Nghiên cứu tính kháng kháng sinh ở mức độ phân tử của Salmonella spp. phân lập từ thực phẩm tại Thành phố Hồ Chí Minh tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM TRƯƠNG HUỲNH ANH VŨ NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ CỦA SALMONELLA SPP PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Chun ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Mã số ngành: 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM  TRƯƠNG HUỲNH ANH VŨ NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ CỦA SALMONELLA SPP PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9.42.02.01 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2022 Cơng trình hồn thành tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM DỊCH VỤ PHÂN TÍCH THÍ NGHIỆM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Hoàng Khuê Tú Phản biện 1: PGS TS Phan Thị Phượng Trang Phản biện 2: TS Hoàng Hoài Phương Phản biện 3: TS Đinh Xuân Phát Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp sở họp tại: Phòng 307, Khu Thiên Lý, Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh Vào hồi 00 phút, ngày 22 tháng 12 năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh MỞ ĐẦU Ngày nay, kháng sinh không dùng để điều trị bệnh cho người mà cịn sử dụng rộng rãi nơng nghiệp với mục đích phịng, trị bệnh cho vật ni, thủy hải sản, chí cịn bổ sung vào thức ăn chăn ni với mục đích kích thích tăng trưởng Điều làm xuất gia tăng khả kháng kháng sinh vi sinh vật, tác động tiêu cực đến tính bền vững chuỗi sản xuất lương thực, nông nghiệp, môi trường sinh thái bị ô nhiễm nghiêm trọng, ảnh hưởng đến sức khỏe đời sống người dân Kháng kháng sinh dự đoán nguyên nhân khoảng 10 triệu trường hợp tử vong hàng năm vào năm 2050 gây thiệt hại 100 nghìn tỷ USD tồn giới (O’neill ctv, 2016) Ước tính năm giới có khoảng 93,8 triệu ca nhiễm, 155.000 ca tử vong, nguyên nhân hàng loạt vụ ngộ độc thực phẩm quy mô lớn năm qua liên quan đến vi khuẩn Salmonella Nguồn nhiễm Salmonella vào thực phẩm chủ yếu từ nguyên liệu trình chế biến, đóng gói bảo quản Cho đến nay, 2.500 kiểu huyết Salmonella xác định nửa số thuộc Salmonella enterica subsp enterica Bên cạnh đó, thực trạng kháng kháng sinh ngày tăng, đặc biệt nhóm vi khuẩn Gram âm, mối nguy lớn sức khoẻ cộng đồng Sự xuất gia tăng Salmonella đa kháng với nhiều loại kháng sinh, bao gồm loại kháng sinh quan trọng sử dụng lâm sàng ceftriaxone ciprofloxacin có tác động lớn đến hiệu điều trị dẫn đến tỷ lệ tử vong cao (Shu ctv, 2015; Divek ctv, 2018) Tại Việt Nam hệ thống giám sát vi khuẩn Salmonella kháng kháng sinh thực phẩm chưa thiết lập có chưa mang tính liên tục; chương trình, kế hoạch, hoạt động năm gần cho biết Salmonella kháng kháng sinh thường tập trung từ nguồn bệnh phẩm cịn từ thực phẩm chưa có nhiều báo cáo đầy đủ, tồn diện, đặc biệt tình trạng đa kháng Salmonella Hơn nữa, nghiên cứu diện gen kháng khả đa kháng kháng sinh có liên quan đến yếu tố di truyền di động plasmid, tranposon integron Salmonella phân lập từ nguồn thực phẩm thành phố Hồ Chí Minh cịn nhiều hạn chế Chính cần thiết ý nghĩa thực tiễn nêu chọn tiến hành thực “Nghiên cứu tính kháng kháng sinh mức độ phân tử Salmonella spp phân lập từ thực phẩm thành phố Hồ Chí Minh” thực với hai mục tiêu cụ thể sau: Khảo sát tỷ lệ nhiễm, xác định mức độ nhạy với kháng sinh Salmonella spp phân lập từ nhóm thực phẩm khác chợ bán lẻ địa bàn thành phố Hồ Chí Minh Nghiên cứu đặc điểm phân tử liên quan đến chế kháng kháng sinh Salmonella spp phân lập từ thực phẩm Xác định phân tích mối quan hệ nhóm gen kháng với diện integron, vùng gen cassette, plasmid không tương hợp Salmonella spp có kiểu hình đa kháng Đóng góp luận án Xác định tỷ lệ kháng kháng sinh Salmonella spp thực phẩm (thịt, thủy hải sản, rau củ quả, trứng) thành phố Hồ Chí Minh Xác định đặc điểm gen yếu tố liên quan tính kháng kháng sinh (nhóm integron, kiểu plasmid không tương hợp) serovar Salmonella spp phân lập từ thực phẩm Xác định đột biến gen blaTEM/blaCTX mã hoá sinh ESBL gen gyrA, parC liên quan đến kháng kháng sinh nhóm quinolon dựa kết giải trình tự Đã đăng ký accession number Ngân hàng Cơ sở Dữ liệu DNA (DDBJ), Nhật Bản Bố cục luận án Luận án thức gồm 115 trang (khơng bao gồm phụ lục), chương, 26 bảng số liệu 14 hình Luận án tham khảo 22 tài liệu tiếng Việt 172 tài liệu tiếng Anh CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình thực phẩm nhiễm Salmonella giới 1.2 Tình hình thực phẩm nhiễm Salmonella Việt Nam 1.3 Thực trạng sử dụng tồn dư kháng sinh 1.4 Tình hình kháng kháng sinh Salmonella 1.4.1 Tình hình kháng kháng sinh Salmonella giới 1.4.2 Tình hình kháng kháng sinh Salmonella Việt Nam 1.5 Đặc điểm sinh học Salmonella 1.6 Cơ chế kháng β-lactam, quinolone, tetracycline, aminoglycoside, phenicol, sulfonamide/trimethoprim Salmonella 1.7 Tình hình nghiên cứu gen kháng kháng sinh Salmonella 1.8 Yếu tố di truyền di động CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Nguyên liệu Các chủng Salmonella phân lập từ bốn nhóm thực phẩm sản phẩm chế biến như: thịt, trứng, thủy sản, rau củ 2.1.2 Mơi trường, hóa chất, kháng sinh, kit 2.1.3 Chủng chuẩn vi sinh vật dùng làm kiểm soát 2.1.4 Thiết bị 2.2 Phương pháp Hình 2.1 Tóm tắt sơ đồ nghiên cứu 2.3 Phương pháp lấy bảo quản mẫu Mẫu lấy chợ từ 08 đến 09 sáng (09/201909/2020) chuyển đến phịng thí nghiệm khơng q 12 sau lấy, tiến hành phân tích 2.4 Phương pháp phân lập xác định serovar Salmonella 2.5 Khảo sát tính nhạy với kháng sinh Salmonella 2.6 Ly trích DNA Salmonella Theo hướng dẫn kit Genet Bio (Hàn Quốc) 2.7 Phương pháp phát Salmonella kỹ thuật PCR 2.8 Phương pháp PCR khảo sát diện integron, vùng gen cassette, plasmid khơng tương hợp; gen kháng nhóm beta-lactam, tetracyline, phenicol, sulfonamid, aminoglycoside quinolon 2.9 Phân tích mối tương quan yếu tố di truyền di động với gen kháng kháng sinh dựa vào kỹ thuật giải trình tự gen hệ (WGS) 2.10 Phương pháp xử lý số liệu Phần mềm Microsoft excel 2019, SPSS 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella nhóm thực phẩm Tỷ lệ nhiễm Salmonella 16,84%, nhóm thịt 43,16%, thủy hải sản 23,95% rau củ 0,26% Khơng phát Salmonella nhóm trứng Đối với nhóm thịt, mẫu thịt heo có tỷ lệ nhiễm Salmonella cao (90,79%), tiếp đến thịt gà (77,63%), thịt bò (43,42%) (Bảng 3.1) Bảng 3.1 Tỷ lệ nhiễm Salmonella thịt heo, bò, gà Mẫu Thịt heo Thịt bò Thịt gà Tổng Tổng số mẫu 76 76 76 228 Dương tính Số mẫu Tỷ lệ (%) 69 90,79 33 43,42 59 77,63 161 70,61 Âm tính Số mẫu Tỷ lệ (%) 07 9,21 43 56,58 17 22,37 67 29,39 2 = 43,7949; p < 0,00001 Đối với nhóm thủy hải sản, mẫu cá có tỷ lệ nhiễm Salmonella cao mẫu mực tôm 40,20%, 17,14% 7,46% (Bảng 3.2) Bảng 3.2 Tỷ lệ nhiễm Salmonella mẫu cá, tôm, mực Mẫu Cá Tôm Mực Tổng Tổng số mẫu 199 67 35 301 Dương tính Số mẫu Tỷ lệ (%) 75 37,69 10 14,93 06 17,14 91 30,23 Âm tính Số mẫu Tỷ lệ (%) 124 62,31 57 85,07 29 82,86 73 69,77 2 = 28,6874; p < 0,00001 3.2 Đặc điểm kháng kháng sinh chủng Salmonella 3.2.1 Khả kháng kháng sinh chủng Salmonella Khả kháng loại kháng sinh chiếm 11,33%, kháng từ 03 đến 06 loại kháng sinh chiếm 30,67% từ 07 đến 11 loại kháng sinh chiếm 14,00% (Bảng 3.3) Bảng 3.3 Mức độ kháng kháng sinh Salmonella Số lượng kháng sinh Chỉ 01 kháng sinh Từ 03-06 kháng sinh Từ 07-11 kháng sinh Kháng 11,33% (17) 30,67% (46) 14,00% (21) Tỷ lệ (%) Trung gian 43,33% (65) 2,00% (03) 0% (00) Nhạy 1,33% (02) 29,33% (44) 63,33% (95) Tỷ lệ kháng loại kháng sinh Salmonella từ thịt heo, bò, gà 21,05%, 2,78%, 5,56%; từ 03 đến 06 loại kháng sinh 31,58%, 55,56%, 16,67%; từ 07 đến 11 loại kháng sinh 5,26%, 13,89%, 5,56% (Bảng 3.4) Tỷ lệ kháng loại kháng sinh Salmonella từ mẫu cá, mực, tôm 13,95%, 0%, 10%; từ 03 đến 06 loại kháng sinh 18,60%, 40,00%, 10,00%; từ 07 đến 11 loại kháng sinh có chủng từ mẫu cá 30,23% (Bảng 3.5) Bảng 3.4 Mức độ kháng kháng sinh Salmonella từ thịt heo, gà, bò Số lượng kháng sinh Kháng Heo Gà Bò Chỉ 01 21,05 2,78 5,56 kháng sinh (08) (01) (01) Từ 03-06 31,58 55,56 16,67 kháng sinh (12) (20) (03) Từ 07-11 5,26 13,89 5,56 kháng sinh (02) (05) (01) Fisher’s Exact test = 8,950; p = 0,039 Tỷ lệ (%) (Heo: 38; Gà: 36; Bò: 18) Trung gian Heo Gà Bò 50,00 30,56 44,44 (19) (11) (08) 5,56 (00) (02) (00) 0 (00) (00) (00) Heo (00) 26,32 (10) 71,05 (27) Nhạy Gà 5,56 (02) 44,44 (16) 50,00 (18) Bò (00) 11,11 (02) 83,33 (15) Bảng 3.5 Mức độ kháng kháng sinh Salmonella từ cá, mực, tôm Số lượng kháng sinh Chỉ 01 kháng sinh Từ 03-06 kháng sinh Từ 07-11 kháng sinh Cá 13,95 (06) 18,60 (08) 30,23 (13) Kháng Mực (00) 40,00 (02) (00) Tôm 10,00 (01) 10,00 (01) (00) Tỷ lệ (%) (Cá: 43; Mực: 05; Tôm: 10) Trung gian Cá Mực Tôm Cá 44,19 30,00 2,33 (19) (00) (03) (01) 16,28 40,00 10,00 30,23 (00) (00) (01) (13) 0 53,49 (00) (00) (00) (23) Fisher’s Exact test = 4,934; p = 0,136 Nhạy Mực (00) 40,00 (02) 60,00 (03) Tôm (00) 10,00 (01) 90,00 (09) Bảng 3.8 Mức độ kháng loại kháng sinh Salmonella từ cá, mực, tôm Kháng sinh AMC AMP CAZ C NA CIP OFX GM STR TE SXT Cá (n=43) Số chủng % kháng 01 2,33 22 51,16 01 2,33 17 39,53 19 44,19 11 25,58 07 16,28 13 30,23 19 44,19 25 58,14 14 32,56 Mực (n=05) Số chủng % kháng 00 02 40,0 00 00 00 00 00 01 20,0 02 40,0 02 40,0 02 40,0 Tôm (n=10) Số chủng % kháng 02 20,0 01 10,0 01 10,0 00 01 10,0 01 10,0 00 00 00 00 01 10,0 Chung (n=58) Số chủng % kháng 03 5,17 25 43,10 02 3,45 17 29,31 20 34,48 12 20,69 07 12,07 14 24,14 21 36,21 27 46,55 17 29,31 Fisher’s Exact test = 25,071; p = 0,052 3.2.4 Kiểu hình kháng kháng sinh chủng Salmonella Kiểu hình đa kháng phổ biến AMP, C, TE, SXT chiếm 8,51%; kiểu hình thứ hai AMP, C, NA, GM, STR, TE, SXT chiếm 6,38%, sau kiểu hình STR, TE 5,32% Kiểu hình đa kháng với nhiều nhóm kháng sinh AMP, CAZ, C, NA, CIP, OFX, GM, STR, TE, SXT AMP, C, NA, CIP, OFX, GM, STR, TE, SXT chiếm 3,19% Điều cho thấy xu gia tăng tính đa kháng Salmonella 3.3 Kết xác định serovar Salmonella đa kháng Định danh 07 serovar khác Serovar S Kentucky (8 chủng); S Infantis (4 chủng); S Agona S Potsdam (2 chủng); S Saintpaul, S Braenderup, S Indiana (01 chủng); OMF:1,z6:UTa 7:1,z6:UTa (01 chủng) 10 3.4 Mức độ kháng loại kháng sinh serovar theo nguồn phân lập Các serovar từ mẫu cá có số lượng đa kháng cao 61,90% Tiếp theo chủng từ thịt gà 23,81%, thịt heo 9,52%, thịt bò 4,76% (Bảng 3.9) Bảng 3.9 Số lượng serovar đa kháng kháng sinh theo nguồn phân lập Serovar Kentucky Indiana Infantis Agona Saintpaul Braenderup Potsdam OMF:1,z6:UT 7:1,z6:UT Tổng (n=21) Thịt heo (n=2) Thịt bò (n=1) Thịt gà (n=5) Cá (n=13) Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%) 01 01 2/21 50,0 50,0 9,52 01 1/21 100,0 4,76 02 01 01 01 5/21 40,0 20,0 20,0 20,0 23,81 05 02 01 01 01 01 01 01 13/21 38,46 15,38 7,69 7,69 7,69 7,69 7,69 7,69 61,90 100% serovar kháng STR TE Kháng sinh có tỷ lệ serovar kháng AMC 9,52% (2/21), CAZ 23,81% (5/21) Các serovar S Indiana, S Infantis, S Saintpaul, S Braenderup có tỷ lệ nhạy với AMC 100,0%, S Agona 50,0%, S Kentucky 5,26% Riêng S Kentucky có ký hiệu 07/20 1066; 07/20 1067 12/19 1600 có số lượng kháng sinh kháng cao (10 loại) 3.5 Sự diện nhóm integron Salmonella Integron nhóm 1, phát 100%, 52,38% 100% Tỷ lệ phát serovar Salmonella mang lúc ba nhóm integron 52,38% Các integron nhóm diện với 11 serovar Salmonella có kiểu hình kháng kháng sinh nhóm βlactam, aminoglycoside, tetracycline sulfonamide Trong đó, đáng quan tâm có ba serovar khơng cịn khả nhạy với kháng sinh ceftazidime Kentucky (03), Indiana (01) Agona (01) 3.6 Đặc điểm vùng gen cassette Salmonella dương tính với integron nhóm 1, Vùng gen cassette khuếch đại 18/21 (85,71%) serovar Salmonella dương tính với integron nhóm với 08 kích thước khác (> 1,0 kbp; 1,0 kbp; 0,9 kbp; 0,6 kbp; 0,5 kbp; 0,4 kbp; 0,25 kbp; 0,2 kbp) Tất serovar có chứa vùng gen cassette thuộc integron nhóm 100% mang gen tet; 94,44% mang gen gyrA,B/parC,E; 88,89% mang gen sul1,2; 61,11% mang gen blaTEM/CTX; 44,44% mang gen strA; 16,67% mang gen dhfr, 5,56% mang gen cmlA Tỷ lệ serovar dương tính với integron nhóm mang vùng gen cassette 72,73% với 05 kích thước khác (2,0 kbp; 1,6 kbp; 1,0 kbp; 0,7 kbp; 0,5 kbp) Vùng gen cassette xếp phổ biến integron nhóm (gyrA,B/parC,E-tetAsul1,2); (aad2-dhfr) Khả kháng NA, AMP, C, OFX, CIP, SXT TE có liên quan đến vùng gen cassette chèn vào integron nhóm 1, 3.7 Đặc điểm plasmid vi khuẩn Salmonella 100% serovar mang plasmid Serovar Kentucky với số lượng 08 plasmid, Potsdam 07 plasmid; Infantis, Saintpaul, Braenderup, Agona 7:1,z6:UT 05 plasmid, mang 04 plasmid serovar OMF:1,z6:UT Indiana (Bảng 3.10) 12 Bảng 3.10 Tỷ lệ mang plasmid serovar Salmonella Serovar (n=21) S Kentucky S Potsdam S Agona S Braenderup S Saintpaul S Infantis 7:1,z6:UT S Indiana OMF:1,z6:UT Số lượng 08 07 06 05 05 05 05 04 04 Loại plasmid (n=18) N-FIB-W-Y-A/C-T- K/B-B/O N-FIB-W-Y-P-A/C-Frepb N-W-Y-P-A/C-T N-W-Y-P-T N-W-Y-P-T N-W-Y-P-T N-W-Y-P-T N-W-Y-T N-W-Y-T Tỷ lệ (%) 44,44 38,89 33,33 27,78 27,78 27,78 27,78 22,22 22,22 Trong nghiên cứu phát plasmid IncA/C diện S Agona (01), S Kentucky (03) S Potsdam (02) mang gen blaTEM-strA-tetA-sul2 phổ biến Plasmid N, W, P, Y diện với tỷ lệ cao 21 serovar Salmonella đa kháng từ thực phẩm chủ yếu mang gen blaTEM-tetA,D,EgyrA,B-parC,E-sul1 (Bảng 3.11) Bảng 3.11 Tỷ lệ phát loại plasmid serovar Salmonella Loại plasmid Số lượng Tỷ lệ (%) N 18 85,71 FIB 02 9,52 W 21 100 Serovar (n=21) S Agona (01); S Braenderup (01); S Indiana (01); S Infantis (03); S Kentucky (07); S Potsdam (02); S Saintpaul (01); OMF:1,z6:Ut (01); 7:1,z6:UT (01) S Kentucky (01); S Potsdam (01) S Agona (02); S Braenderup (01); S Indiana (01); S Infantis (04); S Kentucky (08); S Potsdam (02); S Saintpaul (01); OMF:1,z6:Ut (01); 7:1,z6:UT (01) 13 Y 21 100 P 38,10 A/C 06 28,57 T 14 66,67 Frepb K/B B/O HI1-HI2-I1-XL/M-FIIAFIC-FIA 01 01 01 4,76 4,76 4,76 S Agona (02); S Braenderup (01); S Indiana (01); S Infantis (04); S Kentucky (08); S Potsdam (02); S Saintpaul (01); OMF:1,z6:Ut (01); 7:1,z6:UT (01) S Agona (01); S Braenderup (01); S Infantis (03); S Potsdam (01); S Saintpaul (01); 7:1,z6:UT (01) S Agona (01); S Kentucky (03); S Potsdam (02) S Agona (01); S Braenderup (01); S Indiana (01); S Infantis (03); S Kentucky (06); S Saintpaul (01); OMF:1,z6:Ut (01) S Potsdam (01) S Kentucky (01) S Kentucky (01) 0 - 3.8 Sự diện gen mã hóa sinh ESBL Gen blaTEM chiếm tỷ lệ cao 52,38%, gen blaCTX 19,05%, gen blaSHV không phát tất 21 serovar Serovar Kentucky có kiểu hình kháng ceftazidime mang gen blaTEM, blaCTX Ngồi ra, chủng SA11/19 4221 mang lúc hai gen blaTEM/CTX 3.9 Sự diện gen kháng nhóm tetracyline Trong số gen tet phát gen tetA chiếm tỷ lệ cao 95,24%; gen tetD tetE 85,71%; gen tetC 57,14%; gen tetB 4,76% Đặc biệt, 12 serovar mang gen tetA,B,D,C (57,14%), 05 chủng mang gen tetA,D,C (23,81%) 3.10 Sự diện gen kháng nhóm phenicol Phát 02 serovar mang gen cmlA (9,52%), 01 serovar mang gen cmlB (4,76%) Gen cmlA diện serovar có 14 kiểu hình kháng C Khơng có serovar mang gen flo, gen cat1,2,3 tất serovar nghiên cứu 3.11 Sự diện gen kháng nhóm sulfonamide 05 chủng mang hai gen (sul1, sul2) lúc tỷ lệ 23,81% Đối với gen sul1 diện 13/21 chủng (61,90%), sul2 52,38% (11/21) Serovar mang nhiều gen sul1, sul2 Kentucky với 38,46%, 45,45% Trong nghiên cứu này, phát biểu gen sul Trong đó, sul1 gen kháng kháng sinh phổ biến mẫu nghiên cứu 3.12 Sự diện gen kháng nhóm aminoglycoside Sự phù hợp kiểu gen kiểu hình hai kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside STR GN mẫu nghiên cứu hoàn toàn khác STR có tỷ lệ Salmonella kháng 100%, nhiên tỷ lệ phát gen strA, aadA2, aadB 52,38%, 57,14%, 4,76% Điều có thể giải thích gen kháng kháng sinh biểu mức độ chưa đủ 3.13 Sự diện gen kháng nhóm quinolon Tỷ lệ phát gen kháng kháng sinh thuộc nhóm quinolon cao với 100% gen gyrA, gyrB, parC 95,24% gen parE 3.14 Phân tích mối quan hệ nhóm gen kháng kháng sinh với chế đa kháng serovar Để phân tích nhóm gen kháng, yếu tố di truyền di động liên quan đến chế đa kháng serovar Salmonella, lựa chọn 04 chủng serovar, kháng nhiều kháng sinh theo nguồn phân lập để thực giải trình tự toàn hệ gen, gồm 15 S Kentucky SA11/19 3497, SA12/19 1600, SA07/20 1066, SA07/20 1067 3.14.1 Phân tích nhóm gen liên quan yếu tố di truyền di động Phát integron bốn serovar chủ yếu nhóm (IntI1) Chúng xác định contigs vị trí 17 SA12/19 3497; contigs vị trí 20, 39, 40 SA12/19 1600; contigs vị trí 19, 37, 38 SA07/20 1066 1067 Integron contig 17, 19, 20 chứa gen tet, aadA, sul1 có vai trị kháng kháng sinh nhóm tetracyline, aminoglycoside sulfonamide Integron contigs 37 39 mang hai gen lnuF/lnuG aadA mã hóa nucleotidyltransferase kháng kháng sinh nhóm lincosamide aminoglycoside Integron contigs 38 40 mang gen dhfr mã hóa dihydrofolate reductase kháng trimethoprim, gen cmlA kháng C, gen arr mã hóa ADP ribosyl transferase kháng rifampin Cấu trúc integron bốn serovar cho thấy chúng mang đồng thời nhiều gen kháng, điều hồn tồn phù hợp với kiểu hình đa kháng xác định Bên cạnh đó, cịn ghi nhận tính đa kháng bốn serovar có liên quan đến yếu tố chuyển vị Tn21 mã hóa Urf2 chưa có nghiên cứu cho biết hay mơ tả chi tiết chức hoạt động chúng 3.14.2 Phân tích nhóm gen kháng kháng sinh chủng Salmonella Tổng số có 44 kiểu hình kháng từ kết kháng sinh đồ, 38 kiểu hình có biểu gen kháng, 06 kiểu hình nhạy có biểu gen kháng Sự phù hợp kiểu gen kiểu hình 86,36% khơng phù hợp 13,64% (Bảng 3.12) Ví dụ, chủng SA11/19 3497 có diện gen sul1, sul2, folA, dhfr14 kiểu hình lại nhạy với SXT Tiếp theo GN có kiểu hình 16 nhạy lại mang gen (aac(6')-Iaa, aac6-Iaa, aph(6)-Id, aph(3'')-Ib) Vấn đề này, tượng ức chế gen sau phiên mã nên gen kháng rơi vào trạng thái câm lặng Kết nghiên cứu cung cấp thêm thông tin để nhà khoa học hiểu rõ chất chế nhằm ứng dụng kỹ thuật câm gen vào việc xác định chức kháng kháng sinh gen di truyền sinh vật 3.14.3 Các gen liên quan đến kháng nhóm β-lactam Kháng nhóm β-lactam phát chủ yếu blaTEM-1 blaCTX-M-55 Riêng blaTEM-1 phát SA11/19 3497, blaCTX-M-55 diện ba serovar SA12/19 1600, SA07/20 1066, SA07/20 1067 Cả bốn serovar nghiên cứu kháng AMP biểu gen kháng Dữ liệu giải trình tự, cho thấy ba serovar SA12/19 1600, SA07/20 1066, SA07/20 1067 có diện gen blaCTX-M-55 đồng nghĩa với kiểu hình kháng CAZ Kết giải trình tự cịn phát đột biến vị trí codon 90 (Asp90Gly) gen blaTEM chủng SA11/19 3497 Ba chủng lại SA07/20 1066, SA07/20 1067 SA12/19 1600 đột biến xuất vị trí codon 80 có thay Ala thành Val (Ala80Val) Điều cho thấy khả kháng nhóm βlactam chủng nghiên cứu có tham gia nhiều chế 3.14.4 Các gen liên quan đến kháng nhóm phenicol Trong nghiên cứu xét kiểu hình bốn serovar kháng với C, kết PCR phát gen cmlA SA07/20 1066 Tuy nhiên, gen cmlA floR biểu serovar nghiên cứu kỹ thuật giải trình tự hệ gen (SA11/19 3497 phát gen floR), điều hồn tồn phù hợp với kiểu 17 hình kháng khảo sát chứng tỏ chúng có vai trị việc kháng kháng sinh nhóm phenicol 3.14.5 Các gen liên quan đến kháng nhóm quinolon 100% serovar phát gen phổ biến gyrA, gyrB, parC parE Qua liệu giải trình tự, phát có đột biến gyrA parC serovar Cụ thể, đột biến gyrA codon 83 (Ser83Phe) codon 87 (Asp87Asn) Đối với parC phát đột biến codon 57, 80, 395, 469 620 thay Thr57Ser, Ser80Ile, Ser395Asn, Ala469Ser, Thr620Ala Đối với gyrA đột biến thường xảy hai vị trí 83 87, nhiên loại axit amin thay serovar đa dạng Đối với parC số điểm đột biến nhiều so với cơng trình cơng bố 3.14.6 Các gen liên quan đến kháng nhóm aminoglycoside Xác định hai nhóm gen kháng gen aac (aac(3)I; aac(3)-Id; aac(6')-Iaa; aac(6')-Ic,f,g,h,j,k,l,r-z) aph (aph(3'')-I; aph(3'')-Ib; aph(6)-Id; aph(6)-Ic/aph(6)-Id; aph(3'')Ib) Tất serovar có kiểu hình kháng STR diện gen kháng aadA7 thuộc họ aadA, chứng tỏ gen có vai trị kháng STR GN serovar nghiên cứu Dữ liệu giải trình tự cịn phát gen acrD mã hóa cho hệ thống bơm ngược AcrAD-TolC (loại RND) tất serovar Riêng SA11/19 3497 phát gen kdpE biểu không liên quan đến vai trị kháng GN SA11/19 3497 nhạy với GN 3.14.7 Các gen liên quan đến kháng nhóm tetracycline Hai gen kháng TE phát bốn serovar nghiên cứu, gen tetA tetC Ngồi gen mã hóa kênh bơm ngược thải kháng sinh, luận án phát gen tetR SA07/20 1066 SA07/20 1067 Như chứng tỏ SA11/19 3497 18 SA12/19 1600 tồn chế kháng TE SA07/20 1066 SA07/20 1067 tồn hai chế kháng TE 3.14.8 Các gen liên quan đến kháng nhóm sulfonamide/ trimethoprim Các gen kháng mã hóa kháng SXT phổ biến nghiên cứu sul1, sul2, folA dhfr14 biểu bốn serovar có kiểu hình kháng SXT Nhiều gen kháng nhóm tìm thấy gen dhfr Những gen có vị trí gần với sul1 sul3 integron, nằm plasmid, nằm đảo gây bệnh hệ gen Salmonella Điều chứng minh vị trí integron contig 20 có chứa gen sul1 có vai trị kháng kháng sinh nhóm sulfonamide contigs 38 40 mang gen dhfr mã hóa dihydrofolate reductase kháng trimethoprim 19 Bảng 3.12 Số lượng gen kiểu hình kháng kháng sinh chủng Salmonella Nhóm Kháng sinh AMC β-lactam AMP CAZ Phenicol C NA Quinolone CIP OFX Aminoglycoside GM Ký hiệu (Kiểu hình/nhóm gen kháng kháng sinh) SA12/19 1600 SA07/20 1066 (S) blaCTX-M-55 (S) blaCTX-M-55 blaCTX-M family blaCTX-M family (R) blaCTX-M-55 (R) blaCTX-M-55 blaCTX-M family blaCTX-M family (R) blaCTX-M-55 (R) blaCTX-M-55 blaCTX-M family blaCTX-M family (R) cmlA family; (R) cmlA family; (R) floR family floR family floR family (R) gyrA; gyrB; (R) gyrA; gyrB; (R) gyrA; gyrB; parC; parC; parE; parC; parE; parE mdtK/norM (MATE mdtK/norM (MATE family) family) (R) gyrA, gyrB, (R) gyrA, gyrB, (R) gyrA, gyrB, parC, parC, parE; parC, parE; parE mdtK/norM (MATE mdtK/norM (MATE family) family) (R) gyrA, gyrB, (R) gyrA, gyrB, (R) gyrA, gyrB, parC, parC, parE; parC, parE; parE mdtK/norM (MATE mdtK/norM (MATE family) family) (S) aac(3)-I; aac(3)-Id; (R) aac(3)-I; (R) aac(3)-I; aac(6')-Iaa; aac(6')aac(3)-Id; ac(3)aac(3)-Id; aac(3)Ic,f,g,h,j,k,l,r-z; IIa; aac(3)IIa; AAC(3)aph(3'')-I; aph(3'')-Ib; II,III,IV,VI,VIII,IX,X II,III,IV,VI,VIII,IX,X SA11/19 3497 (R) blaTEM-1 blaTEM family (R) blaTEM-1 blaTEM family (S) blaTEM-1 blaTEM family 20 SA07/20 1067 (S) blaCTX-M-55 blaCTX-M family (R) blaCTX-M-55 blaCTX-M family (R) blaCTX-M-55 blaCTX-M family (R) cmlA family; floR family (R) gyrA; gyrB; parC; parE; mdtK/norM (MATE family) (R) gyrA, gyrB, parC, parE; mdtK/norM (MATE family) (R) gyrA, gyrB, parC, parE; mdtK/norM (MATE family) (R) aac(3)-I; aac(3)-Id; aac(3)IIa; aac(3)II,III,IV,VI,VIII,IX,X aph(6)-Id; aph(6)Ic/aph(6)-Id; aph(3'')Ib; aadA7 (aadA family); kdpE; acrD (AcrAD-TolC) (RND type) STR Tetracycline Sulfonamide/ trimethoprim Khác TE SXT ; aac(6')-Iaa; ; aac(6')-Iaa; ; aac(6')-Iaa; aac(6')aac(6')aac(6')Ic,f,g,h,j,k,l,r-z; Ic,f,g,h,j,k,l,r-z; Ic,f,g,h,j,k,l,r-z; aph(3')-I; aph(3'')-I; aph(3')-I; aph(3')aph(3')-I; aph(3')aph(3'')-Ia; aadA7 Ia; aadA7 (aadA Ia; aadA7 (aadA (aadA family); acrD family); acrD family); acrD (AcrAD-TolC) (AcrAD-TolC) (AcrAD-TolC) (RND type) (RND type) (RND type) (R) aac(3)-I; (R) aac(3)-I; (R) aac(3)-I; (R) aac(3)-I; aac(3)-Id; aac(3)-Id; ac(3)aac(3)-Id; aac(3)aac(3)-Id; aac(3)aac(6')-Iaa; aac(6')IIa; aac(3)IIa; AAC(3)IIa; aac(3)Ic,f,g,h,j,k,l,r-z; II,III,IV,VI,VIII,IX,X II,III,IV,VI,VIII,IX,X II,III,IV,VI,VIII,IX,X aph(3'')-I; aph(3'')-Ib; ; aac(6')-Iaa; ; aac(6')-Iaa; ; aac(6')-Iaa; aph(6)-Id; aph(6)aac(6')aac(6')aac(6')Ic/aph(6)-Id; aph(3'')Ic,f,g,h,j,k,l,r-z; Ic,f,g,h,j,k,l,r-z; Ic,f,g,h,j,k,l,r-z; Ib; aadA7 (aadA aph(3')-I; aph(3'')-I; aph(3')-I; aph(3')aph(3')-I; aph(3')family); kdpE; acrD aph(3'')-Ia; aadA7 Ia; aadA7 (aadA Ia; aadA7 (aadA (AcrAD-TolC (RND (aadA family); acrD family); acrD family); acrD type) (AcrAD-TolC) (AcrAD-TolC) (AcrAD-TolC) (RND type) (RND type) (RND type) (R) tetC, tetA (R) tetC, tetA (R) tetC, tetA, tetR (R) tetC, tetA, tetR (S) sul1, sul2, folA, (R) sul1, sul2, folA, (R) sul1, sul2, folA, (R) sul1, sul2, folA, dhfr14 dhfrA14 dhfrA14 dhfrA14 mph(A) family; mrx; arr-2; uhpT; glpT; lnu(F)/lnu(G); linG; pmrF; bacA; SugE, BcrC, MarB; MarR; MarA; QacE 21 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Tỷ lệ nhiễm Salmonella 16,84% Các chủng Salmonella phân lập có khả kháng cao với TE, AMP, STR, C SXT (34,67%-52,00%) Ngược lại, 96,00% số chủng nhạy với CAZ Định danh 07 serovar đa kháng, S Kentucky (8 chủng); S Infantis (4 chủng); S Agona S Potsdam (2 chủng); S Saintpaul, S Braenderup, S Indiana (01 chủng); OMF:1,z6:UT 7:1,z6:UT (01 chủng) Phát 100% serovar Salmonella đa kháng mang integron 1, 3; integron 52,38% Integron chứa 08 vùng gen cassette (85,71%); integron chứa 05 vùng gen cassette (72,73%) Phát 100% serovar mang plasmid S Kentucky (08), S Potsdam (07), S Infantis, S Saintpaul, S Braenderup, S Agona, 7:1,z6:UT (05), OMF:1,z6:UT, S Indiana (04) Xác định đột biến vị trí codon 90 (Asp90Gly) gen blaTEM; codon 80 (Ala80Val) gen blaCT; codon 83 87 (Ser83Phe; Asp87Asn) gen gyrA; codon 57, 80, 395, 469 620 (Thr57Ser; Ser80Ile; Ser395Asn; Ala469Ser; Thr620Ala) gen parC Ghi nhận tính đa kháng Salmonella enterica sups serovar Kentucky có liên quan đến yếu tố di truyền chuyển vị Tn21 mã hóa Urf2 ĐỀ NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu chuyên sâu vai trò đột biến gen đến khả kháng kháng sinh nhóm tetracycline, aminoglycoside quinolone 22 ... HCM  TRƯƠNG HUỲNH ANH VŨ NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ CỦA SALMONELLA SPP PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Chun ngành: Cơng nghệ Sinh học Mã số: 9.42.02.01... spp phân lập từ nhóm thực phẩm khác chợ bán lẻ địa bàn thành phố Hồ Chí Minh Nghiên cứu đặc điểm phân tử liên quan đến chế kháng kháng sinh Salmonella spp phân lập từ thực phẩm Xác định phân. .. kháng kháng sinh mức độ phân tử Salmonella spp phân lập từ thực phẩm thành phố Hồ Chí Minh? ?? thực với hai mục tiêu cụ thể sau: Khảo sát tỷ lệ nhiễm, xác định mức độ nhạy với kháng sinh Salmonella