Nghiên cứu tạo bộ sinh phẩm nhận biết sự phân mảnh ADN tinh trùng người

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI *** NGUYỄN THỊ THỨC NGHIÊN CỨU TẠO BỘ SINH PHẨM NHẬN BIẾT SỰ PHÂN MẢNH ADN TINH TRÙNG NGƯỜI LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI, 2-2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI *** NGUYỄN THỊ THỨC NGHIÊN CỨU TẠO BỘ SINH PHẨM NHẬN BIẾT SỰ PHÂN MẢNH ADN TINH TRÙNG NGƯỜI Chuyên ngành: Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TRƯƠNG QUỐC PHONG HÀ NỘI, 2-2018 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Trương Quốc Phong ln tận tình hướng dẫn, đồng hành em suốt q trình học tập nghiên cứu để hồn thành luận văn Em luôn ghi nhớ biết ơn thầy, cô giáo viện công nghệ sinh học thực phẩm ln tận tình giảng dạy cho em suốt trình em học cao học Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo sau đại học, phòng ban chức trường Đại học Bách Khoa Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em q trình học tập nghiên cứu Tơi xin gửi tới lãnh đạo toàn thể đồng nghiệp khoa Hỗ trợ sinh sản, bệnh viện phụ sản Hà Nội lời cảm ơn chân thành ln tạo điều kiện tốt mặt, cho lời khun bổ ích học tập cơng việc Đặc biệt cảm ơn bạn đồng nghiệp phòng xét nghiệm lọc rửa tinh chất động viên chia sẻ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Con xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới cha mẹ ln bên giúp đỡ, động viên lúc khó khăn nhất, định hướng cho bước sống nghiệp Cuối cùng, tất tình yêu thương xin dành cho gia đình bé nhỏ nguồn sức mạnh vô tận cho vượt qua khó khăn thử thách Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Thức i Luận văn thạc sĩ kỹ thuật LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu luận văn Các kết nghiên cứu luận văn hồn tồn trung thực, số liệu, tính tốn hồn tồn xác chưa cơng bố tạp chí khoa học chuyên ngành Mọi liệu, hình ảnh trích dẫn tham khảo luận văn thu thập sử dụng nguồn liệu mở trích dẫn rõ nguồn gốc Tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với cam đoan Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Thức ii Luận văn thạc sĩ kỹ thuật DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN: Axit Deoxyribonucleic ARN: Axit ribonucleic COMET: Comet assays DFI: Chỉ số index, hiển thị số phân mảnh ADN DTT: Dithiothreitol EDTA: Ethylene diaminetetraacetic acid IVF: In-vitro fertilization ICSI: Intracytoplamic sperm injection IUI: Intra ulterin insermination LS: Lysis ME: Mercaptoethanol NST: Nhiễm sắc thể OR: Oocyte trieval PBS: Phosphate-buffered saline SCD: Sperm Chromatin Dispersion SDF: Sperm ADN fragmentation SDS: Sodium dodecyl sulfate SCSA: Sperm Chromatin structure Tunel: Mediated dUDP nick end labelling TT: Tinh trùng TTON: Thụ tinh ống nghiệm iii Luận văn thạc sĩ kỹ thuật MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU CHƢƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm tinh trùng ngƣời 1.1.1 Sự hình thành tinh trùng người 1.1.2 Hình thái cấu trúc .5 1.2 Tổn thƣơng ADN tinh trùng ảnh hƣởng lên khả sinh sản 1.3 Nguyên nhân phân mảnh ADN tinh trùng ngƣời 1.4 Các phƣơng pháp xét nghiệm phân mảnh ADN tinh trùng 1.4.1 Phương pháp COMET (Comet assays): 1.4.2 Phương pháp SCSA (Sperm Chromatin structure): 1.4.3 Phương pháp TUNEL (Mediated dUDP nick end labelling): 1.4.4 Phương pháp SCD (Sperm Chromatin Dispersion): 1.5 Ứng dụng xét nghiệm phân mảnh ADN tinh trùng lâm sàng 10 1.6 Kỹ thuật SCD (Sperm Chromatin Dispersion) .10 1.7 Các kít thƣơng mại .11 1.7.1 Kít SpermFunc DNAf Trung Quốc 12 1.7.2 Kít Halosperm Tây Ban Nha 15 CHƢƠNG II : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18 2.1 Vật liệu 18 2.1.1 Hóa chất, mẫu bệnh phẩm 18 2.1.2 Các vật liệu chế tạo kít .18 2.1.3 Thiết bị 18 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .18 2.2.1 Xác định điều kiện cố định tinh trùng .19 iv Luận văn thạc sĩ kỹ thuật 2.2.2: Xác định điều kiện biến tính ADN tinh trùng 19 2.2.3 Xác định điều kiện ly giải nhân tinh trùng 20 2.2.4: Xác định điều kiện nhuộm ADN tinh trùng .21 2.2.5: Phương pháp xử lý số liệu 22 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Thiết lập điều kiện ban đầu xác định cấu trúc ADN tinh trùng ngƣời .23 3.2 Nghiên cứu điều kiện thích hợp để phân tích phân mảnh ADN tinh trùng 24 3.2.1 Nghiên cứu điều kiện cố định trinh trùng .24 3.2.2 Xác định điều kiện biến tính ADN tinh trùng 26 3.2.3 Xác định điều kiện ly giải nhân tinh trùng 28 3.2.4 Xác định điều kiện nhuộm ADN tinh trùng .32 3.3 Thiết lập sinh phẩm quy trình phân tích phân mảnh ADN tinh trùng 34 3.3.1 Thành phần kít 34 3.3.2 Quy trình xét nghiệm .34 3.4 Đánh giá sinh phẩm BK-HaloSperm 36 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 v Luận văn thạc sĩ kỹ thuật DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Các loại thuốc nhuộm ADN tinh trùng khác bao gồm xanh methylene, Hematoxylin, Giemsa Wright 33 Bảng 3.2 So sánh kết phân tích phân mảnh ADN tinh trùng sinh phẩm BK-HaloSperm sinh phẩm Halosperm Tây Ban Nha sử dụng 10 mẫu tinh dịch .36 Bảng 3.3 So sánh kết phân tích phân mảnh ADN tinh trùng sinh phẩm BK-HaloSperm SpermFunc DNAf Trung Quốc sử dụng 20 mẫu tinh dịch .38 vi Luận văn thạc sĩ kỹ thuật DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ giai đoạn q trình sinh tinh ( Huecrei.com.vn) Hình 1.2.Sự biến đổi tinh tử thành tinh trùng (ykhoathinhan.com.vn) .4 Hình 1.3.Hình thái cấu trúc tinh trùng (vi.wikipedia.org) .5 Hình 1.4 Hình ảnh tinh trùng sau nhuộm SCD (ivfmd.net) .11 Hình 1.5 Hình ảnh kít SpermFunc DNAf Trung Quốc .12 Hình 1.6 Nhận định kết kít SpermFunc DNAf Trung Quốc .14 Hình 1.7: Hình ảnh kít Halosperm Tây Ban Nha 15 Hình 1.8 Nhận định kết kit Halosperm Tây Ban Nha .17 Hình 3.1: Hình ảnh ADN tinh trùng phân tích SCD với điều kiện thiết lập ban đầu sử dụng kit Halosperm Tây Ban Nha 24 Hình 3.2: Tinh trùng cố định lam nồng độ agarose khác 1% (A), 2% (B), 3% (C) 4% (C) 25 Hình 3.3: Biến tính ADN tinh trùng nồng độ axit HCl khác (0,01N(A); 0,05N(B); 0,08N(C); 0,1N(D); 0,15N(E) 27 Hình 3.4: Ly giải nhân tinh trùng hệ đệm khác LB1 (A), LB2 (B) LB3 (C) .29 Hình 3.5: Thay đổi nồng độ DTT đệm ly giải nhân tinh trùng 100 mM (A), 50 mM (B) 10 mM (C) 30 Hình 3.6: Thời gian ly giải khác 25 phút (A), 30 phút (B), 45 phút (C) 60 phút (D) với nồng độ DTT 10 mM 32 Hình 3.7 Hình ảnh tiêu đặc trưng nhuộm ADN tinh trùng sử dụng kít BKHaloSperm .35 vii Luận văn thạc sĩ kỹ thuật MỞ ĐẦU Ngày nay, giới Việt Nam việc khám bệnh, chẩn đoán cho nguyên nhân tiến hành điều trị vô sinh cho cặp vợ chồng ngày quan tâm nhiều không quan điểm nhân văn, nhân đạo y học y tế nói riêng mà cịn quan tâm xã hội nhân loại.Vô sinh nói chung vơ sinh nam nói riêng, vấn đề sức khỏe sinh sản gây ảnh hưởng lớn tới chất lượng sống nhiều cặp vợ chồng tồn giới Tỉ lệ vơ sinh muộn ngày gia tăng Việt Nam giới Tại Việt Nam: Theo nghiên cứu Bệnh viện Phụ sản Trung ương đại học Y Hà Nội tiến hành 14.300 cặp vợ chồng độ tuổi sinh đẻ (15-49) tỉnh đại diện cho vùng sinh thái nước ta xác định tỉ lệ vô sinh cặp vợ chồng độ tuổi sinh đẻ 7,7%, nghĩa có từ 700.000 đến triệu cặp vợ chồng vô sinh Đáng báo động có khoảng 50% cặp vợ chồng vơ sinh có độ tuổi 30 tuổi Theo Tổ chức Y tế Thế giới, tỉ lệ vô sinh giới trung bình 6%12% Vấn đề vơ sinh thách thức với dân số Việt Nam, ghánh nặng cho ngành y tế, tiêu tốn nhiều tiền bạc, suy sụp mặt tinh thần, chí gây tan vỡ hạnh phúc gia đình Vơ sinh yếu tố nam liên quan tới 40% trường hợp đến điều trị hỗ trợ sinh sản Xét nghiệm tinh dịch đồ xét nghiệm quan trọng để xác định tình trạng vô sinh nam Tuy nhiên, số tinh dịch đồ khơng cho biết tính tồn vẹn vật liệu di truyền tinh trùng mang nặng tính chủ quan Các xét nghiệm phân mảnh ADN tinh trùng (SDF) điều trị vô sinh nam cấp độ phân tử phát triển ứng dụng thực hành lâm sàng, giúp dự đoán xác mức độ thành cơng phương pháp điều trị muộn, đặc biệt ICSI (Intracytoplamic sperm injection) – kỹ thuật tiêm tinh trùng vào màng bào tương trứng, để thay tỉ lệ hình dạng bình thường tinh trùng khảo sát tinh dịch Những nghiên cứu gần cho thấy phân mảnh ADN tinh trùng chiếm khoảng 20% trường hợp vô sinh nam Bất thường gây ảnh hưởng đến sức khỏe hệ sau Bên cạnh tồn vẹn nhiễm sắc chất (Chromatin) tinh trùng ảnh hưởng trực tiếp đến kết kỹ thuật hỗ trợ sinh sản ảnh Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Kết cho thấy thuốc nhuộm Giemsa cho phép quan sát rõ nét cấu trúc nhân, quầng halo, đuôi tinh trùng Giemsa sử dụng để nhuộm ADN tinh trùng quy trình phân tích phân mảnh ADN tinh trùng 3.3 Thiết lập sinh phẩm quy trình phân tích phân mảnh ADN tinh trùng Dựa vào kết đạt nghiên cứu này, thiết lập sinh phẩm BK-HaloSperm quy trình phân tích phân mảnh ADN tinh trùng sau: 3.3.1 Thành phần kít - Lam kính, lamen - Gel agarose - Dung dịch axit HCl - Dung dịch ly giải (LB) - Dung dịch cồn 70%, 90% 100% - Thuốc nhuộm Giemsa 3.3.2 Quy trình xét nghiệm 3.3.2.1 Chuẩn bị - Mẫu tinh dịch để tan hoàn toàn tủ ấm - Pha lỗng tinh dịch với PBS để có nồng độ tinh trùng đạt khoảng 5-10 x 106/ml - Hóa lỏng thạch - Pha axit 0,08N - Pha nồng độ cồn: 70%, 90% 3.3.2.2 Quy trình phân tích - Hút 30 µl mẫu tinh dịch pha loãng cho vào ống eppendorf + 70 µl thạch agarose hóa lỏng trộn - Hút 25 µl hỗn hợp nhỏ lên lam kính nhẹ nhàng đậy lamen phủ kín 34 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật - Để lam kính tủ lạnh 40C 10 phút - Nhẹ nhàng tháo lamen ngâm lam hỗn hợp axit 0,08N phút - Nhỏ hỗn hợp LB phủ kín vùng cố định tinh trùng ủ 25 phút - Ngâm lam nước cất phút - Nhúng lam qua nồng độ cồn 70, 90, 100% - Để khô lam nhuộm nhiệt độ phòng - Nhuộm lam thuốc nhuộm Giemsa 15 phút - Rửa lam vòi nước chảy - Để khô lam tự nhiên nhiệt độ phịng - Quan sát kết kính hiển vi quang học với độ phóng đại 40X 3.3.2.3 Đọc kết Hình ảnh đặc trưng tiêu nhuộm ADN tinh trùng sử dụng sinh phẩm BK-HaloSperm sau: Hình 3.7 Hình ảnh tiêu đặc trưng nhuộm ADN tinh trùng sử dụng kít BKHaloSperm 35 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Ghi chú: - (1): Tinh trùng có quầng sáng halo rộng - (2): Tinh trùng có quầng sáng halo trung bình - (3): Tinh trùng có quầng sáng halo nhỏ - (4): Tinh trùng khơng có quầng sáng halo - (5): Tinh trùng thối hóa nhân Đánh giá mức độ phân mảnh ADN - (1) (2) : Tinh trùng không bị phân mảnh DNA - (3) (4) (5): Tinh trùng bị phân mảnh ADN - % tinh trùng bị phân mảnh ADN = Số tinh trùng bị phân mảnh ADN/Tổng số tinh trùng quan sát X 100% 3.4 Đánh giá sinh phẩm BK-HaloSperm Để đánh giá sinh phẩm xác định mức độ phân mảnh ADN tinh trùng BKHaloSperm tạo nghiên cứu này, tiến hành thử nghiệm sinh phẩm BK-HaloSperm với 30 mẫu tinh trùng so sánh với kết phân tích hai sinh phẩm thương mại Kết thể bảng 3.2 3.3 Bảng 3.2 So sánh kết phân tích phân mảnh ADN tinh trùng sinh phẩm BK-HaloSperm sinh phẩm Halosperm Tây Ban Nha sử dụng 10 mẫu tinh dịch Mẫu tinh Kít BK-HaloSperm Kết Kít Halosperm Tây Ban Nha Hình ảnh Kết chất Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=17% ADN=22% 36 Hình ảnh Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Tỉ lệ Tỉ lệ Phân mảnh phân mảnh ADN=18% ADN=23% Tỉ lệ Tỉ lệ Phân mảnh phân mảnh ADN=40% ADN=42% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=17% ADN=21% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=30% ADN=29% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=21% ADN=22% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=59% ADN=57% 37 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật 10 Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN =9% ADN=13% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=12% ADN=13% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=19% ADN=16% Trung Tỉ lệ phân mảnh ADN =24,1%a Tỉ lệ phân mảnh ADN =25,8%a bình a t t nc n t h n th h n s kh c nh u c n hĩ th n k Vậy kết phân mảnh kít BK-Halosperm kít Halosperm Tây Ban Nha khác khơng có ý nghĩa thống kê Bảng 3.3 So sánh kết phân tích phân mảnh ADN tinh trùng sinh phẩm BK-HaloSperm sử dụng 20 mẫu tinh dịch Mẫu tinh Kít BK-HaloSperm Kết chất Kít SpermFunc DNAf Trung Quốc Kết Hình ảnh Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=15% ADN =13,4% 38 Hình ảnh Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Tỉ lệ Tỉ lệ Phân mảnh phân mảnh ADN=12% ADN =12,2% Tỉ lệ Tỉ lệ Phân mảnh phân mảnh ADN=29% ADN =28,6% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=14% ADN =18,1% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=11% ADN =10,5% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=13% ADN =11,4% 39 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=18% ADN =16% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=15% ADN =13,5% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=42% ADN =38,2% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=24% ADN =21,8% 10 40 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=20% ADN =24,2% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=14% ADN =17,8% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=16% ADN =17,3% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=29% ADN =27,3% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=22% ADN =19,4% 11 12 13 14 15 41 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=30% ADN =28,2% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=50% ADN =46,7% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=19% ADN =18,1% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=41% ADN =43,1% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN=14% ADN =16,3% Tỉ lệ phân mảnh ADN =22,4%b Tỉ lệ phân mảnh ADN =22,1%b 16 17 18 19 20 Trung bình b t t nc n t h n th h n s kh c nh u c n hĩ th n k Vậy kết phân mảnh kít BK-Halosperm kít SpermFunc DNAf Trung Quốc khác khơng có ý nghĩa thống kê 42 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Từ kết thu được, đưa số kết luận kiến nghị sau: Kết luận - Đã xác định thành phần điều kiện thích hợp để phân tích mức độ phân mảnh ADN tinh trùng: cố định tinh trùng agarose 1%, biến tính ADN HCl 0,08N, ly giải nhân tinh trùng đệm chứa 10 mM DTT thời gian 25 phút nhuộm ADN tinh trùng thuốc nhuộm Giemsa - Đã tạo sinh phẩm BK-HaloSperm xây dựng quy trình phân tích phân mảnh ADN tinh trùng - Bộ sinh phẩm BK-HaloSperm đánh giá thử nghiệm với 30 mẫu tinh trùng kết thu tương đương với hai sinh phẩm thương mại Halosperm Tây Ban Nha SpermFunc DNAf Trung Quốc Kiến nghị - Hoàn thiện sinh phẩm BK-HaloSperm: Điều kiện bảo quản - Tiếp tục đánh giá thử nghiệm sinh phẩm BK-HaloSperm với cỡ mẫu lớn 43 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đặng Quang Vinh Sự phân mảnh ADN tinh trùng kết điều trị vơ sinh Tạp chí phụ sản, tháng 3-2012 Hồ Mạnh Tường Định hướng ROS tinh dịch phân mảnh ADN tinh trùng chẩn đoán điều trị muộn nam Hội nghị sản phụ khoa Việt Pháp lần Lê Đăng Khoa Ứng dụng lâm sàng xét nghiệm phân mảnh ADN tinh trùng điều trị vô sinh nam Hội nghị vô sinh kỹ thuật Hỗ Trợ Sinh Sản lần V Mã Phạm Quế Mai, Nguyễn Trương Thái Hà, Nguyễn Ấn Bình, Dương Nguyễn Duy Tuyền, Hồ Mạnh Tường So sánh ưu điểm, nhược điểm phương pháp đánh giá phân mảnh ADN tinh trùng ý nghĩa chẩn đốn vơ sinh nam Y học sinh sản: Hiện tương lai, tr.78 TÀI LIỆU TIẾNG ANH Anne Sofie Rex, Aagaard Gynaecological Clinic, Jens Fedder DNA fragmentation in spermatozoa: a historical review Andrology July 2017; Vol A N Fatehi, M M Bevers, E Schoevers, B A J Roelen, B Colenbrander, B M Gadella DNA Damage in Bovine Sperm Does Not Block Fertilization and Early Embryonic Development But Induces Apoptosis After the First Cleavages Journal of Andrology 2006; Vol 27 Ashok Agarwal, Ahmad Majzoub, Sandro Esteves, Edmund Ko, Ranjith Ramasamy, and Armand Zini Clinical utility of sperm DNA fragmentation testing: practice recommendations based on clinical scenarios Translational Andrology and Urology Dec 2016; Vol 5(6): 935–95 Ashok Agarwal, Shyam S R Allamaneni Free radicals and male reproduction 2011 Ashok Agarwal and Tamer M Said Oxidative stress, DNA damage and apoptosisn in maleinfertility: a clinical approach 2005 44 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Aspinder Singh and Ashok Agarwal The Role of sperm Chromatin Integrity and DNA Damage Male Infertility 2011 Belloc S, Benkhalifa M, Cohen-Bacrie M, Dalleac A, Chahine H, Amar E, et al Which isolated sperm abnormality is most related to sperm DNA damage in men presenting for infertility evaluation Journal of assisted reproduction and genetics 2014; Vol 31(5): 527-32 Daryl W Fairbairn a, Peggy L olive b, Kim L O’Neill The comet assay: a comprehensive review 1994 De La torre J, López Fernández C, Pita M Simultaneous observation of DNA fragmentation and protein loss in the boar spermatozoon following application of the sperm chromatin dispersion (SCD) test Journal of Andrology 2007; Vol 28: 533-40 10 Denny Sakkas, Ph.D and Juan G Alvarez, M.D., Ph.D Sperm DNA fragmentation: mechanisms of origin, impact on reproductive outcome, and analysis March 2010 11 Donald Evenson & Lorna Jost Sperm chromatin structure assay is useful for fertility assessment, USA 12 Evenson D, Wixon R Meta-analysis of sperm DNA fragmentation using the sperm chromatin structure assay Reproductive Biomedicine Online Apr 2006; Vol 12(4): 466-72 13 Fernández JL, Muriel L, Goyanes V Simple determination of human sperm DNA fragmentation with an improved sperm chromatin dispersion test Fertility and Sterility 2005; Vol 84: 833-42 14 Fredrik Johansson, Anne Lagerqvist, Klaus Erixon, and Dag Jenssen A method to monitor replication fork progression in mammalian cells: nucleotide excision repair enhances and homologous recombination delays elongation along damaged DNA Nucleic Acids Research 2004; Vol 32(20): 157 15 Gayatri Mohanty, Nirlipta Swain, Chandan Goswami, Sujata Kar & Luna Samanta Histone retention, protein carbonylation, and lipid peroxidation in spermatozoa: Possible role in recurrent pregnancy loss System Biology in Reproductive Medicine 2016; Vol 62: 201–212 45 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật 16 Greco E, Iacobelli M, Rienzi L, Ubaldi F, Ferrero S, Tesarik J Reduction of the incidence of sperm DNA fragmentation by oral antioxidant treatment Journal of Andrology 2005; Vol 26(3): 349-53 17 Gunnar Ahnström Techniques to measure ADN strand breaks in cells: a review International Journal of Radiation Biology 1988; Vol 54: 695–707 18 Hassan W.Bakos, Jeremy G.Thompson, Deanne Feil and Michelle Lane Sperm DNA damage is associated with assisted reproductive technology pregnancy 2007 19 Jane Cooke Wright, Stephen Milne, Heather Leeson Sperm DNA damage caused by oxidative stress: modifiable clinical, lifestyle and nutritional factors in male infertility Reproductive Biomedicine Online 2014; Vol 28: 684– 703 20 José Luis Fernández, M.D., Ph.D Lourdes Muriel, Ph.D, Vicente Goyanes, M.D., Ph.D, Enrique Segrelles, M.D, Jaime Gosálvez, Ph.D, María Enciso, Ph.D, Marie LaFromboise, B.S, Christopher De Jonfe, Ph.D Simple analysis of DNA fragmentation in human sperm cells: the sperm chromatin dispersion (SCD) test 2004 21 Lewis SEM The place of sperm ADN fragmentation testing in current day fertility management Middle East Fertility Society Journal 2013; Vol 18(2): 78-82 22 Lewis SEM, Jonh Aitken R, Conner SJ, Iuliis GD, Evenson DP, Henkel R, et al The impact of sperm DNA damage in assisted conception and beyond: recent advances in diagnosis and treatment Reproductive biomedicine online 2003; Vol 27(4): 325-37 23 Lewis Simon, L Liu, K Murphy, S Ge, J Hotaling, K.I Aston, B Emery, and D.T Carrell Comparative analysis of three sperm DNA damage assays and sperm nuclear protein content in couples undergoing assisted reproduction treatment Human Reproduction 2014; Vol 29: 904–917 24 Lim JJ, Lee JI, Kim DH, Song SH, Kim HJ, Lee WS, Lee DR DNA fragmentation of human sperm can be detected by ligation-mediated real-time polymerase chain reaction Fertility and Sterility Dec 2013; Vol 100(6): 1564-71 25 Lynne Robinson Ioannis D Gallos Sarah J Conner Madhurima RajkhowaDavid Miller Sheena Lewis Jackson Kirkman-Brown Arri Coomarasamy The effect of sperm DNA fragmentation on miscarriage rates: a systematic review and metaanalysis Human Reproduction October 2012; Vol 27, 2908–2917 46 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật 26 Michel Roberge and Susan M Gasser DNA loops: structural and functional properties of scaffold-attached regions Molecular Microbiology 1992; Vol 6(4): 419-423 27 Sanchez-Martin Pedro, Sanchez-Martin Fernando, Gonzalez-Martinez M, Gosalvez J Increased pregnancy after reduced male abstinence Systems biology in reproductive medicine 2013; Vol 59(5): 256-60 28 Sandro C Esteves, Sanchez-Martin Fernando, Sanchez-Martin Pedro, Schneider DT, Gosalvez J Comparison of reproductive outcome in oligozoospermic men with high sperm DNA fragmentation undergoing inttracytoplasmic sperm injection with ejaculated and testicular sperm Fertility and Sterility 2015; Vol 104(6): 1398-405 29 Sandro C Esteves, Sharma RK, Gosalvez J, Agarwal A A translational medicine appraisal of specialized andrology testing in unexplained male infertility International Urology and Nephrology 2014; Vol 46(6): 1037-52 30 Salil Tandon Sperm DNA fragmentation testing: where we stand in 2017 Translational Andrology and Urology Sep 2017; Vol 6(4): 697–698 31 Tarlazis BC DNA Goulis DG Sperm DNA fragmentation assessment: is it really helpful? Gynecol Endocrinol 2010; Vol 26(5): 315-316 32 The Clinical utility of Sperm ADN integrity testing: a guideline The practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine American society for reproductive Medicine, Birmingham, Alabama Fertility and Sterility 2013; Vol 99: 673-7 33 Thomas J Matthews, H Eden Cottee-Jones and Robert J Whittaker Habitat fragmentation and the species– area relationship: a focus on total species richness obscures the impact of habitat loss on habitat specialists Diversity and Distributions June 2014; Vol 20: 1136–1146 34 Wang YJ, Zhang RQ, Lin YJ, Zhang RG, Zhang WL Relationship between varicocele and sperm DNA damage and the effect of varicocele repair: a metaanalysis Reproductive Biomedicine Online 2012; Vol 25(3): 307-14 35 Wright, Stephen Milne, Heather Leeson Sperm DNA damage caused by oxidative stress: modifiable clinical, lifestyle and nutritional factors in male infertility Reproductive Biomedicine Online June 2014; Vol 28: 684–703 47 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật CÁC TRANG WEB https://vi.m.wikipedia.org/wiki/Tinhdich http://www.thuvienykhoa.vn 48 ... Vì chúng tơi thực đề tài: "Nghiên cứu tạo sinh phẩm nhận biết phân mảnh ADN tinh trùng người? ?? với mục tiêu tạo sinh phẩm nhận biết phân mảnh ADN tinh trùng quy trình phân tích ổn định với giá... ADN= 18% ADN= 23% Tỉ lệ Tỉ lệ Phân mảnh phân mảnh ADN= 40% ADN= 42% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN= 17% ADN= 21% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN= 30% ADN= 29% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN= 21%... lệ phân mảnh phân mảnh ADN= 19% ADN =18,1% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN= 41% ADN =43,1% Tỉ lệ Tỉ lệ phân mảnh phân mảnh ADN= 14% ADN =16,3% Tỉ lệ phân mảnh ADN =22,4%b Tỉ lệ phân mảnh ADN