Tóm tắt: Để tìm hiểu sâu hơn về đặc điểm hệ gen, mối quan hệ phát sinh loài và các hệ gen so sánh của các chủng A. baumannii trong nghiên cứu, 2 chủng đặc trưng nhất về các gen liên quan đến tính kháng carbapenem được chọn để giải trình tự và phân tích hệ gen (Chủng DMS06669 và DMS06670). Lắp ráp trình tự toàn bộ hệ gen chủng DMS06669 và DMS06670 thu được kích thước bộ gen ước tính lần lượt là 4,2Mb và 3,8Mb. Bằng phương pháp này, việc xác định các gen kháng thuốc tiềm năng được tiến hành và nghiên cứu cho thấy xác suất chủng DMS06669 và DMS06670 là mầm bệnh ở người lần lượt là 85,8% và 85,3%, với tương ứng là 632 và 622 họ protein gây bệnh. Ngoài ra, việc phân tích các nhóm tương đồng (COG) trong chuỗi protein của các chủng A. baumannii DMS06669 và DMS06670 được so sánh với bốn hệ gen khác cho thấy các cụm protein tương đồng chịu trách nhiệm cho nhiều thuốc tồn tại trong các chủng kháng kháng sinh cao. Phân tích cây phát sinh loài cho thấy, dựa trên giá trị nhận dạng nucleotit trung bình, A. baumannii DMS06670 là một nhóm họ hàng với hai chủng A. baumannii LAC4, BJAB0715 trong khi chủng A. baumannii DMS06669 là một nhóm 5 chủng A. baumannii gồm ATCC_17978, D1279779, ZW851, ab031, và SDF. Cuối cùng, phân tích so sánh 23 hệ gen sẵn có của các chủng A. baumannii cho thấy một pangenome gồm 15.883 gen. Tiến hành phân lập invitro 19 gen kháng thuốc bằng phương pháp PCR và xác nhận lại 19 trình tự DNA các gen kháng thuốc bằng phương pháp Sanger cải tiến
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN SĨ TUẤN NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG CARBAPENEM Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ CỦA ACINETOBACTER BAUMANNII GÂY NHIỄM KHUẨN TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA THỐNG NHẤT ĐỒNG NAI Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số chuyên ngành: 60420201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH - NĂM 2019 Cơng trình hoàn thành Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM Người hướng dẫn khoa học 1: PGS TS Nguyễn Thúy Hương Người hướng dẫn khoa học 2: TS BS Phạm Hùng Vân Phản biện độc lập 1: PGS TS Cao Hữu Nghĩa Phản biện độc lập 2: PGS TS Nguyễn Tú Anh Phản biện 1: PGS TS BS Lý Văn Xuân Phản biện 2: PGS TS Ngô Thị Hoa Phản biện 3: PGS TS Phan Thị Phượng Trang Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại: Phòng 410B4 (lầu 4, nhà B4) – Trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh vào lúc 00 ngày 13 tháng 05 năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp HCM - Thư viện Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Nguyễn Sĩ Tuấn, Nguyễn Ngọc Thanh, Lưu Trần Linh Đa Nguyễn Thúy Hương (2014) Giá trị MIC Acinetobacter baumannii thực hành lâm sàng Bệnh viện Đa khoa Thống Nhất Đồng Nai Tạp chí Y học Thực hành, (902), 64-66 Nguyễn Sĩ Tuấn, Lưu Trần Linh Đa, Lê Duy Nhất, Hứa Mỹ Ngọc, Nguyễn Ngọc Thanh, Phạm Thị Thanh Thủy, Phạm Văn Dũng Nguyễn Thúy Hương (2014) Phát carbapenemase kiểu OXA Acinetobacter baumannii multiplex PCR-ELISA Tạp chí Y học Tp Hồ Chí Minh, 18 (6): 458-462 Nguyễn Sĩ Tuấn, Nguyễn Ngọc Thanh Nguyễn Thúy Hương (2014) Các tiến gần sàng lọc đề kháng kháng sinh Acinetobacter baumannii Tạp chí Truyền nhiễm Việt Nam, 3: 1-7 Nguyễn Sĩ Tuấn, Phan Thị Vân Anh, Trần Viết Lãm, Phạm Văn Dũng Nguyễn Thúy Hương (2016) Tác dụng phối hợp colistin với meropenem lên Acinetobacter baumannii mang nhóm gene thủy phân carbapenem gây viêm phổi bệnh viện Tạp chí Y học Thực hành (1001): – Nguyễn Sĩ Tuấn, Phạm Thị Thu Hằng, Lê Duy Nhất Nguyễn Thúy Hương (2017) Giải trình tự hệ gene chủng Acinetobacter baumannii đa kháng lâm sàng Việt Nam Tạp chí Y học Thực hành, (1037): 159 – 164 Si-Tuan, N., Thanh, N N., Hang, P T T., Van Dung, P., & Huong, N T (2016) Antimicrobial resistance patterns among Acinetobacter baumannii isolated from Thong Nhat Dong Nai General Hospital Orthopedics, 2(3), 6175 Anh, N T., Nga, T V T., Tuan, H M., Tuan, N S., Chau, N V V., Baker, S., & Duong, H H T (2017) Molecular epidemiology and antimicrobial resistance phenotypes of Acinetobacter baumannii isolated from patients in three hospitals in southern Vietnam Journal of medical microbiology, 66(1), 46-53 Si-Tuan, N., Ngoc, H M., Hang, P T T., Nguyen, C., Van, P H., & Huong, N T (2017) New eight genes identified at the clinical multidrug-resistant Acinetobacter baumannii DMS06669 strain in a Vietnam hospital Annals of clinical microbiology and antimicrobials, 16(1), 74 CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Chi Acinetobacter 1.1.1 Acinetobacter baumannii Bảng 1 Các điểm đặc trưng giống Acinetobacter Test A baumannii A Oxidase Di động Phát triển thạch + MacConkey Phát triển 420C + OF glucose + Khử NO3 Gelatin V Urea V Sinh sắc tố +: ≥ 90% chủng dương tính; -: ≥ 90% chủng âm tính; V: 11% - 89% chủng dương tính [1] 1.1.2 lwoffii + V V - Sinh bệnh học đề kháng kháng sinh 1.2 Các yếu tố độc lực Acinetobacter baumannii 1.3 Nhóm kháng sinh carbapenem 1.3.1 Hóa học 1.3.2 Cơ chế tác động 1.3.3 Sự đề kháng 1.4 Carbapenemase 1.4.1 Carbapenemase Ambler lớp A 1.4.2 Carbapenemase Ambler lớp B – Metallo-beta-lactamase 1.4.3 Beta-lactamase lớp D thủy phân carbapenem – Oxacillinase 1.4.4 Các trình tự chèn (IS) Acinetobacter 1.5 Sự đề kháng kháng sinh Acinetobacter baumannii 1.5.1 Tình hình đề kháng carbapenem giới 1.5.2 Nghiên cứu Acinetobacter baumannii kháng thuốc Việt Nam 1.6 Cơ chế tác động kháng sinh phối hợp 1.7 Giải trình tự hệ gene hệ (NGS) CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Địa điểm thời gian thực 2.2 Vật liệu 2.2.1 Hóa chất 2.2.2 Chủng vi khuẩn 2.3 Sơ đồ nghiên cứu luận án 2.4 Các phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Các phương pháp vi sinh lâm sàng 2.4.1.1 Phương pháp cấy đàm 2.4.1.2 Phương pháp định danh kháng sinh đồ tự động 2.4.1.3 Phương pháp hiệp đồng bàn cờ 2.4.2 Các phương pháp sinh học phân tử 2.4.2.1 Phương pháp tách chiết DNA 2.4.2.2 Phương pháp PCR đa mồi 2.4.2.3 Phương pháp realtime – PCR 2.4.2.4 Phương pháp cải tiến phương pháp Sanger 2.4.2.5 Phương pháp Illumina sequencing 2.4.2.6 Phương pháp điện di gel agarose 2.4.3 Các phương pháp Tin – Sinh học 2.4.4 Phương pháp thống kê CHƯƠNG 3.1 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết bàn luận 3.1.1 Đặc điểm kháng kháng sinh, tỷ lệ gen liên quan đến kháng carbapenem tác dụng diệt khuẩn in-vitro phối hợp kháng sinh lên Acinetobacter baumannii 3.1.1.1 Đặc điểm chung nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu 3.1.1.2 Tỷ lệ đề kháng kháng sinh Acinetobacter baumannii A baumannii nghiên cứu khơng nhạy cảm hồn tồn (100%) với hầu hết kháng sinh thử nghiệm (bao gồm nhóm kháng sinh lớn beta-lactam fluoro-quinolon) Nhóm aminoglycoside thường phối hợp với betalactam điều trị nhiễm khuẩn nặng Gram âm, khơng cịn nhạy cảm (100% gentamicin khơng cịn nhạy cảm với A baumannii) nhạy cảm với tỷ lệ thấp (7,5% với tobramycin 10,4% với amikacin) Mặc dù nhạy cảm với A baumannii với tỷ lệ 26,4%, Bactrim thích hợp cho điều trị nhiễm khuẩn nhẹ trực khuẩn Gram âm Do đó, hai kháng sinh cịn nhạy cảm với tỷ lệ cao, tigecycline (tỷ lệ nhạy cảm 99,1%) colistin (tỷ lệ nhạy cảm 100%) hai kháng sinh xem xét lựa chọn cho điều trị nhiễm khuẩn A baumannii đa đề kháng Trước thực trạng có kháng sinh cịn nhạy cảm tỷ lệ cao với A baumannii đa đề kháng, việc sử dụng thêm rifampicin phối hợp kháng sinh với meropenem xem xét thử nghiệm để đánh giá tác dụng hiệp đồng cộng lực in-vitro lên nhóm vi khuẩn đa kháng thuốc 3.1.2 MIC colistin, meropenem, rifampicin tigecycline Acinetobacter baumannii đề kháng carbapenem 3.1.2.1 MIC colistin với Acinetobacter baumannii đề kháng carbapenem Bảng 3 Giá trị MIC colistin A baumannii đề kháng carbapenem MIC_colistin, µg/ml 0,5 1,0 2,0 Tần số 87 13 Tỷ lệ % 4,7 82,1 12,3 Acinetobacter baumannii 3.1.2.2 MIC meropenem A baumannii đề kháng carbapenem Bảng Giá trị MIC meropenem A baumannii đề kháng carbapenem MIC_Meropenem, µg/ml 32 64 128 Meropenem Tần số 23 21, Tỷ lệ % 64 18 60,4 17 3.1.2.3 MIC rifampicin với A baumannii đề kháng carbapenem Bảng Giá trị MIC Rifampicin với A baumannii đề kháng carbapenem MIC_Rifampicin, µg/ml 1,0 2,0 4,00 8,00 Rifampicin 16 Tần số 13 48 33 Tỷ lệ % 1,9 12,3 45,3 31,1 7,5 3.1.2.4 MIC tigecycline A baumannii đề kháng carbapenem Bảng Giá trị MIC Tigecycline với A baumannii đề kháng carbapenem MIC_Tigecycline, µg/ml 0,125 0,25 0,5 Tần số 13 48 33 Tỷ lệ % 1,9 12,3 45,3 31,1 7,5 0,9 Tigecycline Các kháng sinh nhạy cảm cao với chủng A baumannii đề kháng với carbapenem colistin (còn nhạy cảm 100%), tigecycline (còn nhạy cảm 99,1%) rifampicin (còn nhạy cảm 59,5%) Tuy nhiên, mặt dược động – lực học, để điều trị hiệu nhiễm khuẩn A baumannii đa đề kháng (bao gồm đề kháng với meropenem), kháng sinh nên tổ hợp với meropenem (meropenem/colistin, meropenem/rifampicin) tổ hợp với (colistin/tigecycline) để tận dụng chế tác động khác kháng sinh tổ hợp kháng sinh nhằm tìm kiếm tác dụng hiệp đồng cộng lực 3.1.3 Tác dụng diệt khuẩn in-vitro phối hợp kháng sinh lên Acinetobacter baumannii 3.1.3.1 Các kiểu tác dụng in-vitro thử nghiệm phối hợp kháng sinh lên Acinetobacter baumannii đề kháng carbapenem Bảng Các kiểu tác dụng in-vitro tổ hợp kháng sinh lên A baumannii đề kháng carbapenem Tổ hợp kháng sinh Hiệp đồng Tần Tỷ lệ số % Cộng lực Tần Tỷ lệ số % Meropenem/Colistin 45 42,9 54 51,4 5,7 0 Meropenem/Rifampicin 36 34,3 50 47,6 18 17,1 1 Tigecycline/Colistin 4,8 33 31,4 67 63,8 0 Kiểu tác dụng Các kiểu phối hợp kháng sinh Độc lập Tần Tỷ lệ số % Đối kháng Tần Tỷ lệ số % meropenem/colistin meropenem/rifampicin có tác dụng hiệp đồng cộng lực với tỷ lệ cao, 94,3% 81,9% lên chủng A baumannii Tuy nhiên, tổ hợp tigecycline/colistin cho tác dụng hiệp đồng cộng lực với tỷ lệ 36,2% Do đó, cần cân nhắc việc phối hợp tigecycline với colistin điều trị nhiễm khuẩn A baumannii đa đề kháng 3.1.3.2 Tác dụng colistin, rifampicin nồng độ thấp MIC chuyển Acinetobacter baumannii từ không nhạy meropenem thành nhạy a Tác dụng colistin nồng độ thấp MIC chuyển A baumannii từ không nhạy meropenem thành nhạy Bảng Phân bố chủng A baumannii chuyển từ khơng nhạy meropenem thành nhạy có phối hợp với colistin mức nồng độ thấp MIC MIC_meropenem ≤ µg/ml Nồng độ colistin (µg/ml) Tần số Tỷ lệ, % 0,125 0 0,5 2,9 34 32,4 101 96,2 Từ Bảng 3.8 cho thấy, colistin nồng độ MIC có khả chuyển chủng Acinetobacter baumannii khơng nhạy meropenem thành nhạy Cụ thể, mức nồng độ 1,0 µg/ml colistin, tỷ lệ chuyển chủng bắt đầu rõ rệt (chiếm tỷ lệ 32,4%) có khả chuyển chủng A baumannii không nhạy meropenem thành nhạy nồng độ colistin 2,0 µg/ml colistin (chiếm 96,2%) b Tác dụng rifampicin nồng độ thấp MIC chuyển Acinetobacter baumannii từ không nhạy meropenem thành nhạy Bảng Phân bố chủng A baumannii chuyển từ khơng nhạy meropenem thành nhạy có phối hợp với rifampicin mức nồng độ thấp MIC MIC_meropenem ≤ µg/ml Nồng độ rifampicin Tần số Tỷ lệ, % (µg/ml) 0,25 0 0,5 1.9 1,0 3.8 2,0 64 61 4,0 98 93.3 Từ Bảng 3.9 cho thấy, rifampicin nồng độ MIC có khả chuyển chủng A baumannii khơng nhạy meropenem thành nhạy Cụ thể, mức nồng độ 2,0 µg/ml colistin, tỷ lệ chuyển chủng bắt đầu rõ rệt (chiếm tỷ lệ 61%) có khả chuyển chủng A baumannii không nhạy meropenem thành nhạy nồng độ rifampicin 4,0 µg/ml colistin (chiếm 93,3%) 3.1.3.3 So sánh tác dụng hiệp đồng cộng lực tổ hợp kháng sinh Acinetobacter baumannii Bảng 10 Tóm tắt kiểm định giả thuyết tác dụng hiệp đồng cộng lực tổ hợp kháng sinh A baumannii STT Giả thuyết 01 02 03 Phép kiểm Phân phối giá trị khác tổ hợp Mc meropenem/colistin; meropenem/rifampicin Nemar tương đương Phân phối giá trị khác tổ hợp Mc meropenem/colistin; tigecycline/colistin tương Nemar đương Phân phối giá trị khác tổ hợp Mc meropenem/rifampicin; tigecycline/colistin Nemar tương đương p 0,011 Giả thuyết Bác bỏ 0,001 Bác bỏ 0,001 Bác bỏ OD260 = 1,000 µg = 32,500 nmol = 6,219 100µM = dissolve in 62,2 µl of MQ-water or TE buffer 22 DMS06670_scf_13_3 Gene dự đoán Gene kháng DMS06670_scf_13_3 sul1 Lớp kháng sinh Length (bp) Tình trạng bị kháng Sulphonamide 348 Complete ATGAAAGGCTGGCTTTTTCTTGTTATCGCAATAGTTGGCGAAGTAATCGC AACATCCGCATTAAAATCTAGCGAGGGCTTTACTAAGCTTGCCCCTTCC GCCGTTGTCATAATCGGTTATGGCATCGCATTTTATTTTCTTTCTCTGGTT CTGAAATCCATCCCTGTCGGTGTTGCTTATGCAGTCTGGTCGGGACTCGG CGTCGTCATAATTACAGCCATTGCCTGGTTGCTTCATGGGCAAAAGCTTG ATGCGTGGGGCTTTGTAGGTATGGGGCTCATAATTGCTGCCTTTTTGCTC GCCCGATCCCCATCGTGGAAGTCGCTGCGGAGGCCGACGCCATGGTGA F20: 5'-atgaaaggctggctttttcttg-3' Length=22 A=4,0 G=6,0 T=9,0 C=3,0 CG=40,9% Linguistic complexity = 72% Primer's PCR efficiency = 60% dG = -26,1 kcal/mol dH = -166,7 kcal/mol dS = -476,6 cal/K mol Tm = 54,0°C (Allawi's thermodynamics parameters (Biochemistry,1997, 36:1058110594) Tm = 54,7°C (Tm = 77.1 + 11.7Log[K+] + (41(G + C) - 528)/L) Extinction coefficient = 204800 L/(mol·cm) Molecular weight = 6771 g/mol OD260 = 1,000 µg = 33,062 nmol = 4,883 100µM = dissolve in 48,8 µl of MQ-water or TE buffer R20: 5'-tcaccatggcgtcgg-3' Length=15 A=2,0 G=5,0 T=3,0 C=5,0 CG=66,7% Linguistic complexity = 87% Primer's PCR efficiency = 57% dG = -20,8 kcal/mol dH = -118,5 kcal/mol dS = -330,4 cal/K mol Tm = 52,9°C (Allawi's thermodynamics parameters (Biochemistry,1997, 36:1058110594) Tm = 54,0°C (Tm = 77.1 + 11.7Log[K+] + (41(G + C) - 528)/L) Extinction coefficient = 138000 L/(mol·cm) Molecular weight = 4569 g/mol OD260 = 1,000 231 µg = 33,109 nmol = 7,246 100µM = dissolve in 72,5 µl of MQ-water or TE buffer 23 DMS06670_scf_13_4 Gene dự đoán Gene kháng DMS06670_scf_13_4 sul1 Lớp kháng sinh Length (bp) Tình trạng bị kháng Sulphonamide 840 Complete ATGGTGACGGTGTTCGGCATTCTGAATCTCACCGAGGACTCCTTCTTCGA TGAGAGCCGGCGGCTAGACCCCGCCGGCGCTGTCACCGCGGCGATCGA AATGCTGCGAGTCGGATCAGACGTCGTGGATGTCGGACCGGCCGCCAGC CATCCGGACGCGAGGCCTGTATCGCCGGCCGATGAGATCAGACGTATTG CGCCGCTCTTAGACGCCCTGTCCGATCAGATGCACCGTGTTTCAATCGAC AGCTTCCAACCGGAAACCCAGCGCTATGCGCTCAAGCGCGGCGTGGGCT ACCTGAACGATATCCAAGGATTTCCTGACCCTGCGCTCTATCCCGATATT GCTGAGGCGGACTGCAGGCTGGTGGTTATGCACTCAGCGCAGCGGGATG GCATCGCCACCCGCACCGGTCACCTTCGACCCGAAGACGCGCTCGACGA GATTGTGCGGTTCTTCGAGGCGCGGGTTTCCGCCTTGCGACGGAGCGGG GTCGCTGCCGACCGGCTCATCCTCGATCCGGGGATGGGATTTTTCTTGAG CCCCGCACCGGAAACATCGCTGCACGTGCTGTCGAACCTTCAAAAGCTG AAGTCGGCGTTGGGGCTTCCGCTATTGGTCTCGGTGTCGCGGAAATCCTT CTTGGGCGCCACCGTTGGCCTTCCTGTAAAGGATCTGGGTCCAGCGAGC CTTGCGGCGGAACTTCACGCGATCGGCAATGGCGCTGACTACGTCCGCA CCCACGCGCCTGGAGATCTGCGAAGCGCAATCACCTTCTCGGAAACCCT CGCGAAATTTCGCAGTCGCGACGCCAGAGACCGAGGGTTAGATCATGCC TAG F7: 5'-atggtgacggtgttcgg-3' Tm = 53,6°C (Allawi's thermodynamics parameters (Biochemistry,1997, 36:1058110594) Tm = 54,9°C (Tm = 77.1 + 11.7Log[K+] + (41(G + C) - 528)/L) R21: 5'-ctaggcatgatctaaccctcg-3' Length=21 A=5,0 G=4,0 T=5,0 C=7,0 CG=52,4% Linguistic complexity = 92% Primer's PCR efficiency = 80% dG = -25,2 kcal/mol dH = -157,4 kcal/mol dS = -448,3 cal/K mol Tm = 53,9°C (Allawi's thermodynamics parameters (Biochemistry,1997, 36:1058110594) Tm = 58,2°C (Tm = 77.1 + 11.7Log[K+] + (41(G + C) - 528)/L) Extinction coefficient = 196400 L/(mol·cm) Molecular weight = 6366 g/mol 232 OD260 = 1,000 µg = 32,413 nmol = 5,092 100µM = dissolve in 50,9 µl of MQ-water or TE buffer 24 DMS06670_ctg_47:1138-1998 Gene dự đoán DMS06670_ctg_47: 1138-1998 Gene kháng Lớp kháng sinh Length (bp) Tình trạng bị kháng aac(3)-IId Aminoglycoside 861 N/A CTAACCTGAAGGCTCGCAAGAGCGCTCGACGGCCTCGTGCGGAGGCAC GATCGGAGTGGTTCCGAAATGCTTCTCAAGATAGGTGACGCCGAACGTC ACGATGTCCTGCGCGTCGAACAGGTAGCACTGAGCAAAGCCCACGACA CCTTCTCGATGGCGACCGAGCTTCACGTAAGCATTTGCTATAGTTTCAAC CGCATCCGGCTTTCCTTCGATAGCAAAGCAATCGAGAATGCCGTTTGAA TCGTAATCCGATGCCGTTTTCCAGGCGACTTCACCGTCTCTTCCAAGCAT CGGCATCTCATACGTCACCCACCGTTTGTTGGGGATATCGGCAACCGCC TCGGCGTAGTGCAATGCGGTAACGGAGTTTAGCGGCGCACCCAACAGCA GGGCCTTCCCGCCAAGGCGAACGAACCGCTCGACGGGCGATCCTTCCCC CAAGGCGTGACCGAGTTCGTGAGGCTCCGTCAGCGTTTCAGCCAGCGGA CCAACCGCGACCATCGATGCATCGGGGTGCGCGCTGCGCCGCGCGCCGG GGGCTTGAACCAGAAATTGATTCAGCAGGCCGAACCCACGGTAAGTCCC GGCTGTTGCGGGATCGAACGGCAGCCAGGTACGGCGGGCTTCGTCATCC AGCCGAGCGCCATTCAGAGTCTCCTCGTAGGGTGATCGGTCCCACGACG CGTATCCCATCACAGTGCCAGTCGGCCCAACCGCGGAGCGTAACGCGGC AACGACCGTCTCCGCTCCTCCTTCGACCGGACCAATCGCTTTAAGTGAG GCATGCACCATCAAGAGGTCACCGGTTTGGACTCCGAGTTTTTGAAGCG CCTCCGTTATTGCCTTCCGCGTATGCAT F: 5'-ctaacctgaaggctcgca-3' Length=18 A=5.0 G=4.0 T=3.0 C=6.0 CG=55.6% Linguistic complexity = 92% Primer's PCR efficiency = 87% dG = -23.0 kcal/mol dH = -139.2 kcal/mol dS = -393.4 cal/K mol Tm = 53.3°C (Allawi's thermodynamics parameters (Biochemistry,1997, 36:1058110594) Tm = 55.3°C (Tm = 77.1 + 11.7Log[K+] + (41(G + C) - 528)/L) Extinction coefficient = 170300 L/(mol·cm) Molecular weight = 5469 g/mol OD260 = 1.000 µg = 32.114 nmol = 5.872 233 100µM = dissolve in 58.7 µl of MQ-water or TE buffer R: 5'-atgcatacgcggaaggc-3' Length=17 A=5.0 G=6.0 T=2.0 C=4.0 CG=58.8% Linguistic complexity = 86% Primer's PCR efficiency = 70% dG = -23.0 kcal/mol dH = -134.8 kcal/mol dS = -378.2 cal/K mol Tm = 54.7°C (Allawi's thermodynamics parameters (Biochemistry,1997, 36:1058110594) Tm = 54.9°C (Tm = 77.1 + 11.7Log[K+] + (41(G + C) - 528)/L) Extinction coefficient = 169800 L/(mol·cm) Molecular weight = 5244 g/mol OD260 = 1.000 µg = 30.883 nmol = 5.889 100µM = dissolve in 58.9 µl of MQ-water or TE buffer 234 Phụ lục Danh sách bệnh nhân tham gia nghiên cứu CODE HỌ TÊN BỆNH NHÂN NĂM SINH GIỚI KHOA CHẨN ĐOÁN A001 LE CHI N 1983 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A002 PHAM VAN T 1986 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A003 TRINH VAN P 1970 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A004 NGUYEN THI N 1951 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A005 HOANG NGOC T 1942 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A006 NGUYEN XUAN U 1950 Nam Nội TH Không viêm phổi A007 NGUYEN THI Q 1927 Nữ Nội TH Viêm phổi A008 PHAM M 1945 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A009 TRAN THI L 1942 Nữ Nội TH Viêm phổi A012 TRAN THI K 1935 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A013 CHUONG A S 1938 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A014 DO VAN N 1929 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A015 PHAM VAN P 1922 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A016 HUYNH VAN O 1921 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A018 PHAM VAN P 1922 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A020 VO DANH N 1921 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A022 PHAM THI M 1949 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A028 LE THI T 1939 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A029 LIEU KIM H 1957 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A030 CAO THI N 1959 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A031 NGUYEN VAN M 1927 Nam CTCH-Bỏng Không viêm phổi A034 NGUYEN KIM C 1948 Nam Nội TH Viêm phổi A036 NGUYEN THI C 1937 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A038 LE VAN D 1997 Nam CTCH-Bỏng Không viêm phổi A051 TRAN VAN D 1935 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A053 VU VAN D 1956 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A057 VUONG CON H 1954 Nam Nội TM Không viêm phổi A065 NGUYEN XUAN N 1950 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi 235 A066 NGUYEN THI KIM N 1969 Nữ CTCH-Bỏng Không viêm phổi A067 CU THI T 1935 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A081 NGUYEN VU P 1940 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A088 NGUYEN VAN T 1954 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A091 KHONG MINH H 1930 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A101 HOA K 1936 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A102 NGUYEN DUC N 1957 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A105 BUI DUY Q 1948 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A106 CHU THI T 1943 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A107 TRAN DINH K 1927 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A108 VU THI N 1930 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A109 LE THI L 1937 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A111 NGUYEN XUAN U (lần 1) 1950 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A112 NGUYEN SY B 1947 Nam Nội TH Viêm phổi A113 DINH VAN L 1925 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A114 NGUYEN VAN C 1932 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A115 TCHENG A P 1945 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A116 NGUYEN VAN T 1954 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A117 DO VAN T 1938 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A119 PHAM THI G 1952 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A120 NGUYEN THI MY H 1952 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A121 TRUONG THI C 1932 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A123 NGUYEN DUC T 1960 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A126 NGUYEN DUY C 1925 Nam Nội TH Viêm phổi A127 PHAM LE N (Lần 1) 1996 Nữ Nội TH Viêm phổi A128 LE ANH K 1952 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A129 PHAM THI D 1936 Nữ Nội TH Viêm phổi A130 TRAN THI SA M 1969 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A132 TRAN THI T 1925 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A134 NGUYEN THI HOAI T 1976 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A135 VU THI N 1924 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi 236 A136 LE VAN T 1960 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A137 PHAM THI N 1941 Nữ Nội TH Viêm phổi A138 PHAM LE N (Lần 2) 1996 Nữ Nội TH Viêm phổi A139 NGUYEN THI H 1930 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A140 DINH VIET S 1937 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A142 VU VAN T 1936 Nam Nội TH Viêm phổi A144 VU VAN L 1938 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A146 NGUYEN THI THANH T 1990 Nữ CTCH-Bỏng Không viêm phổi A147 PHAM THI R 1941 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A148 THAI VAN L 1924 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A150 NGUYEN DUC N 1957 Nam Nội TH Viêm phổi A151 NGUYEN MINH T 1989 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A152 NGUYEN VAN L 1982 Nam CTCH-Bỏng Viêm phổi A156 DUONG HONG P 1957 Nam Nội TH Không viêm phổi A157 NGUYEN XUAN U (lần 2) 1950 Nam Nội TH Viêm phổi A158 DONG THI NHU O 1926 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A159 HUYNH VAN H 1950 Nam CTCH-Bỏng Không viêm phổi A162 PHAM VAN T 1930 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A163 NGUYEN K 1924 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A164 DANG VAN C 1948 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A165 NGUYEN THI L 1937 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A166 DAO DUC T 1955 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A167 HO DA C 1957 Nam Nội TH Viêm phổi A168 PHAM THI L 1935 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A169 LY VAN C 1958 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A170 TO THI L 1930 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A172 DANG THI H 1941 Nữ Nội TH Không viêm phổi A174 DANG T 1944 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A175 DO VAN N 1955 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A176 NGUYEN THI V 1942 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A177 HO DUC T 1942 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi 237 A180 TRAN MINH T 1949 Nam CTCH-Bỏng Không viêm phổi A182 NGUYEN DANH H 1971 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A183 VU THI M 1934 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A184 TRAN VIET H 1951 Nam Nội TM Không viêm phổi A185 LE MINH H 1984 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A186 TRAN THI L 1936 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A187 HOANG VAN P 1955 Nam Nội TH Viêm phổi A201 PHAM VAN N 1937 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A204 DO THI T (Lần phân lập 1) 1928 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A205 VU VAN T 1950 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A207 DO THI T (Lần phân lập 2) 1928 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A208 NGUYEN THI Y 1939 Nữ Nội TM Không viêm phổi A209 TRAN LUU Q 1942 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A224 BUI THI N 1938 Nữ Nội TH Viêm phổi A225 TRAN THI T 1931 Nữ Nội TH Viêm phổi 238 Phụ lục Các trình tự mồi sử dụng nghiên cứu khuếch đại in vitro gen in-silico hình 3.13 Gen dự đốn Lớp kháng sinh bị kháng Trình tự mồi blaOXA-64 blaADC-25 aadB blaVEB-7 aadA16 dfrA27 sul1 tet(39) mph(E) msr(E) ARR-3 floR rmtB cmlA1 blaOXA-10 aadA1 blaADC-25 blaOXA-68 mph(E) msr(E) blaCARB-2 F1: 5'-atgaacattaaagcactc-3' R1: 5'-ctataaaatacctaattgttc-3' F2: 5'-atgcgatttaaaaaaatttcttgtc-3' Beta-lactam R2: 5'-ttatttctttattgcattcagcac-3' F3: 5'-atggacacaacgcaggtc-3' Aminoglycoside R3: 5'-ttaggccgcatatcgcg-3' F4: 5'-atgaaaatcgtaaaaagg-3' Beta-lactam R4: 5'-ttatttattcaaatagtaattccacg-3' F5: 5'-atgagcaacgcagtgcccg-3' Aminoglycoside R5: 5'-ttaagctgcgccgcgaagc-3' F6: 5'-cgccattttatgcgc-3' Trimethoprim R6: 5'-ttaacccctttgccag-3' F7: 5'-atggtgacggtgttcgg-3' Sulphonamide R7: 5'-ctaggcatgatctaaccctc-3' F8: 5'-gtgaagaaatcattgagcgtg-3' Tetracycline R8: 5'-ttatggaactccagaatatttattcagg-3' F9: 5'-atgacaattcaagatattcaatcac-3' Macrolide R9: 5'-ttatataactcccaactgagc-3' Macrolide, Lincosamide F10: 5'-atgagtttaattattaaagcgag-3' R10: 5'-ttaacaatctctctcaaaagtc-3' Streptogramin B F11: 5'-atggtaaaagattggattccc-3' Rifampicin R11: 5'-ctagtcttcaatgacgtg-3' F12: 5'-atgaccaccacacgc-3' Phenicol R12: 5'-ttagacgactggcgac-3' F13: 5'-atgaacatcaacgatgc-3' Aminoglycoside R13: 5'-ttatccattcttttttatcaag-3' F14: 5'-gtgcgctcaaaaaactttagttgg-3' Phenicol R14: 5'-tcaacgattgggatttgatgtactttcc-3' F15: 5'-atgaaaacatttgccgc-3' Beta-lactam R15: 5'-ttagccaccaatgatgcc-3' F16: 5'-gtggctaaaacaaagttaaacatcatg-3' Aminoglycoside R16: 5'-ttatttgccgactaccttggtg-3' F2: 5'-atgcgatttaaaaaaatttcttgtc-3' Beta-lactam R17: 5'-ttatttttttattgcatttaaaactgc-3' F1: 5'-atgaacattaaagcactc-3' Beta-lactam R18: 5'-ctataaaatacctaattgttctaagc-3' F9: 5'-atgacaattcaagatattcaatcac-3' Macrolide R9: 5'-ttatataactcccaactgagc-3' Macrolide, Lincosamide F10: 5'-atgagtttaattattaaagcgag-3' R10: 5'-ttaacaatctctctcaaaagtc-3' Streptogramin B F19: 5'-atgcttttatataaaatgtgtgac-3' Beta-lactam R19: 5'-tcagcgcgactgtgatg-3' Beta-lactam Alternate name; PSE-1, blaP1b 239 sul1 Sulphonamide sul1 Sulphonamide aac(3)-IId Aminoglycoside F20: 5'-atgaaaggctggctttttcttg-3' R20: 5'-tcaccatggcgtcgg-3' F7: 5'-atggtgacggtgttcgg-3' R21: 5'-ctaggcatgatctaaccctcg-3' F: 5'-ctaacctgaaggctcgca-3' R: 5'-atgcatacgcggaaggc-3' 240 Phụ lục Kết điện di mẫu nghiên cứu sau PCR đa mồi để phát gen blaOXA thường gặp A baumannii kháng carbapenem 241 242 243 244 Vì số lý quyền, nên tơi khơng thể upload tồn tài liệu Để đọc hết tài liệu vui lòng liên hệ ZALO : 0353764719 ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN SĨ TUẤN NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG CARBAPENEM Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ CỦA ACINETOBACTER BAUMANNII GÂY NHIỄM KHUẨN TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA THỐNG NHẤT ĐỒNG NAI Chuyên ngành: Công... HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN SĨ TUẤN NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG CARBAPENEM Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ CỦA ACINETOBACTER BAUMANNII GÂY NHIỄM KHUẨN TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA THỐNG NHẤT ĐỒNG NAI LUẬN ÁN TIẾN SĨ TP HỒ CHÍ MINH... sinh học phân tử Tóm lại, việc thực luận án: ? ?Nghiên cứu mức độ phân tử đặc điểm kháng thuốc Acinetobacter baumannii kháng carbapenem gây nhiễm khuẩn bệnh viện đa khoa Thống Nhất Đồng Nai? ?? nhằm