186 1.8 Thực vật biến đổi gen để sản xuất acid béo thiết yếu 186 vi 1.9 Phát triển hệ thống marker chọn lọc 187 1.10 Làm đất ô nhiễm 187 1.11 Làm thức ăn chăn nuôi 188 Một số thành tựu lĩnh vực tạo thực vật chuyển gen 189 2.1 Các trồng quan trọng phát triển 189 2.2 Các loại trồng phát triển 196 Tình hình trồng biến đổi gen trồng thương mại toàn cầu 197 3.1 Tiềm đóng góp trồng biến đổi gen 198 3.2 Trị giá trồng biến đổi gen toàn cầu 199 3.3 Nhận định trồng GM triển vọng chúng tương lai 199 vii CÁC TỪ VIẾT TẮT AIDS acquired immune deficiency syndrome: hội chứng thiếu miễn dịch tập nhiễm AFP antifreeze protein: protein chống lạnh AgCP A gambiae carboxypeptidase promoter Alb albumin ALV Avion leukosis virus: virus leukosis chim ANV Avion necrosis virus: virus hoại tử lách gà ANDi inserted DNA ARS autonomous replicating sequence: trình tự chép tự chủ ASGHG Atlantic salmon growth hormone gene: gen hormone sinh trưởng cá hồi Ðại tây dương BAC bacteria artificial chromosome: nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn bGH bovin growth hormone: hormone sinh trưởng bò bp base pair: cặp base CAT chloramphenicol acetyltransferase cDNA complementary DNA: DNA bổ sung CEN centromeric sequence: trình tự tâm động nhiễm sắc thể CMV cytomegalovirus CMV-IEP cytomegalovirus immediate early promoter Cys cystein dATP 2’-deoxyadenosine 5’-triphosphate dCTP 2’-deoxycytidine 5’-triphosphate dGTP 2’-deoxyguanosine 5’-triphosphate dTTP 2’-deoxythymidine 5’-triphosphate viii dsDNA double strand complement DNA: DNA bổ sung mạch kép DNA deoxyribonucleic acid EBNA Epstein-Barr nuclear antigen EBV Epstein-Barr virus EBP Epstein-Barr protein ELISA enzyme-linked immunosorbent assay: xét nghiệm miễn dịch liên kết enzyme GFP green fluorescent protein: protein huỳnh quang màu xanh GH growth hormone: hormone sinh trưởng GIH growth hormone inhibiting hormone: hormone ức chế hormone sinh trưởng GMA genetically modified animal: động vật biến đổi gen GMO genetically modified organism: sinh vật biến đổi gen GMP genetically modified plant: thực vật biến đổi gen GRH growth hormone releasing hormone: hormon giải phóng hormone sinh trưởng HAC human artificial chromosome: nhiễm sắc thể nhân tạo người HCG chorionic gonadotropin hormone hGH human growth hormone: hormone sinh trưởng người hGRF human growth hormone releaseing factor: yếu tố giải phóng hormone sinh trưởng người hiGF human insulin like growth factor: yếu tố sinh trưởng giống insulin người HIV human immunodeficiency virus: virus làm thiếu hụt miễn dịch người ix ICSI intracytoplasmic sperm injection: tiêm tinh trùng mang plasmid tái tổ hợp cách trực tiếp vào tế bào chất trứng IHNV hematopoietic necrosis virus ITR inverted repeated sequence: trình tự lặp lại đảo ngược kb kilobase LB left border: biên trái LTR long terminal repeat: đoạn lặp lại đầu tận dài MAC mammifere artificial chromosome: nhiễm sắc thể nhân tạo động vật có vú MCS multiple cloning site Mo-MLV Moloney murine leukemia virus: virus bạch cầu chuột Moloney mMT mouse methallothionein: methallothionein chuột mRNA messenger RNA: RNA thông tin MT methallothionein NLS nuclear localization signal: tín hiệu định vị nhân PCR polymerase chain reaction: phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymease pGH porcine growth hormone: hormone sinh trưởng lợn PL phospholipase pNpGB p-nitrophenol p-guanidinobenzoate PRL prolactin PTM plant transformation marker: vector biến nạp thực vật RB right border: biên phải REMI restriction enzyme mediated intergration: hợp x qua trung gian ezyme hạn chế Ri-plasmid root inducing plasmid: palsmid gây lông tơ thực vật RNA ribonucleic acid RSV Rous sarcoma virus RT-PCR reverse transcriptase-PCR SDS-PAGE sodium dodecyl electrophoresis sGH sheep growth hormone: hormonesinh trưởng cừu sMT sheep methallothionein: methallothionein cừu ss cDNA single strand complement DNA: DNA bổ sung mạch đơn SV40 Simian virus T-DNA transferred DNA: DNA chuyển Ti-plasmid tumour inducing plasmid: plasmid gây khối u thực vật TK thymidine kinase TL T-left T-DNA Tm melting (or midpoint) temperature: nhiệt độ nóng chảy TR T-right T-DNA VIR virulence region: vùng gây độc VSV vesicular somatitis virus YAC yeast artificial chromosome: nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men sulfate-polyacrylamide gel Bảng 1.1: Một số vector Ti-plasmid liên hợp Vector tạo dòng (trung gian) Plasmid vir vật chủ liên hợp Vùng tương đồng Ori Plasmid hỗ trợ chuyển gen Marker chọn lọc vi khuẩn Sm/Sp Biên T-DNA Marker chọn lọc thực vật Nos / ocs Rb(SEV) pTiT37 nos-npt-II Nos Các vị trí EcoRI, HindIII, XbaI, XhoI Sm/Sp Rb(SEV) pTiT37 CaMV35Snpt-II Nos Các vị trí HindIII Các vị trí BglII, ClaI, KpnI EcoRI promoter CaMV-35S vị trí poly A Nos EcoRI Các trình tự pR322 lặp biên T-DNA Bam HI Các trình tự pR322 lặp không biên T-DNA pMON200 (9,5 kb) pTiB6S3-SE (GV3111) LIH pBR322 (Col E1) pMON273 (10 kb) pTiB6S3-SE (GV3111) LIH pBR322 pR64drdll pGJ23 (JM101) JM101 pMON316 (11 kb) pTiB6S3-SE (GV3111) LIH pBR322 JM101 Sm/Sp Rb(SEV) pTiT37 nos-npt-II Nos pGV1103 (6,5 kb) pGV3850-SE (C58C1) gen Apr pBR322 Jm101 Km Không có nos-npt-II - pGV831 (8,9 kb) pGV2260 (C58C1) pBR322 JM101 Sm/Sp nos-npt-II Ocs gen Apr Rb/Lb pTiB6S3 Vị trí tạo dòng thích Bảng 1.2: Một số vector nhị thể Plasmid hỗ trợ gây độc Nguồn gốc loại vật chủ mở rộng pBin19 (10 kb) pAL4404 (mất thể đột biến pTiAch5) pKB252 (có nguồn gốc từ pRK2) HB101/ C58C1 pRK2013 (HB101) pAGS113 (16 kb) pAL4404 pRK2 HB101/ C58C1 pRK2013 (HB101) pAGS125 (17,6 kb) pAL4404 pRK2 HB101/ C58C1 pARC8 (28 kb) pRiA4 pRK2 Binary (17 kb) pAL4404 pGA469 (10,8 kb) pGV2260 (C58C1) Vector tạo dòng Dòng vật chủ Plasmid hỗ trợ chuyển gen Marker chọn lọc vi khuẩn Km Biên T-DNA Marker chọn lọc thực vật Nos /ocs Vị trí tạo dòng thích Rb/Lb pTiT37 nos-npt-II - Các vị trí EcoRI, HindIII, Sst I, SmaI, XbaI SalI Sàng lọc IPTG+XGAL Km Rb/Lb pTiA6/Ach5 nos-npt-II - ClaI, BamHI pRK2013 (HB101) Km, Tc Rb/Lb pTiA6/Ach5 nos-npt-II - ClaI, BamHI HB101/ A4 pRK2013 (HB101) Tc, Ap+ Rb/Lb pTiT37 nos-npt-II - EcoRI, Hind III pKT240 LE392/ C5851 pRK2013 (mm294) Sm, Gm Rb/Lb pTiT37 nos-npt-II Nos pTJS75 (có nguồn gốc từ RK2) K802/ AI36 pRK2073 Tc Rb/Lb pTiT37 nos-npt-II - EcoRI, KpnI, SmaI, XbaI, SalI EcoRI, HindIII ... Việc chuyển gen ngoại lai vào động vật (thực vật) thành công gen di truyền lại cho hệ sau 4 Cho đến nay, giới người ta thành công việc tạo nhiều thực vật, động vật chuyển gen Ở động vật, không động. .. Việc chuyển gen ngoại lai vào động vật (thực vật) thành công gen di truyền lại cho hệ sau 5 Cho đến nay, giới người ta thành công việc tạo nhiều thực vật, động vật chuyển gen Ở động vật, không động. .. để chuyển gen động vật thực vật Các vector sử dụng để chuyển gen động vật 1.1 Vector sử dụng để thêm gen Phần lớn vector sử dụng để tạo động vật chuyển gen cách thêm gen xây dựng để hợp vào genome