Nghiên Cứu Tính Kháng Kháng Sinh Ở Mức Độ Phân Tử Của Salmonella Spp. Phân Lập Từ Thực Phẩm Tại Thành Phố Hồ Chí Minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM TRƢƠNG HUỲNH ANH VŨ NGHI N CỨU T NH HÁNG HÁNG SINH Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ CỦA SALMONELLA SPP PHÂN L P TỪ TH C PHẨM TẠI THÀNH PH H CH MINH Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số ngành: 9.42.02.01 LU N ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM TRƢƠNG HUỲNH ANH VŨ NGHI N CỨU T NH HÁNG HÁNG SINH Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ CỦA SALMONELLA SPP PHÂN L P TỪ TH C PHẨM TẠI THÀNH PH H CH MINH Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9.42.02.01 LU N ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN HỒNG Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2022 HU TÚ i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án “Nghiên c u t nh kháng kháng sinh m c đ ph n tử Salmonella spp ph n lập t th c ph m t i thành phố H Ch Minh” công trình tơi th c với s hướng dẫn PGS TS Nguyễn Hoàng Khuê Tú Các số liệu kết trình bày luận án trung th c chưa t ng người khác cơng bố cơng trình khác TÁC GIẢ LU N ÁN TRƢƠNG HUỲNH ANH VŨ ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, trước tiên tơi xin ch n thành bày tỏ lịng biết ơn s u sắc đến Cơ PGS TS Nguyễn Hồng Kh Tú dành nhiều thời gian, công s c tận tình hướng dẫn, truyền đ t kiến th c, kinh nghiệm quý báu suốt thời gian th c luận án Tôi xin ch n thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đ i học Nông L m TP HCM; quý Thầy/Cô Khoa Khoa học Sinh học; Phòng Đào t o Sau đ i học nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn th c thủ tục theo quy chế đào t o nghiên c u sinh để tơi hồn thành chương trình học tập tiến đ Tôi xin ch n thành cảm ơn Ban Giám đốc Sở Khoa học Công nghệ; Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ TP HCM; Ban Giám đốc tồn thể Anh/Chị/Em Phịng Vi sinh; Phòng Hành ch nh Quản trị, Trung t m Dịch vụ Ph n t ch Th nghiệm TP HCM ủng h hỗ trợ kinh ph , trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất,…để th c nghiên c u Tôi xin cảm ơn Ban Giám đốc Trung t m Kiểm nghiệm Vệ sinh An toàn Th c ph m Khu v c ph a Nam, Viện Y tế Công c ng TP HCM; quý Thầy/Cô b n sinh viên Viện Công nghệ Sinh học Th c ph m, Đ i học Công nghiệp TP HCM đ ng viên, giúp đỡ chia kinh nghiệm trình th c luận án Cuối cùng, s thành công luận án khơng thể khơng kể đến s đóng góp khơng nhỏ thành viên gia đình, người ln ủng h , đ ng viên giúp vượt qua nhiều khó khăn, trở ng i suốt thời gian học tập Ch n thành cám ơn / iii TÓM TẮT Luận án “Nghiên c u t nh kháng kháng sinh m c đ ph n tử Salmonella spp ph n lập t th c ph m t i thành phố H Ch Minh” th c t i Trung t m Dịch vụ Ph n t ch Th nghiệm thành phố H Ch Minh Tỷ lệ nhiễm Salmonella spp nhóm th c ph m thu thập t i chợ bán l địa bàn thành phố H Ch Minh t 9/ đến 9/ 6,84% (256/1.520) Nhóm mẫu thịt có tỷ lệ nhiễm cao nhất, nhóm mẫu thủy hải sản cuối nhóm mẫu rau củ có tỷ lệ , 6% , 6% / 64/ , ,9 % / , Chưa ghi nhận trường hợp thu c nhóm mẫu tr ng có nhiễm Salmonella Các kháng sinh TE, AMP, STR, C SXT có tỷ lệ Salmonella spp kháng t 34,67% đến 52,00% Ngược l i, 96, % nh y với CAZ T chủng Salmonella spp có kiểu hình đa kháng định danh serovar, phổ biến S Kentucky chủng ; S Infantis chủng ; S Agona S Potsdam Saintpaul, S Braenderup S Indiana chủng Các integron nhóm , serovar Salmonella đa kháng phát / % / chủng ; S % / , , 8% Tỷ lệ Salmonella mang lúc ba nhóm integron 52,38% (11/21) Kết khảo sát vùng gen cassette dương t nh với integron nhóm chiếm ,7 %; nhóm ,7 % Kết khảo sát phát % serovar mang plasmid không tương hợp Serovar mang nhiều plasmid Kentucky (08 plasmid); Potsdam (07 plasmid); Infantis, Saintpaul, Braenderup, Agona 7:1,z6:UT (05 plasmid); Indiana OMF:1,z6:UT (04 plasmid) Gen mã hóa sinh ESBL phát blaTEM chiếm tỷ lệ cao codon 90 (Asp90Gly) chủng SA biến t i vị tr codon , 8%, đ t biến t i vị tr / 497 Gen blaCTX có tỷ lệ 19,05%, đ t Ala80Val) chủng SA 7/ 66, SA 7/ 67 SA12/19 1600 Gen kháng nhóm quinolon, đ t biến phát gen gyrA Ser8 Phe; Asp87Asn parC (Thr57Ser; Ser80Ile; Ser395Asn; Ala469Ser; Thr620Ala) Ngồi ra, chúng tơi cịn ghi nhận t nh đa kháng Salmonella enterica sups serovar Kentucky có liên quan đến yếu tố di truyền chuyển vị Tn21 iv mã hóa Urf chưa có cơng bố mơ tả chi tiết ch c ho t đ ng chúng v SUMMARY The thesis “Research on molecular characteristics of antibiotic resistance in Salmonella spp isolated from food in Ho Chi Minh City” was performed at the Center of Analytical Service and Experimentation Ho Chi Minh City The results showed that the contaminated rate of Salmonella spp was 16.84% (256/1,520) Meat samples had the highest contamination rate, followed by the seafood samples and finally fruit and vegetable samples which were 43.16% (164/380), 23.95% (91/380), 0.26% (01/380), respectively There was no Salmonella detected in the egg samples Testing the antibiotic sensitivity of 150 isolated Salmonella strains showed that of the resistantt rates to AMP, STR, C, and SXT were from 34.67% to 52.00% In contrast, Salmonella spp were highly susceptible to CAZ (96.00%) There were 07 serovar phenotypes determined from 21 strains of multidrug-resistant Salmonella spp in which the most common ones were S Kentucky (8 strains); S Infantis (4 strains); S Agona and S Potsdam (2 strains); S Saintpaul, S Braenderup, and S Indiana (01 strain) Specifically, all integrons (I, II, and III) were found in multidrug-resistant Salmonella serovars isolated from food groups at 100% (21/21), 52.38% (11/21), and 100% (21/21), respectively The rate of Salmonella carrying all three integron groups was 52.38% (11/21) The assessment of the gene cassette region of integron I was accounted for 85.71%; group was 72.73% We found that 100% of serovars carried plasmids incompatibility Serovar carrying the most plasmids was Kentucky (8 plasmids); Potsdam (7 plasmids); Infantis, Saintpaul, Braenderup, Agona and 7:1,z6:UT (5 plasmids); Indiana and OMF:1,z6:the UT (4 plasmids) In the detection of ESBL encoding genes, the blaTEM gene accounted for the highest rate of 52.38%, mutations at codon position 90 (Asp90Gly) on strain SA11/19 3497 The blaCTX gene had the rate of 19.05%, mutations varying at codon position 80 (Ala80Val) on strains SA07/20 1066, SA07/20 1067 and SA12/19 1600 The resistance genes against the quinolone group, mutations were detected in the gyrA (Ser83Phe; Asp87Asn) and parC (Thr57Ser; Ser80Ile; Ser395Asn; Ala469Ser; Thr620Ala) genes Interestingly, we vi noted the multi-resistance of Salmonella enterica sups Kentucky serovars which were related to the translocation genetic factor Tn21 encoding Urf2 that was not studied or described the function in detail vii Ý HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Ala AMC AMP Asn Asp AX AZM C CAZ CRO CS CI CIP CLSI CTX DNA ECDC EFSA ENR ESBL FX GI Gly GM Ile IS200 K kbp MLST MIC Tiếng Anh Alanine Amoxicillin/Clavunic acid Ampicillin Asparagine Aspartic acid Amoxicillin Azithromycin Chloramphenicol Ceftazidime Ceftriaxone Conserved segment Confidence Interval Ciprofloxacin Clinical and Laboratory Standards Institute Cefotaxime Deoxyribonucleic Acid European Centre for Disease Prevention and Control European Food Safety Authority Enrofloxacin Extended Spectrum Betalactamase Furazolidone Genomic island Glycine Gentamycin Isoleucine Specific insertion sequence Kanamycin Kilobase pairs Multi Locus Sequence Typing Minimal Inhibited Concentration Tiếng Việt Kháng sinh Amoxicillin/Clavunic acid Kháng sinh Ampicillin Kháng sinh Amoxicillin Kháng sinh Azithromycin Kháng sinh Chloramphenicol Kháng sinh Ceftazidime Kháng sinh Ceftriaxone Vùng bảo t n Khoảng tin cậy Kháng sinh Ciprofloxacin Viện tiêu chu n l m sàng xét nghiệm Kháng sinh Cefotaxime Trung t m Phòng chống Dịch bệnh ch u Âu Cơ quan An toàn Th c ph m ch u Âu Kháng sinh Enrofloxacin Beta lactamase phổ r ng Kháng sinh Furazolidone Kháng sinh Gentamycin Kháng sinh Kanamycin Cặp bazơ Giải trình t nhiều locus N ng đ c chế tối thiểu viii m-PCR NA RA RNA RNAi Ser SMZ SPI SPT STR Multiplex-PCR Nalidixic acid National Antimicrobial Resistance Monitoring System Norfloxacin Non-typhoidal Salmonella Ofloxacin Open reading frame Penicillin Polymerase Chain Reaction Phenylalanine Plasmid Mediated Quinone Resistance Parts Per Million Quaternary ammonium compounds Rifampin Ribonucleic Acid RNA interference Serine Sulphamethoxazole Salmonella Pathogenicity Islands Spectinomycin Streptomycin SXT Sulfamethoxazole/Trimethoprim NARMS NOR NTS OFX orf P PCR Phe PMQR ppm qac s-PCR T TE Thr TMP TOB Val WGS WHO Simplex-PCR Oxytetracycline Tetracycline Threonine Trimethoprim Tobramycin Valine Whole genome sequencing World Health Organization PCR đa m i Kháng sinh Nalidixic acid Hệ thống giám sát kháng khu n quốc gia Hoa Kỳ Kháng sinh Norfloxacin Salmonella không g y sốt thương hàn Kháng sinh Ofloxacin Khung đọc mở Kháng sinh Penicillin Phản ng chuỗi polymerase Gen kháng quinolone nằm plasmid Phần triệu Hợp chất amoni bậc Kháng sinh Rifampin S can thiệp RNA Kháng sinh Sulphamethoxazole Đảo g y bệnh Salmonella Kháng sinh Spectinomycin Kháng sinh Streptomycin Kháng sinh Sulfamethoxazole/Trimethoprim PCR đơn m i Kháng sinh Oxytetracycline Kháng sinh Tetracycline Kháng sinh Trimethoprim Kháng sinh Tobramycin Giải trình t b gen Tổ ch c y tế giới ix MỤC LỤC TRANG LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii SUMMARY -v Ý HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT - vii MỤC LỤC ix DANH MỤC CÁC BẢNG - xiii MỞ ĐẦU -1 Ý nghĩa khoa học Ý nghĩa th c tiễn -2 Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tình hình th c ph m nhiễm Salmonella spp giới -4 1.2 Tình hình th c ph m nhiễm Salmonella spp t i Việt Nam 1.3 Th c tr ng sử dụng t n dư kháng sinh -6 1.4 Tình hình kháng kháng sinh Salmonella spp giới 1.5 Tình hình kháng kháng sinh Salmonella spp t i Việt Nam -8 1.6 Đặc điểm sinh học Salmonella spp - 10 1.6.1 Đặc điểm hình thái - 10 1.6.2 Đặc t nh nuôi cấy - 10 1.6.3 Đặc t nh sinh hóa - 10 1.6.4 Ph n lo i - 11 1.6.5 Hệ gen Salmonella spp. - 12 1.7 Cơ chế kháng aminoglycoside Salmonella spp - 14 1.8 Cơ chế kháng β-lactam Salmonella spp - 15 1.9 Cơ chế kháng phenicol Salmonella spp 16 1.10 Cơ chế kháng quinolone Salmonella spp 16 1.11 Cơ chế kháng tetracycline Salmonella spp 17 1.12 Cơ chế kháng sulfonamide/trimethoprim Salmonella spp - 17 x 1.13 Tình hình nghiên c u gen kháng kháng sinh Salmonella spp - 18 1.14 Yếu tố di truyền di đ ng - 20 1.14.1 Plasmid - 20 1.14.2 Integron 21 1.14.2.1 Integron nhóm 23 1.14.2.2 Integron nhóm 23 1.14.2.3 Integron nhóm , - 23 1.14.3 Gen cassette - 24 Chƣơng PHƢƠNG PHÁP NGHI N CỨU - 25 2.1 Vật liệu - 25 2.1.1 Nguyên liệu - 25 2.1.2 Mơi trường ni cấy, hóa chất, thuốc thử dùng ph n lập Salmonella spp - 26 2.1.3 Môi trường dùng khảo sát t nh nh y với kháng sinh Salmonella spp - 26 2.1.4 Hóa chất sinh học ph n tử - 26 2.1.5 Chủng chu n vi sinh vật dùng làm kiểm soát 27 2.1.6 Thiết bị - 27 2.2 Phương pháp 28 2.2.1 Phương pháp xác định cỡ mẫu - 28 2.2.2 Phương pháp lấy bảo quản mẫu 28 2.3 Phương pháp ph n lập Salmonella spp - 28 2.3.1 Chu n bị mẫu thử huyền phù ban đầu - 29 2.3.2 Tăng sinh sơ b không chọn lọc - 29 2.3.3 Tăng sinh chọn lọc - 29 2.3.4 Ph n lập 29 2.3.5 Khẳng định 29 2.4 Phương pháp xác định serovar Salmonella spp - 30 2.5 Khảo sát t nh nh y với kháng sinh Salmonella spp 31 2.5.1 L a chọn kháng sinh thử nghiệm 31 2.5.2 Phương pháp xác định t nh nh y với kháng sinh Salmonella spp - 31 xi 2.6 Ly tr ch DNA Salmonella spp 32 2.7 Phương pháp phát Salmonella spp kỹ thuật PCR - 32 2.8 Phương pháp nghiên c u đặc điểm ph n tử liên quan đến s đa kháng Salmonella - 32 2.8.1 Khảo sát s diện plasmid không tương hợp chủng Salmonella 32 2.8.2 Khảo sát s diện nhóm integron vùng gen cassette 33 2.8.3 Khảo sát s diện gen kháng kháng sinh Salmonella spp 36 2.8.4 Thành phần quy trình nhiệt phản ng s-PCR - 36 2.8.5 Thành phần quy trình nhiệt phản ng m-PCR 37 2.8.6 Điện di đọc kết - 37 2.9 Giải trình t hệ 38 2.10 Phương pháp xử lý số liệu - 38 Chƣơng ẾT QUẢ VÀ THẢO LU N 42 3.1 Xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella spp nhóm th c ph m 42 3.2 Đặc điểm kháng kháng sinh chủng Salmonella spp - 47 3.2.1 Khả kháng kháng sinh chủng Salmonella spp - 47 3.2.2 Khả kháng t ng lo i kháng sinh chủng Salmonella spp - 50 3.2.3 Khả kháng t ng lo i kháng sinh chủng Salmonella spp theo ngu n ph n lập - 53 3.2.4 Kiểu hình kháng kháng sinh chủng Salmonella spp 55 3.3 Kết xác định serovar Salmonella spp đa kháng 57 3.4 M c đ kháng t ng lo i kháng sinh serovar theo ngu n ph n lập 59 3.5 S diện nhóm integron Salmonella - 60 3.6 Đặc điểm vùng gen cassette Salmonella dương t nh với integron , - 64 3.7 Đặc điểm plasmid Salmonella spp - 67 3.8 S diện gen mã hóa sinh ESBL - 71 3.9 S diện gen kháng nhóm tetracyline - 72 3.10 S diện gen kháng nhóm phenicol 75 3.11 S diện gen kháng nhóm quinolon - 75 xii 3.12 S diện gen kháng nhóm aminoglycoside - 79 3.13 S diện gen kháng nhóm sulfonamide - 81 3.14 Ph n t ch mối quan hệ nhóm gen kháng với chế đa kháng Salmonella 84 3.14.1 Đánh giá chất lượng giải trình t - 84 3.14.2 Lắp ráp de novo xác định ngu n gốc contigs - 84 3.14.3 Kết giải trình t nhiều locus MLST xác định serotype - 85 3.14.4 Ph n t ch nhóm gen kháng liên quan yếu tố di truyền di đ ng - 86 3.14.5 Ph n t ch nhóm gen kháng kháng sinh Salmonella - 87 3.14.5.1 Nhóm gen liên quan đến kháng nhóm β-lactam 92 3.14.5.2 Nhóm gen liên quan đến kháng nhóm phenicol 93 3.14.5.3 Nhóm gen liên quan đến kháng nhóm quinolon - 93 3.14.5.4 Nhóm gen liên quan đến kháng nhóm aminoglycoside - 95 3.14.5.5 Nhóm gen liên quan đến kháng nhóm tetracycline 96 3.14.5.6 Nhóm gen liên quan đến kháng nhóm sulfonamide/trimethoprim - 97 ẾT LU N VÀ ĐỀ NGHỊ - 98 TÀI LIỆU THAM HẢO -101 PHỤ LỤC -118 ... NGHI N CỨU T NH HÁNG HÁNG SINH Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ CỦA SALMONELLA SPP PHÂN L P TỪ TH C PHẨM TẠI THÀNH PH H CH MINH Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9.42.02.01 LU N ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH. .. NGUYỄN HỒNG Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2022 HU TÚ i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án ? ?Nghiên c u t nh kháng kháng sinh m c đ ph n tử Salmonella spp ph n lập t th c ph m t i thành phố H Ch Minh? ??... án ? ?Nghiên c u t nh kháng kháng sinh m c đ ph n tử Salmonella spp ph n lập t th c ph m t i thành phố H Ch Minh? ?? th c t i Trung t m Dịch vụ Ph n t ch Th nghiệm thành phố H Ch Minh Tỷ lệ nhiễm Salmonella