Luận án tiến sĩ sàng lọc và biểu hiện gen mã hoá protein ức chế protease củacủa vi sinh vật liên kết hải miên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - TRẦN THỊ HỒNG SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN Spheciospongia vesparium THU NHẬN TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG, VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI, 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - TRẦN THỊ HỒNG SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN Spheciospongia vesparium QT2 THU NHẬN TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG, VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS.NCVCC Phạm Việt Cường PGS.TS Nguyễn Thị Kim Cúc Hà Nội, 2020 LỜI CÁM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.NCVCC Phạm Việt Cường, nguyên Viện trưởng Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam- Nhà Khoa học mẫn cán, người thầy mẫu mực- người giúp định hướng nội dung, giúp đỡ tinh thần, kiến thức chuyên môn, sở vật chất bảo tận tình giúp tơi vượt qua nhiều khó khăn để hoàn thành Luận án suốt năm qua Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kim Cúc, Chủ nhiệm đề tài ĐTĐLCN.17/14 “Nghiên cứu metagenome vi sinh vật liên kết hải miên biển miền Trung Việt Nam nhằm phát sàng lọc chất hoạt tính sinh học mới” định hướng cho luận án quan tâm, giúp đỡ suốt thời gian thực luận án Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung cử học, tập thể Trung tâm sinh học Phân tử Nghĩa Đơ, Ths.NCS Tơn Thất Hữu Đạt, phịng quản lý tổng hợp Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung tạo điều kiện cho tơi làm việc, hồn thành thủ tục giấy tờ hoàn thiện nội dung nghiên cứu Tôi trân trọng cảm ơn Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Công nghệ Sinh học tạo điều kiện thuận lợi sở vật chất giúp đỡ tơi hồn thành thủ tục cần thiết q trình học tập Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè người thân bên cạnh động viên, giúp đỡ, chia sẻ tạo điều kiện tốt cho tơi học tập, nghiên cứu hồn thiện luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả NCS Trần Thị Hồng i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, số kết lần cơng bố tạp chí khoa học chun ngành có uy tín với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả NCS Trần Thị Hồng ii MỤC LỤC Lời cảm ơn i Lời cam đoan .ii MỤC LỤC SLIQVLTELDPAVETAIGNSVWTRLGFPLRAEFVDVLREFFGAEAAELDFAGPSASGRVNE WVRSATGGHIEEIVPDPIPPAVLMFLINAIYFNAPWTFEFDPDDTRTEPFYPEDRSPREVPLMTILRDFLYL ETSRFQAVDLPYGGGAFSMTVLVPREDVRVDDVVASLDAPAWSDVTGGFEETEVELFLPRFRMEYERE LKDDLAALGMVDAFSPGKADLTRLSPVDLSISSVRQKALVEVTEEGTEAAAATVVIGVTSAPPPPVTVR ADRPFLFFIRERLTGAIIFVGKVAHPPPR 26 Prokka_130363 Met K T Q L T L L L A L L A P L P A L S I G Y V Y T G V G D D G R Q H L E L T S V T V D V Q I D E RIARTRTDQIFTNHAEWEVEGIYEFTLPEGAIITDLVLWIGDKRIQG EVLE K E E A R R T Y D D I V G R R I D P A L I E Q V S P N Q F R L S I F P F P A K G S R R V E F E Y Met Q L L E S H S G R L D Y S F P L A P E T D Q P L Q Met E L F V L R A Q V R S Q H A F E A T T S G L P R LTEIDRPDAHRANIFFGDEKIKPREDFTLTIRQTDDRPKPTVLSFAPRAND D L G Y Y A L W L P P L P E L T R D G P L P R S L T F V I D I S S S Met Q E G K L R A V K G A L T A AIDALDAGDLFNIVVFTHRANSFAAAPVPADPDNKKAATAFINQQDALG V S N F E A G L G R A Met Q Q A F P A N R V N H V I F L T D G L P T I G E L E L A S L S E Met V G E WSAGQARLFTIGVGQDVDQGFLSGLAEDHRGEAYFLSEEGDIEAALQEL FESFTFPILLLDELSFDQVEIHDVHPRGLETLAAGRELFQVGRYRGGGTF T L S L A G H Met G E E N Met S L D F P L E F T Q T D V S G S L I P R L W A Y Q K I Q A L E E Q I S RFGEKQELLDDILALGLEYRLVTRRTSLFAPDDGVEVNPQPRDQVALNF GGIDDLFDSSSESDQEEDDEFFSTAVNDARPTTHWLGRDFFLYDEVWIDL A Y Q P G Met P R E L Y E S R T Y Q P A E L A H F A R L G Q A Met L V V V E E R A Y E I P A D A Q GSRPVLLQNAPNPFNASTTISFLIPFRLANEPTRLSIYNLAGQLVRVLQLE A L Q A G E H R L S W D G R D D Y G R E V A S G V Y I Y R L D V G E W A V H R R Met L L L R Stop 27 Phụ lục 11 Trình tự gen, axít amin PI-QT Trình tự gen ATGACAAAAC AGTTGATTAA TGCAACGATC ATCGCATGTG TCGGATTGAT TTATCTGCTT GGGTGTTCAG 71 GTGAAGAAGA TGTGTTGCAT GAGGATGAAC TTCTTGAGAT GTCTCTTGAA GAAGGAGCCC CAACGGCACC 141 TGATGGGTGT GCAATTTTAG CAAAGCCTGC TGGTTTCACC GATAATGCAC TGTCCGAAGC AAATGCAAAG 211 TTCGGCTTTA AACTACTCGC CGAACTGTAT AATCAAAAAC CCAACAAAAA CGTCTTTATC TCCCCATTAA 281 GCATTTCGAT AGCTTTGACC ATGACATATA ATGGTGCCAG AGGCGCAACA AAACAGGCAA TGGCAAAGAC 351 GCTAGAGATC GAGGGAATGG ACCTGGGTGC GGTCAACCAA GCTAACGCCG AGTTACGAGA AATCCTTAAG 421 AGCGCAGATC CCCAGATTGA ACTTGCCATC GCCAACTCGA TCTGGCTACG GAACACGTTT GATGAAGTAA 491 ATCCCGATTT CCTTGACCGA AATGATCGAT TCTTTGGCGC AGAGATTGCT TCGCTTGATT TTGACGATCC 561 GCAAACAGTA GAGACCATCA ACCAATGGGT GAACACGAAC ACACAGGGAA AAATCAAGGA GATTCTAGGT 631 GAAATTGAGG AGCACGAAGT TATGTTCCTG ATTAACGCCA TCTATTTTAA GGGCGGCTGG AAAGGAAAGT 701 TCGACGCATC AAAAACACAG GACGGTGTTT TCCATCTGTT GGATGGTGGC GAGAAGCAGG TGCCCATGAT 771 GTCCCACACC TGCAATTATT CGTATCTTGA GAGCGGAGAC TTTAGGGCTG TTGGCTTACC TTATGGAGAG 841 GGACGTGTAA GCATGTATAT CTTTCTGCCG GAGCATTCCT CCAATCTTGA CGAATTTCTT GCAGATTTGA 911 ACGCCGAGAA CTGGGAGAAC TGGCTGTCGC GGTTTTGGAA TGAACGGGAT TTGAGATTTA TAATGCCTCG 981 CTTTAGACTA GAGTATGGAA TGCTTCTCAA TGACGCGCTC AAAGCACTCG GCATGGAAAT TGCCTTTATT 1051 CCGTACGTAG CCAATCTTGA GGGCATTGCG CCTCTTTTGT TTATTGAAAA AGTCATACAC AAAACTTTTT 1121 TGGAAGTCAA CGAAGAAGGC ACCGAAGCGG CTGCCGTAAC GTTGGTTAGT CCACCACCGG CGAGCACTCC 1191 GGGGCCCTTT GTTGTAAACC GCCCCTTTTT CTTCGCCATC CATGACAATT GGACAAACAC AATATTGTTC 1261 ATGGGAATTG TCGTCGAACC GATGTAG Trình tự axit amin Met T K Q L I N A T I I A C V G L I Y L L G C S G E E D V L H E D E L L E Met S L E EGAPTAPDGCAILAKPAGFTDNALSEANAKFGFKLLAELYN Q K P N K N V F I S P L S I S I A L T Met T Y N G A R G A T K Q A Met A K T L E I E G Met D L G A V N Q A N A E L R E I L K S A D P Q I E L A I A N S I W L R N T F D E VNPDFLDRNDRFFGAEIASLDFDDPQTVETINQWVNTNTQG K I K E I L G E I E E H E V Met F L I N A I Y F K G G W K G K F D A S K T Q D G V F H L L D G G E K Q V P Met Met S H T C N Y S Y L E S G D F R A V G L P Y G E G R V S Met Y I F L P E H S S N L D E F L A D L N A E N W E N W L S R F W N E R D L R F I Met P R F R L E Y G Met L L N D A L K A L G Met E I A F I P Y V A N L E G I A P LLFIEKVIHKTFLEVNEEGTEAAAVTLVSPPPASTPGPFVVN R P F F F A I H D N W T N T I L F Met G I V V E P MetStop 28 So sánh trình tự acid amin nhằm tìm kiếm chức gen tương đồng ngân hàng liệu Uniprot Phụ lục 12 So sánh kết giải trình tự gen tách dịng pUC57, pET32a(+) với gen đích Chú thích: gen MK359987.1 mã số trình tự gen đích đăng ký NCBI 29 Phụ lục 13 Các phương pháp sử dụng thu hồi nhận diện protein PI-QT 13.1 Thu protein từ môi trường nuôi cấy phương pháp tủa muối Môi trường nuôi cấy tế bào ly tâm 5000 v/p, 10 phútthu dịch Sau tủa protein muối (NH2)2SO4 Phương pháp tủa sử dụng tương đối rộng rãi để thu nhận phân tử sinh học mà protein Tủa muối phương pháp phổ biến để tủa protein Khả hòa tan protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hóa tự nhiên protein, pH, nhiệt độ, nồng độ muối… Ở nồng độ muối thấp, tính tan protein tăng nhẹ (salting in) Tuy nhiên, nồng độ muối cao, tính tan protein giảm mạnh (salting out).Vì vậy, muốn tách protein từ hỗn hợp gồm nhiều protein khác nhau, ta lựa chọn nồng độ muối thích hợp cho phù hợp với protein mục tiêu Tiến hành tủa protein dải nồng độ muối khác điều kiện ºC với loại muối (NH2)2SO4 loại Trung Quốc, loại hãng Merk (Đức) Nồng độ Khối lượng muối; thể tích cuối 0-30 % 16.98 g; 109.02 ml 30-50 % 12.04 g; 106.39 ml 50-75 % 16.36 g; 108.69 ml 75-100 % 17.92 g; 109.52 ml Bổ sung lượng muối cần thiết vào phần dịch sau ly tâm, lắc ºC, vòng 12 h Ở nồng độ muối, sau tủa tiến hành thu dịch tủa ly tâm 12000 v/p 30 phút ºC để thu protein Sau đó, lượng tủa protein hịa lại đệm Tris/HCl 50 mM, pH 7.0, vortex cho tan ly tâm lần để loại bỏ cặn cịn sót lại Các hỗn hợp protein tủa nồng độ khác kiểm tra điện di SDS-PAGE.Sau dựa vào kích thước lý thuyết protein quan tâm, cắt băng 30 protein khỏi gel tiến hành thủy phân, tách chiết protein để nhận diện khối phổ MS/MS 13.2 Tinh protein sắc ký lọc gel với cột Sephacryl-S200 hệ thống FPLC Sắc ký lọc gel dùng để phân tách phân tử dựa khác kích thước phân tử Hỗn hợp protein thu sau tủa với muối (NH4)2SO4được loại muối phương pháp thẩm tích ºC 24 h Dịch protein sau loại muối cho qua cột sắc kí lọc gel với chất giá Sephacryl-S200 Mẫu hệ thống mẫu tự động FPLC với tốc độ dòng 0.5 ml/ phút dung dịch đệm Tris/HCl 50mM pH 7.0 có bổ sung Sodium azide (NaN3) 0.2 %,thu phân đoạn ml Kiểm tra phân đoạn điện di SDS-PAGE Sau gộp phân đoạn chứa protein quan tâm cho qua màng lọc cut off 30 kDa (Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit) sản phẩm thu gồm phần: phần hỗn hợp protein< 30 kDa phần >30 kDa.2 phần sản phẩm kiểm tra điện di SDS-PAGE Dựa vào kích thước tính tốn lý thuyết protein quan tâm, tiến hành nhận diện băng protein phương pháp thủy phân gel, tách chiết nhận diện protein mục tiêu phân tích khối phổ MS (quy trình mục 5.4) 13.3 Thu protein từ vi khuẩn E coli Thu 1L dịch tế bào ly tâm 4000 v/p 10 phút ºC loại môi trường Cặn tế bào rửa hòa lại 100 mL dung dịch đệm lysis buffer (Tris/HCl 50mM, Triton X-100 0.5 %, lysozyme 10 µg/mL, pH 7.0) ủ 30ºC 30 phút Sau tế bào phá vỡ siêu âm với xung ngắn (200-300 µA) khoảng 3s đá lạnh Siêu âm dịch tế bào hết nhầy tan Tiếp tục ly tâm dịch tế bào 14000 v/p, 30 phút ºC để tách phần dịch cặn tế bào.Kiểm tra điện di phần dịch cặn tế bào điện di SDS-PAGE.Đưa phần dịch qua cột sắc kí lực Ni-NTA agarose rửa protein không bám đệm Tris HCL 50 mM với mM Imidazol.Protein bám cột Imidazol với nồng độ ,100 mM, 300 mM 500 mM Các phân đoạn sau tinh kiểm tra điện di SDS-PAGE ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO VI? ??N HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI? ??T NAM HỌC VI? ??N KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - TRẦN THỊ HỒNG SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN... VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN Spheciospongia vesparium QT2 THU NHẬN TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG, VI? ??T NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG... thành Luận án suốt năm qua Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kim Cúc, Chủ nhiệm đề tài ĐTĐLCN.17/14 “Nghiên cứu metagenome vi sinh vật liên kết hải miên biển miền Trung Vi? ??t