Luận án tiến sĩ nghiên cứu vai trò của các yếu tố phiên mã NAC đáp ứng với điều kiện hạn ở cây họ đậu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN HỮU KIÊN NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA CÁC YẾU TỐ PHIÊN MÃ NAC ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN HẠN Ở CÂY HỌ ĐẬU LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI – 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN HỮU KIÊN NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA CÁC YẾU TỐ PHIÊN MÃ NAC ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN HẠN Ở CÂY HỌ ĐẬU Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Văn Đồng TS Trần Phan Lam Sơn HÀ NỘI - 2020 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Văn Đồng TS Trần Phan Lam Sơn Các kết trình bày luận án trung thực, phần công bố Tạp chí khoa học quốc tế đồng ý tất tác giả báo, chưa sử dụng để cơng bố cơng trình nghiên cứu để nhận học vị khác Tất trích dẫn ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2020 TÁC GIẢ Nguyễn Hữu Kiên i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin chân thành cảm ơn chương trình đào tạo hợp tác quốc tế IPA (International Program Associate) liên kết Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam (VAAS, Việt Nam) Viện Nghiên cứu RIKEN Nhật (Bản) tạo điều kiện giúp đỡ suốt q trình học tập, thực hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Văn Đồng (Ngun Giám đốc Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp) TS Trần Phan Lam Sơn (Trưởng Nhóm nghiên cứu đường dẫn truyền tín hiệu (nay đổi tên thành Nhóm nghiên cứu đáp ứng với yếu tố bất lợi) thuộc Trung tâm Khoa học nguồn tài nguyên bền vững, Viện RIKEN, Nhật Bản) tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để thực hồn thành cơng trình nghiên cứu Tơi xin gửi lời cảm ơn tới postdoc, kỹ thuật viên nhân viên nhóm nghiên cứu TS Trần Phan Lam Sơn, nơi thực nội dung luận án hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện vể thời gian cho tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Đào tạo Sau đại học, thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam lãnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp tạo điều kiện cho suốt q trình học tập hồn thành luận án nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình đặc biệt bố mẹ, anh chị vợ ủng hộ, động viên, khích lệ chỗ dựa tinh thần cho tơi suốt q trình học tập hồn thành luận án nghiên cứu Ngồi ra, tơi gửi lời cảm ơn tới bạn bè đồng nghiệp ln ủng hộ có ý kiến đóng góp q báu để tơi hồn thành luận án nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2020 TÁC GIẢ Nguyễn Hữu Kiên ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH xii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu luận án 2.1 Mục tiêu tổng quát 2.2 Mục tiêu cụ thể Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Những đóng góp luận án Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hạn hán ảnh hưởng bất lợi hạn hán trồng 1.1.1 Những thiệt hại ngành trồng trọt hạn hán gây 1.1.2 Hạn hán nguyên nhân gây hạn hán trồng 11 1.1.3 Ảnh hưởng hạn trồng 12 1.1.3.1 Ảnh hưởng hạn tới sinh trưởng phát triển trồng 13 1.1.3.2 Ảnh hưởng hạn tới đặc điểm hình thái giải phẫu 14 1.1.3.3 Ảnh hưởng hạn tới mối quan hệ nước 15 1.1.3.4 Ảnh hưởng hạn tới trình quang hợp 15 1.1.3.5 Ảnh hưởng hạn tới trình hô hấp 17 1.1.3.6 Ảnh hưởng hạn tới hấp thu dinh dưỡng khoáng 18 1.1.3.7 Ảnh hưởng hạn tới cân hormone 18 1.1.3.8 Ảnh hưởng hạn tới hàm lượng protein, axit amin khoáng chất 19 iii 1.1.3.9 Ảnh hưởng hạn tới lipid 22 1.1.3.10 Ảnh hưởng hạn tới q trình oxy hóa 22 1.1.3.11 Ảnh hưởng hạn tới phân tử 23 1.2 Sự đáp ứng trồng với hạn 24 1.3 Vai trị yếu tố phiên mã NAC q trình đáp ứng với stress hạn trồng 27 1.3.1 Tổng quan yếu tố phiên mã NAC 27 1.3.2 Cấu trúc đặc trưng protein NAC 29 1.3.3 Chức yếu tố phiên mã NAC trình đáp ứng với hạn trồng 29 1.4 Vai trò họ đậu 35 1.4.1 Vai trò đậu tương 35 1.4.2 Vai trò đậu gà 37 1.4.3 Ảnh hưởng hạn tới đậu tương đậu gà 39 1.5 Cải thiện khả chống chịu hạn họ đậu sử dụng kỹ thuật chuyển gen 43 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47 2.1 Vật liệu nghiên cứu 47 2.1.1 Vật liệu thực vật 47 2.1.2 Các chủng khuẩn, nấm men vector 47 2.1.3 Các cặp mồi sử dụng cho PCR qRT-PCR 47 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 47 2.2.1 Thời gian nghiên cứu 47 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 48 2.3 Phương pháp nghiên cứu 48 2.3.1 Trồng xử lý đậu tương 48 2.3.2 Tách chiết, tinh RNA tổng hợp cDNA cho tách dòng gen GmNAC085 48 2.3.3 Thiết kế cấu trúc vector phân tích khả hoạt động phiên mã GmNAC085 nấm men 49 iv 2.3.4 Thiết kế cấu trúc vector biểu gen GmNAC085 mơ hình Arabidopsis 50 2.3.5 Phương pháp biến nạp sàng lọc Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 52 2.3.6 Phương pháp phân tích chuyển gen 35S:GmNAC085 kỹ thuật lai southern blot 53 2.3.7 Đánh giá khả sinh trưởng Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 điều kiện thường 53 2.3.8 Phương pháp đo hàm lượng diệp lục 54 2.3.9 Đánh giá khả chịu hạn Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 điều kiện xử lý hạn 54 2.3.9.1 Phương pháp đánh giá hạn khay 55 2.3.9.2 Phương pháp cân trọng lượng cốc 55 2.3.10 Phương pháp đo nhiệt độ bề mặt WT chuyển gen 35S:GmNAC085 điều kiện xử lý hạn 56 2.3.11 Đo tỷ lệ thành phần nước, mức độ rò rỉ ion độ ẩm đất 56 2.3.12 Xác định hàm lượng malondiadehyde khả hoạt động enzyme chống oxy hóa 57 2.3.13 Phương pháp trồng, xử lý thu mẫu đậu gà 57 2.3.14 Tách chiết RNA, xử lý DNAseI, tổng hợp cDNA cho phân tích qRT-PCR 58 2.3.15 Phân tích biểu gen kỹ thuật qRT-PCR 58 2.3.16 Tiêu chuẩn lựa chọn gen CaNAC đáp ứng hạn tiềm 59 2.3.17 Phân tích ý nghĩa thống kê 60 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 61 3.1 Nghiên cứu chức gen GmNAC085 trình đáp ứng với điều kiện hạn mơ hình Arabidopsis 61 3.1.1 Kết thiết kế cấu trúc vector phân tích hoạt động phiên mã GmNAC085 nấm men 61 3.1.2 Kết phân lập thiết kế vector biểu gen GmNAC085 mơ hình Arabidopsis 63 v 3.1.3 Kết sàng lọc lựa chọn dòng Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 66 3.1.4 Kết đánh giá kiểu hình Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 OE2 điều kiện thường 68 3.1.5 Kết đánh giá khả kháng hạn Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 70 3.1.6 Kết đánh giá mức độ phá hủy tế bào tốc độ thoát nước chuyển gen 35S:GmNAC085 điều kiện xử lý hạn 72 3.1.7 Sự biểu GmNAC085 tăng cường bảo vệ Arabidopsis chuyển gen chống lại phản ứng oxy hóa stress hạn gây 74 3.1.8 Sự biểu GmNAC085 làm tăng mức biểu gen thị Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 điều kiện stress hạn 77 3.2 Đánh giá mức độ biểu gen CaNAC đậu gà điều kiện xử lý hạn ABA 84 3.2.1 Kết so sánh tỷ lệ thành phần nước hai giống đậu gà Hashem ILC482 điều kiện xử lý nước 84 3.2.2 Đặc trưng biểu gen CaNAC rễ giống Hashem ILC482 điều kiện xử lý hạn 85 3.2.3 Đặc trưng biểu gen CaNAC rễ giống Hashem ILC482 điều kiện xử lý ABA 94 3.2.4 Sự biểu khác gen CaNAC giống ILC482 Hashem 102 3.2.5 Sự biểu khác gen CaNAC rễ giống ILC482 Hashem 105 3.2.6 Lựa chọn gen CaNAC tiềm cho nghiên cứu chức sâu 107 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 113 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 115 TÀI LIỆU THAM KHẢO 116 PHỤ LỤC 134 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Thuật ngữ tiếng anh Thuật ngữ tiếng việt ABA Abscisic acid Axit abscisic Ade Adenine A-đê-nin ABRC3 ABA response complex Phức hợp đáp ứng ABA AD Activation domain Vùng trình tự hoạt hóa AP2/ERF APETALA2/Ethylene response Các yếu tố liên kết đáp ứng element binding factors với ethylene APX Ascorbate peroxidase Ascorbate peroxidase AREB/ABF Abscisic acid-responsive Liên kết yếu tố đáp ứng ABA element binding ATP Adenosine triphosphate Adenosine triphosphat bZIP bZIP transcription factor Yếu tố phiên mã bZIP CAT Catalase Catalaza CCA1 Circadian clock associated Liên kết nhịp sinh học cDNA complementary DNA ADN bổ sung CO2 Carbon dioxide cacbon điơxít CSD1 Copper/Zinc superoxide Copper/Zinc superoxide dismutase dismutase D Drought Xử lý hạn DAD Days after drought Ngày sau xử lý hạn DNA Deoxinucleic acid Axit deoxinucleic DREB Dehydration responsive Protein liên kết với yếu tố đáp element-binding protein ERD1 GM Early ứng nước to Đáp ứng sớm với bất lợi responsive dehydration stress nước Germination medium Môi trường nảy mầm vii GR Glutathione reductase Glutathione reductase His Histidine Histidin IAA Indole-3-acetic acid Axit indole-3-acetic LB Lysogeny broth Môi trường giàu dinh dưỡng nuôi khuẩn E.coli LEA Late embryogenesis abundant Sự phát triển phôi muộn LHY Late elongated hypocotyl Chậm kéo dài trụ mầm MDA Malondiadehyde Malondialdehyd MGDG Monogalactosyldiacylglycerol Monogalactosyldiacylglycerol miRNA microRNA ARN không mã hóa mRNA Messenger RNA RNA thơng tin MYB/MYC MYB/MYC transcription Yếu tố phiên mã MYB/MYC factor NAC NAM (no apical meristem), Yếu tố phiên mã NAC ATAF1/2, CUC2 (cup- shaped cotyledon) NACRS NAC recognition sequence NADPH Nicotinamide adenine Nicotinamit dinucleotide phosphate NCED Nine-cis-epoxy Trình tự nhận biết NAC adenin dinucleotit phosphat carotenoid Nine-cis-epoxy carotenoid dioxygenase dioxygenase O2- Superoxide Superoxit OE Overexpression Sự biểu PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase POD Peroxidase Peroxidase PSI Photosystem I Hệ thống quang hợp I PSII Photosystem II Hệ thống quang hợp II qRT-PCR Quantitative real-time PCR PCR định lượng thời gian thực viii 6, pp 902 109 Singh B., Singh B., Kumar V., Singh P., Pawan K.J., Shefali M., Singh N (2015), “Haplotype diversity and association analysis of SNAC1 gene in wild rice germplasm”, Indian Journal of Genetics and Plant Breeding, 75(2), pp 157-166 110 Singh B.P., Jayaswal P.K., Singh B., Singh P.K., Kumar V., Mishra S., Singh N., Panda K., Singh N K (2015), “Natural allelic diversity in OsDREB1F gene in the Indian wild rice germplasm led to ascertain its association with drought tolerance”, Plant Cell Rep, 34(6), pp 993-1004 111 So H.A., Lee J.H (2019), “NAC Transcription Factors from Soybean (Glycine max L.) Differentially Regulated by Abiotic Stress”, Journal of Plant Biology, 62(2), pp 147-160 112 Song, S.Y., Chen Y., Chen J., Dai X.Y., Zhang W.H (2011), “Physiological mechanisms underlying OsNAC5-dependent tolerance of rice plants to abiotic stress”, Planta 234, pp 331-345 113 Takasaki H., Maruyama K., Kidokoro S., Ito Y., Fujita Y., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K., Nakashima K (2010), “The abiotic stress-responsive NAC-type transcription factor OsNAC5 regulates stress-inducible genes and stress tolerance in rice”, Molecular Genetics and Genomics 284, pp 173-183 114 Thao N.P., Thu N.B., Hoang X.L., Van Ha C., Tran L.S (2013), “Differential expression analysis of a subset of drought-responsive GmNAC genes in two soybean cultivars differing in drought tolerance”, International journal of molecular sciences 14, pp 23828-23841 115 Thirumalaikumar V.P., Devkar V., Mehterov N., Ali S., Ozgur R., Turkan I., Mueller-Roeber B., Balazadeh S (2017), “NAC transcription factor JUNGBRUNNEN1 enhances drought tolerance in tomato”, Plant biotechnology journal 16, pp 354-366 116 Thu N.B.A., Nguyen Q., Hoang X., Thao N., Tran L.S (2014a), “Evaluation of drought tolerance of the Vietnamese soybean cultivars 129 provides potential resources for soybean production and genetic engineering”, Journal of Biomedicine and Biotechnology, pp 809736 117 Thu N.B.A., Hoang X.L., Doan H., Nguyen T.H., Bui D., Thao N.P., Tran L.S (2014b), “Differential expression analysis of a subset of GmNAC genes in shoots of two contrasting drought-responsive soybean cultivars DT51 and MTD720 under normal and drought conditions”, Molecular biology reports 41, pp 5563-5569 118 Thu N.B.A., Hoang X.L.T., Nguyen T.D.H., Thao N.P., Tran L.S.P (2014c), “Differential expression of two-component system-related drought-responsive genes in two contrasting drought-tolerant soybean cultivars DT51 and MTD720 under well-watered and drought conditions”, Plant Molecular Biology Reporter 33, pp 1599-1610 119 Tizaoui K., Kchouk M.E (2012), “Genetic approaches for studying transgene inheritance and genetic recombination in three successive generations of transformed tobacco”, Genetics and molecular biology 35, pp 640-649 120 Tran L.S., Mochida K (2010), “Functional genomics of soybean for improvement of productivity in adverse conditions”, Functional & integrative genomics 10, pp 447-462 121 Tran L.S., Nakashima K., Sakuma Y., Simpson S.D., Fujita Y., Maruyama K., Fujita M., Seki M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2004), “Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC transcription factors that bind to a drought-responsive cis-element in the early responsive to dehydration stress promoter”, Plant Cell 16, pp 2481-2498 122 Tran L.S., Nishiyama R., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K (2010), “Potential utilization of NAC transcription factors to enhance abiotic stress tolerance in plants by biotechnological approach”, GM crops 1, pp 32-39 123 Voitsik A.M., Muench S., Deising H.B., Voll L.M (2013), “Two recently duplicated maize NAC transcription factor paralogs are induced in response to 130 Colletotrichum graminicola infection”, BMC Plant Biol 13, pp 85 124 Wang J., Zhang L., Cao Y., Qi C., Li S., Liu L., Wang G., Mao A., Ren S., Guo Y.D (2018), “CsATAF1 positively regulates drought stress tolerance by ABA-dependent pathway and promoting ROS scavenging in cucumber” Plant and Cell Physiology 59, pp 930-945 125 Wang H., Wang H., Shao H., Tang X (2016a), “Recent advances in utilizing transcription factors to improve plant abiotic stress tolerance by transgenic technology”, Frontiers in plant science 7, pp 67 126 Wang W., Wang C., Pan D., Zhang Y., Luo B., Ji J (2018), “Effects of drought stress on photosynthesis and chlorophyll fluorescence images of soybean (Glycine max L.) seedlings”, Int J Agric Biol Eng 11, pp 196–201 127 Wu H., Fu B., Sun P., Xiao C., Liu J.H (2016), “A NAC transcription factor represses putrescine biosynthesis and affects drought tolerance”, Plant physiology 172, pp 1532-1547 128 Xing Y., Jia W., Zhang J (2007), “AtMEK1 mediates stress-induced gene expression of CAT1 catalase by triggering H2O2 production in Arabidopsis”, Journal of experimental botany 58, pp 2969-2981 129 Xue G.P., Way H.M., Richardson T., Drenth J., Joyce P.A., McIntyre C.L (2011), “Overexpression of TaNAC69 leads to enhanced transcript levels of stress up-regulated genes and dehydration tolerance in bread wheat”, Molecular plant 4, pp 697-712 130 Yang M., Zhu L., Pan C., Xu L., Liu Y., Ke W., Yang P (2015a), “Transcriptomic analysis of the regulation of rhizome formation in temperate and tropical lotus (Nelumbo nucifera)”, Scientific reports 5, pp 13059 131 Yang X., Wang X., Ji L., Yi Z., Fu C., Ran J., Hu R., Zhou G (2015b), “Overexpression of a Miscanthus lutarioriparius NAC gene MlNAC5 confers enhanced drought and cold tolerance in Arabidopsis”, Plant cell reports 34, pp 943-958 131 132 Yang X., Kim M.Y., Ha J., Lee S.H (2019), “Overexpression of the Soybean NAC Gene GmNAC109 Increases Lateral Root Formation and Abiotic Stress Tolerance in Transgenic Arabidopsis Plants”, Frontiers in Plant Science 10, pp 1036 133 Yu X., Peng H., Liu Y., Zhang Y., Shu Y., Chen Q., Shi S., Ma L., Ma H., Zhang H (2014), “CarNAC2, a novel NAC transcription factor in chickpea (Cicer arietinum L.), is associated with drought-response and various developmental processes in transgenic Arabidopsis”, Journal of Plant Biology 57, pp 55-66 134 Yu X., Liu Y., Wang S., Tao Y., Wang Z., Shu Y., Peng H., Mijiti A., Wang Z., Zhang H., Ma H (2016a), “CarNAC4, a NAC-type chickpea transcription factor conferring enhanced drought and salt stress tolerances in Arabidopsis”, Plant cell reports 35, pp 613-627 135 Yu X., Liu Y., Wang S., Tao Y., Wang Z., Mijiti A., Wang Z., Zhang H., Ma H (2016b), “A chickpea stress-responsive NAC transcription factor, CarNAC5, confers enhanced tolerance to drought stress in transgenic Arabidopsis”, Plant Growth Regulation 79, pp 187-197 136 Zare M., Azizi M.H., Bazrafshan F (2011), “Effect of drought stress on some agronomic traits in ten barley ( Hordeum vulgare ) cultivars”, Tech J Eng Appl Sci 1, pp 57–62 137 Zhang L., Zhang L., Xia C., Zhao G., Jia J., Kong X (2015), “The novel wheat transcription factor TaNAC47 enhances multiple abiotic stress tolerances in transgenic plants’’, Frontiers in plant science 6, pp 1174 138 Zhao X., Yang X., Pei S., He G., Wang X., Tang Q., Jia C., Lu Y., Hu R., Zhou G (2016), “The Miscanthus NAC transcription factor MlNAC9 enhances abiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis”, Gene 586, pp 158-169 139 Zhu M., Chen G., Zhang J., Zhang Y., Xie Q., Zhao Z., Pan Y., Hu Z (2014), “The abiotic stress-responsive NAC-type transcription factor 132 SlNAC4 regulates salt and drought tolerance and stress-related genes in tomato (Solanum lycopersicum)”, Plant Cell Reports 33, pp 1851-1863 133 PHỤ LỤC Phụ lục bảng Các cặp mồi sử dụng cho PCR qRT-PCR liên quan tới nội dung nghiên cứu chức gen GmNAC085 Mục đích Trình tự (5’ – 3’) Kích thước (bp) GATCATATGAACTCAAGTGCGCAAAAGGTTGA 549 Tên mồi Phân tích phiên GmNAC085F-NdeI mã nấm men GmNAC085R-PstI Cặp mồi sử dụng T3 primer giải trình tự vector tách T7 primer dòng pKS GmNAC085F-NotI Tách dòng gen GmNAC085R-XhoI GmNAC085 35Spro-F ATACTGCAGTCAGTCCCTAAACCCGAACT TTAATTGGGAGTGATTTCCC GTAATACGACTCACTATAGGGCG GTCGACATGGGAGTTCCAGAGAGAGAC 1035 CCCGGGTCAGTCCCTAAACCCGAACTC CCCACTATCCTTCGCAA qRT-PCR Gen tham chiếu ACT2-F2 Arabidopsis ACT2-R2 Các gen đích GATCTCCAAGGCCGAGTATGAT 106 CCCATTCATAAAACCCCAGC GmNAC085-F GCAATGGGTCATCACCTTCT GmNAC085-R GACCCAAATTCGGAAACTGA sAPX-F CCTCCGGAGGGTATCGTTATCTA sAPX-R ACAGCCAGAAACATTGTCCAAAAGG CAT1-F TGGGATTCAGACAGGCAAGAACG CAT1-R GTTTGGCCTCACGTTAAGACGAGT CSD1-F TGAACTCAGCCTGGCTACTGG CSD1-R AGCCACACACCAGAAGATACACAC NCED3-F CGGTGGTTTACGACAAGAACAA NCED3-R CAGAAGCAATCTGGAGCATCAA LEA14-F GATTTCTTCTGATCGACAAAACCTA LEA14-R AGCAAACCCAACTTATTACATTACG RD20-F TTAGCTCCGGTCACCAGTCA RD20-R CATGTATGGTTTTGGTAATGTTTCC RD29B-F GCAAGCAGAAGAACCAATCA RD29B-R CTTTGGATGCTCCCTTCTCA AtNAC019-F CGCTAACTGCGGTGACTCTA AtNAC019-R CAATCCTCGCAGCTTCATCT 214 162 162 164 103 92 69 71 250 Các cặp mồi sử dụng cho PCR qRT-PCR thiết kế dựa phần mềm Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) 134 Phụ lục bảng Các cặp mồi gen CaNAC sử dụng cho qRT-PCR đậu gà Kích STT Gen Mồi xi (5’ – 3’) Mồi ngược (5’ – 3’) thước (bp) CaNAC02 CCATGGGAGCTACCAAAGAA TTTCGATCTCTCGGGCTAAA 71 CaNAC04 AACAAGACCACCTGACCCTG AATGCGTCGATTTCTCAACC 89 CaNAC05 CTAAGGCAACGTTCGGAGAG TTTGGCCTAGCACCATTAGG 79 CaNAC06 GTCCCTTCTGTGTCCACGAT GCTCCACCACTCTGAACCTC 86 CaNAC16 CACCAAAGGGCCTCAAGACAG GCCTCATGGATCCAATTTGCCTAT 93 CaNAC19 AGAGGTTTGGTTTGTTGGTG CCAAACACATGGTGAGGAAA 86 CaNAC21 CTTACCCTTTACCCGCTTCC TCTTCTCCCAAATCACCTGG 88 CaNAC24 TGCCACCAGGTTTTAGGTTC AATGATGGAAACAGGCAAGG 98 CaNAC27 GCTTTGTTTGGGGATGAAGA ACCTGCACCAGCTGCTCTAT 93 10 CaNAC40 ACGATCCTTGGGATCTTCCT ATATTTCCTGTCTCGTGGCG 80 11 CaNAC41 CCTGAAGAGGCAATTGACAGA TCACCACTGCAGTCAAAGGT 77 12 CaNAC43 CACTGGTGTTCTACGCTGGA GCCGGCTGATCTATCAACAT 95 13 CaNAC44 CCCACATGGTACTCGTACTGG TTGCAAGCCAGAAGAAGGAT 85 14 CaNAC46 TATTGGAAGGCAACAGGGTC TTTCTTAGGCCAACAATGCC 71 15 CaNAC47 TTTCACACGGATTCAAGCTG ACAAATTCGTTCCACTTGGG 95 16 CaNAC50 CCCACCGATGAAGAACTTGT TACTGGAAGGGGTGCAGAAG 66 17 CaNAC52 GCTACATCAAAGCCATGCCC GGCCTCACTCCATTTGGGTA 143 18 CaNAC57 GTGGTATGCAGGACCAAGCA GGTGGTGGACGATGGTGATT 193 19 CaNAC67 ACAGGAGGAGAAGCTCGGAT TCCTCATCCCGCTTTGAACC 233 20 IF4a TGGACCAGAACACTAGGGACATT AAACACGGGAAGACCCAGAA 60 Các cặp mồi sử dụng cho qRT-PCR lấy từ cơng trình nghiên cứu trước [43] 135 Phụ lục bảng Giá trị Ct gen quản gia ACT2 phân tích mức độ biểu gen thị đáp ứng với hạn Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 Xử lý WT-tưới nước đầy đủ OE1-tưới nước đầy đủ OE2-tưới nước đầy đủ WT-xử lý hạn OE1-xử lý hạn OE2-xử lý hạn STT mẫu Giá trị Ct gen quản gia ACT2 qua lần lặp lại Lần Lần Lần 18.17 19.63 18.73 17.71 19.33 18.86 17.98 19.52 18.68 17.55 19.72 18.54 17.9 19.75 18.83 18.14 19.72 18.93 18.42 19.46 19.16 18.24 19.46 19.37 18.68 19.85 18.72 10 18.89 20.19 19.94 11 18.65 20.25 19.91 12 18.93 20.62 19.9 13 18.72 20.3 20.3 14 18.86 20.37 20.75 15 18.85 20.3 20.61 16 19.59 20.59 20.38 17 19.43 20.45 20.54 18 19.64 20.42 20.52 136 Phụ lục bảng Giá trị Ct gen quản gia IF4a phân tích mức độ biểu gen CaNAC đậu gà Giống đậu gà Điều kiện xử lý Đối chứng ngâm nước (2 giờ) Loại mẫu STT Lá 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Rễ Lá Xử lý ABA (2 giờ) Rễ Lá Xử lý nước (2 giờ) Rễ Hashem Lá Đối chứng ngâm nước (5 giờ) Rễ Lá Xử lý ABA (5 giờ) Rễ Lá Xử lý nước (5 giờ) Rễ 137 Giá trị Ct gen quản gia IF4a Lần Lần Lần 21.62 21.66 21.71 21.19 21.24 21.29 22.27 22.05 22.48 21.05 21.06 21.13 21.85 21.68 21.57 21.65 21.22 20.95 21.64 21.78 21.75 20.87 20.82 20.82 22.22 22.08 22.09 21.46 21.28 21.23 21.69 21.73 21.89 21.53 21.16 21.62 21.56 21.09 21.29 21.36 21.92 21.48 22.17 21.08 21.14 21.26 21.97 21.82 21.8 21.56 21.72 21.11 21.7 21.88 21.62 21.25 21.21 21.29 22.38 22.31 22.35 21.95 22.07 21.78 22.69 22.17 22.49 21.64 20.26 20.72 20.66 20.2 20.39 20.48 21 20.59 21.27 20.16 20.22 20.31 21.1 20.94 20.9 20.65 20.85 20.22 20.82 20.98 20.7 20.34 20.31 20.39 21.5 21.42 21.45 21.06 21.16 20.85 21.82 21.28 21.55 20.74 Lá Đối chứng ngâm nước (2 giờ) Rễ Lá Xử lý ABA (2 giờ) Rễ Lá Xử lý nước (2 giờ) ILC482 Rễ Lá Đối chứng ngâm nước (5 giờ) Rễ Lá Xử lý ABA (5 giờ) Rễ Lá Xử lý nước (5 giờ) Rễ 138 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 21.56 21.45 21.97 21.8 21.93 20.97 21.46 21.09 22.16 22.15 22.31 21.36 20.93 21.28 21.7 21.92 22.05 21.59 21.36 21.33 21.7 21.7 21.79 21.69 21.34 21.46 22.3 22.04 22.33 22.55 22.2 22.02 21.5 21.89 22.12 21.72 21.36 21.35 22.51 21.84 20.12 20.28 20.07 19.74 20.29 19.9 21.26 21.19 31.69 28.03 19.94 21.88 30.55 20.78 27.57 20.32 26.29 26.79 20.32 26.74 20.8 20.89 21.2 21.45 21.75 22.76 22.71 22.87 23.21 23.03 22.25 21.79 22.13 21.85 21.59 21.28 21.59 20.9 21.51 21.3 21.47 20.46 20.95 20.6 21.68 21.63 21.81 20.87 20.44 20.8 21.22 21.43 21.58 21.09 20.86 20.82 21.2 21.22 21.32 21.19 20.82 20.92 21.8 21.56 21.85 22.04 21.68 21.55 20.99 21.43 21.59 21.2 20.84 20.82 Phụ lục bảng Trình tự DNA amino axit mã hóa cho GmNAC085 Vùng Trình tự DNA (5’ – 3’) Trình tự amino axit Vùng trình tự mã hóa đầy đủ gen GmNAC085 ATGGGAGTTCCAGAGAGAGACCCTCTTGCACAATTGAGC TTGCCTCCTGGATTTAGATTTTATCCCACTGATGAGGAGC TTTTGGTTCAGTACCTTTGCCGCAAGGTTGCTGGCCATC ATTTCTCTCTTCCAATCATTGCTGAAGTTGATTTGTACAA GTTTGATCCATGGGTTCTTCCAGGTAAGGCAGCGTTTGG AGAGAAGGAGTGGTACTTCTTCAGTCCAAGAGACAGGA AGTACCCGAATGGTTCACGACCAAACAGAGTTGCGGGT TCTGGGTATTGGAAAGCCACTGGAACTGACAAAATCATC ACCACTGAAGGTAGAAAAGTTGGCATAAAAAAAGCACT TGTTTTCTACGTTGGCAAAGCACCCAAAGGCTCCAAAAC CAATTGGATCATGCACGAGTATCGCCTTCTCGACTCTTCC CGCAAACACAACCTCGGAACCGCAAAGCTTGATGATTG GGTTCTGTGTCGTATCTATAAGAAGAACTCAAGTGCGCA AAAGGTTGAGGCAAATCTTTTGGCTATGGAATGTAGCAA TGGGTCATCACCTTCTTCATCGTCCCACGTGGACGACAT GCTGGAATCGTTGCCGGAGATCGATGATCGGTGCTTCAC CCTGCCGCGAGTGAACTCAGTCAGAACAATGCAGCAGC AGGACGAGAAATTCGGATTTCAGAACATGGGATCCGGGT TTTTCACCGATTGGGTCAACCCGACGGATCTTGATTCAGT TTCCGAATTTGGGTCGGGTTGCCAAACCCAAGGGATGGT GAATTATGATTGTAATGACTTATTTGTCCCTTCTGTGCCGC CCTTCGGCCACAGCCATGTAAACTACATGGTGGGGGCAC CACCGTCCGAGGAGGAGGTTCAAAGCGGTGTGAGGACT CAACAGGCCGATGGGGCCGCATGTTTTCAGCAGAACCC AAATGCCCGATTGTTACCGGGCTCGGGCGACCCATTTGG GTTTGGGTTCATCATGGGTCAGCAAGTTGAGTTCGGGTT TAGGGACTGA AACTCAAGTGCGCAAAAGGTTGAGGCAAATCTTTTGGCT ATGGAATGTAGCAATGGGTCATCACCTTCTTCATCGTCCC ACGTGGACGACATGCTGGAATCGTTGCCGGAGATCGATG ATCGGTGCTTCACCCTGCCGCGAGTGAACTCAGTCAGAA CAATGCAGCAGCAGGACGAGAAATTCGGATTTCAGAAC ATGGGATCCGGGTTTTTCACCGATTGGGTCAACCCGACG GATCTTGATTCAGTTTCCGAATTTGGGTCGGGTTGCCAA ACCCAAGGGATGGTGAATTATGATTGTAATGACTTATTTG TCCCTTCTGTGCCGCCCTTCGGCCACAGCCATGTAAACT ACATGGTGGGGGCACCACCGTCCGAGGAGGAGGTTCAA AGCGGTGTGAGGACTCAACAGGCCGATGGGGCCGCATG TTTTCAGCAGAACCCAAATGCCCGATTGTTACCGGGCTC GGGCGACCCATTTGGGTTTGGGTTCATCATGGGTCAGCA AGTTGAGTTCGGGTTTAGGGACTGA MGVPERDPLAQLS LPPGFRFYPTDEEL LVQYLCRKVAGHH FSLPIIAEVDLYKF DPWVLPGKAAFG EKEWYFFSPRDRK YPNGSRPNRVAGS GYWKATGTDKIIT TEGRKVGIKKALV FYVGKAPKGSKTN WIMHEYRLLDSSR KHNLGTAKLDDW VLCRIYKKNSSAQ KVEANLLAMECS NGSSPSSSSHVDD MLESLPEIDDRCFT LPRVNSVRTMQQQ DEKFGFQNMGSGF FTDWVNPTDLDSV SEFGSGCQTQGMV NYDCNDLFVPSVP PFGHSHVNYMVG APPSEEEVQSGVR TQQADGAACFQQ NPNARLLPGSGDP FGFGFIMGQQVEF GFRD* NSSAQKVEANLLA MECSNGSSPSSSSH VDDMLESLPEIDD RCFTLPRVNSVRT MQQQDEKFGFQN MGSGFFTDWVNP TDLDSVSEFGSGC QTQGMVNYDCND LFVPSVPPFGHSHV NYMVGAPPSEEEV QSGVRTQQADGA ACFQQNPNARLLP GSGDPFGFGFIMG QQVEFGFRD* Vùng TRR đầu C- GmNAC085 139 Phụ lục hình Cấu trúc vector tách dịng pKS 140 Phụ lục hình Cấu trúc vector pGBKT7 sử dụng cho phân tích khả hoạt động phiên mã GmNAC085 nấm men 141 Phụ lục hình Cấu trúc vector biểu pGKX xây dựng dựa vector pGreenII 142 Phụ lục hình Kết PCR kiểm tra sản phẩm gắn đoạn gen GmNAC085 vào vector biểu pGKX Chú thích: M, thang chuẩn kb ladder; 1-6, khuẩn lạc; (-), đối chứng âm 143 ... KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN HỮU KIÊN NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA CÁC YẾU TỐ PHIÊN MÃ NAC ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN HẠN Ở CÂY HỌ ĐẬU Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN... học với tiêu đề ? ?Nghiên cứu vai trò yếu tố phiên mã NAC đáp ứng với điều kiện hạn họ đậu? ?? Trong đó, nghiên cứu tập trung làm rõ chức gen GmNAC085 trình đáp ứng với hạn hán đối tượng mơ hình Arabidopsis... Ảnh hưởng hạn tới phân tử 23 1.2 Sự đáp ứng trồng với hạn 24 1.3 Vai trò yếu tố phiên mã NAC trình đáp ứng với stress hạn trồng 27 1.3.1 Tổng quan yếu tố phiên mã NAC