Nghiên cứu thu nhận hoạt chất kìm hãm α glucosidaza từ aspergillus oryzae và hướng ứng dụng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN ĐỨC TIẾN NGHIÊN CỨU THU NHẬN HOẠT CHẤT KÌM HÃM α- GLUCOSIDAZA TỪ Aspergillus oryzae VÀ HƯỚNG ỨNG DỤNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS HỒNG ĐÌNH HỊA PGS.TS QUẢN LÊ HÀ Hà Nội - 2015 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Nội dung Đối tượng phạm vi nghiên cứu Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học tính thực tiễn luận án Bố cục luận án Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) 1.1.1 Khái niệm bệnh đái tháo đường 1.1.2 Phương pháp điều trị bệnh ĐTĐ 1.2 Cơ sở khoa học việc sử dụng AGIs đến trình trao đổi đường thể 1.2.1 Enzyme α-glucosidase 1.2.1.1 Sơ lược enzyme 1.2.1.2 Giới thiệu enzyme α - glucosidase 1.2.2 Cơ sở khoa học sử dụng AGIs để điều trị bệnh ĐTĐ 1.3 Chất kìm hãm α-glucosidase (alpha-Glucosidase inhibitor) (AGIs) 10 1.3.1 Các AGIs từ tổng hợp 11 1.3.2 Chất kìm hãm α-glucosidase từ động vật 11 1.3.3 Chất kìm hãm α-glucosidase từ thực vật 11 1.3.4 Chất kìm hãm α-glucosidase từ vi sinh vật 13 1.3.5 Chất kìm hãm α-glucosidase từ A oryzae 14 1.4 Đỗ đen sản phẩm lên men từ đậu đỗ 15 1.4.1 Đỗ đen 15 1.4.2 Sản phẩm đậu đỗ lên men rắn 16 1.5 Aspergillus oryzae lên men rắn 18 1.5.1 Đặc điểm hình thái A oryzae 18 1.5.2 Ảnh hưởng thành phần môi trường đến sinh trưởng hình thành AGIs A oryzae 20 1.5.2.1 Ảnh hưởng nguồn carbon 21 1.5.2.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ 22 1.5.2.3 Ảnh hưởng nguồn khoáng dinh dưỡng 22 1.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh trưởng hình thành AGIs A oryzae23 1.5.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 23 1.5.3.2 Độ ẩm môi trường 23 1.5.3.3 Ảnh hưởng độ thống khí 24 1.5.3.4 Điều kiện pH ban đầu môi trường 24 1.5.3.5 Tỷ lệ giống 25 1.5.3.6 Thời gian lên men 26 1.6 Thu nhận AGIs 26 1.6.1 Chiết xuất AGIs từ sản phẩm môi trường sau lên men 26 1.6.2 Tinh AGIs 28 1.7 Ứng dụng sóng siêu âm chiết xuất 29 1.8 Nghiên cứu, thử nghiệm ứng dụng AGIs từ đậu đỗ lên men giới 34 1.9 Nghiên cứu ứng dụng AGIs Việt Nam 37 Chương NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 40 2.1.1 Các nguồn vi sinh vật vật liệu 40 2.1.2 Hóa chất 40 2.1.3 Môi trường 41 2.1.3.1 Môi trường nuôi cấy phân lập giữ giống 41 2.1.3.2 Môi trường nghiên cứu định loại Aspergillus 41 2.1.3.3 Môi trường đậu đỗ giá thể rắn 41 2.1.3.4 Các môi trường rắn cho nhân giống 41 2.1.3.5 Đỗ đen lên men 42 2.1.4 Thiết bị 42 2.1.5 Địa điểm thời gian nghiên cứu 42 2.1.5.1 Địa điểm nghiên cứu 42 2.1.5.2 Thời gian nghiên cứu 42 2.2 Phương pháp phân tích đo đạc 43 2.2.1 Phương pháp xác định mật độ tế bào nấm mốc 43 2.2.2 Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase 43 2.2.2.1 Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase mơi trường sau lên men theo phương pháp Yamaki Mori (2006) 43 2.2.2.2 Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase dịch chiết xuất dung môi 44 2.2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase theo Toomoyuki cộng sự, (1999) 44 2.2.3 Xác định hàm lượng protein, lipit, carbonhydrate độ ẩm sản phẩm thực phẩm 45 2.2.4 Phương pháp phân tích cảm quan 45 2.2.5 Phương pháp tính tốn, đánh giá hiệu tinh chế phẩm AGIs kỹ thuật 46 2.2.6 Phương pháp phân tích tiêu an tồn thực phẩm 46 2.2.7 Phương pháp phân tích xử lý số liệu 46 2.3 Phương pháp nghiên cứu 47 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 47 2.3.2 Tuyển chọn A oryzae có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao 48 2.3.2.1 Phân lập A oryzae 48 2.3.2.2 Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao 49 2.3.2.3 Định danh chủng nấm tuyển chọn dựa so sánh trình tự gen vùng ITS1 - 5,8S - ITS2 49 2.3.3 Xác định số yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng A oryzae T6 nhân giống môi trường rắn 51 2.3.3.1 Ảnh hưởng thành phần chất môi trường rắn đến sinh trưởng A oryzae T6 51 2.3.3.2 Ảnh hưởng thành phần tỷ lệ trấu môi trường rắn đến sinh trưởng A oryzae T6 51 2.3.3.3 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu môi trường nhân giống đến sinh trưởng A oryzae T6 51 2.3.3.4 Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nhân giống đến sinh trưởng A oryzae T6 51 2.3.3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ nhân giống đến sinh trưởng A oryzae T6 51 2.3.3.6 Ảnh hưởng độ dày khối môi trường nhân giống đến sinh trưởng A oryzae T6 52 2.3.3.7 Ảnh hưởng thời gian nhân giống đến sinh trưởng A oryzae T6 52 2.3.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả hình thành AGIs A oryzae T6 52 2.3.4.1 Ảnh hưởng nguồn chất mơi trường lên men đến khả hình thành AGIs A oryzae T6 52 2.3.4.2 Ảnh hưởng thành phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào mơi trường lên men đến khả hình thành AGIs A oryzae T6 52 2.3.4.3 Ảnh hưởng thành phần K2HPO4; KCL MgSO4 bổ sung vào môi trường lên men đến khả hình thành AGIs A oryzae T6 52 2.3.4.4 Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường lên men đến khả hình thành AGIs A oryzae T6 53 2.3.4.5 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu môi trường lên men đến khả hình thành AGIs A oryzae T6 53 2.3.4.6 Ảnh hưởng độ đầy khối mơi trường lên men đến khả hình thành AGIs A oryzae T6 53 2.3.4.7 Ảnh hưởng lượng giống ban đầu lên men đến khả hình thành AGIs A oryzae T6 53 2.3.4.8 Ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến khả hình thành AGIs A oryzae T6 54 2.3.4.9 Sự biến động AGIs trình lên men A oryzae T6 54 2.3.5 Chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men sử dụng sóng siêu âm 54 2.3.5.1 Ảnh hưởng dung môi đến khả chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men 54 2.3.5.2 Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến khả chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men 54 2.3.5.3 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi ethanol đỗ đen lên men đến khả chiết xuất AGIs 55 2.3.5.4 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến khả chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men: 55 2.3.5.5 Ảnh hưởng thời gian cường độ sóng siêu âm đến khả chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men 55 2.3.6 Tinh định lượng AGIs từ đỗ đen lên men 55 2.3.6.1 Khảo sát dung môi cho tinh sơ AGIs 55 2.3.6.2 Khảo sát nồng độ ethanol cho tinh sơ AGIs 56 2.3.6.3 Thu nhận AGIs 56 2.3.6.4 Tinh AGIs RP - HPLC 56 2.3.6.5 Xác định khối lượng phân tử trình tự amino acid AGIs khối phổ 57 2.3.6.6 Định lượng peptide AGIs RP - HPLC 57 2.3.7 Ứng dụng AGIs 58 2.3.7.1 Ảnh hưởng nhiệt độ cô, sấy tạo chế phẩm đến chất lượng chế phẩm AGIs 58 2.3.7.2 Đánh giá tiêu chất lượng, cảm quan an toàn thực phẩm chế phẩm AGIs 58 2.3.7.3 Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm AGIs để tạo bột uống liền AGIs 59 2.3.8 Đề xuất công nghệ sản xuất chế phẩm AGIs từ đỗ đen xanh lòng lên men A oryzae T6 60 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 62 3.1 Tuyển chọn A oryzae có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao 62 3.1.1 Phân lập A oryzae 62 3.1.2 Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao 64 3.1.3 Định danh chủng tuyển chọn dựa so sánh trình tự gen vùng ITS1- 5,8S ITS2 65 3.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng A oryzae T6 nhân giống môi trường rắn 67 3.2.1 Ảnh hưởng thành phần chất môi trường rắn đến sinh trưởng A oryzae T6 67 3.2.2 Ảnh hưởng thành phần tỷ lệ trấu môi trường rắn đến sinh trưởng A oryzae T6 69 3.2.3 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu môi trường nhân giống đến sinh trưởng A oryzae T6 70 3.2.4 Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nhân giống đến sinh trưởng A oryzae T6 71 3.2.5 Ảnh hưởng nhiệt độ nhân giống đến sinh trưởng A oryzae T6 72 3.2.6 Ảnh hưởng độ dày khối môi trường nhân giống đến sinh trưởng A oryzae T6 73 3.2.7 Ảnh hưởng thời gian nhân giống đến sinh trưởng A oryzae T6 75 3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả hình thành AGIs A oryzae T6 76 3.3.1 Ảnh hưởng nguồn chất môi trường lên men đến khả hình thành AGIs A oryzae T6 76 3.3.2 Ảnh hưởng thành phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào môi trường lên men đến khả hình thành AGIs A oryzae T6 78 3.3.3 Ảnh hưởng thành phần K2HPO4, KCL MgSO4 bổ sung vào môi trường lên men đến khả hình thành AGIs A oryzae T6 79 3.3.4 Ảnh hưởng pH ban đầu mơi trường lên men đến khả hình thành AGIs A oryzae T6 81 3.3.5 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu môi trường lên men đến khả hình thành AGIs A oryzae T6 82 3.3.6 Ảnh hưởng độ đầy khối môi trường lên men đến khả hình thành AGIs A oryzae T6 83 3.3.7 Ảnh hưởng lượng giống ban đầu lên men đến khả hình thành AGIs A oryzae T6 85 3.3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến khả hình thành AGIs A oryzae T6 86 3.3.9 Sự biến động AGIs trình lên men rắn, xốp A oryzae T6 87 3.4 Chiết xuất AGIs từ đỗ đen xanh lòng lên men A oryzae T6 (đỗ đen lên men) sử dụng sóng siêu âm 89 3.4.1 Ảnh hưởng dung môi đến khả chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men 89 3.4.2 Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến khả chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men 90 3.4.3 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi ethanol đỗ đen lên men đến khả chiết xuất AGIs 92 3.4.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men 94 3.4.5 Ảnh hưởng thời gian cường độ sóng siêu âm đến khả chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men 96 3.5 Tinh định lượng AGIs từ đỗ đen lên men 102 3.5.1 Khảo sát dung môi để tinh sơ AGIs 102 3.5.2 Khảo sát nồng độ ethanol để tinh sơ AGIs 103 3.5.3 Tinh AGIs 104 3.5.4 Xác định khối lượng phân tử trình tự axit amin peptide AGIs từ đỗ đen lên men khối phổ 107 3.5.5 Định lượng peptide AGIs đỗ đen lên men A oryzae T6 108 3.6 Đề xuất quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm AGIs từ đỗ đen xanh lòng lên men A oryzae T6 ứng dụng AGIs 109 3.6.1 Ảnh hưởng nhiệt độ cô sấy tạo chế phẩm đến chất lượng chế phẩm AGIs 109 3.6.2 Đề xuất quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm AGIs từ đỗ đen xanh lòng lên men A oryzae T6 110 3.6.3 Đánh giá tiêu chất lượng, cảm quan an toàn thực phẩm chế phẩm AGIs 112 3.6.4 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm AGIs cho sản xuất thử nghiệm bột uống liền AGIs cho người bệnh ĐTĐ 116 3.6.4.1 Xác định hàm lượng chế phẩm AGIs cho bột uống liền 116 3.6.4.2 Xác định chất phù hợp phối chế với chế phẩm AGIs cho công thức tạo sản phẩm bột uống liền 116 3.6.4.3 Xác định công thức tạo sản phẩm bột uống liền 118 KẾT LUẬN 120 KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 121 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 122 TÀI LIỆU THAM KHẢO 123 PHỤ LỤC 139 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt AGIs Tên đầy đủ alpha-Glucosidase inhibitor (chất kìm hãm α-glucosidaza ) ( chất kìm hãm α-glucosidase) (chất ức chế α-glucosidase) Bp Base pair (cặp bazơ) CFU Colony forming unit (số đơn vị khuẩn lạc) ĐTĐ Đái tháo đường đỗ đen lên đỗ đen xanh lòng lên men A oryzae T6 men Da Dalton DNJ – deoxynojirimycin PCR polymerase chain reaction GABA Gamma-Aminobutyric acid GLP Glucagon peptide GLP-1 peptide-1 dạng glucagon GLP-2 peptide-2 dạng glucagon HDL High Density Lipoprotein – Lipoprotein tỷ trọng cao HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao (High-performance liquid chromatography) IC50 Nồng độ kìm hãm 50% (Haft maximal inhibitory concentration) ITS Inter-Transcribed Spacer KDa Kilodalton LC-MS/MS Sắc ký lỏng – song song khối phổ (Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry) TE 10M Tris, - pH 8,0 - HCl, 1mM Ethylenediaminetetraacetic acid TPCN Thực phẩm chức WHO World Health Organization – Tổ chức Y tế giới p NPG p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside RP - HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao pha đảo (Reverse phase-high performance liquid chromatography) DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Một số chất kìm hãm α-glucosidase thu nhận từ vi sinh vật 14 Bảng 1.2 Một số sản phẩm đậu tương lên men tác nhân vi sinh vật 17 Bảng 1.3 Các chất dinh dưỡng đa lượng, vi lượng, nguồn gốc chức tế bào nấm mốc Aspergillus spp 21 Bảng 1.4 Các ứng dụng siêu âm lượng cao công nghiệp thực phẩm 32 Bảng 2.1 Hàm lượng số chất khống mơi trường lên men 53 Bảng 2.2 Tỷ lệ phối trộn thành phần tạo sản phẩm bột uống liền 59 Bảng 2.3 Mười trật tự trình bày mẫu tuân theo nguyên tắc hình vng Williams tương ứng với mẫu khảo sát 60 Bảng 3.1 Kết phân lập Aspergillus spp từ nguồn khác 62 Bảng 3.2 Kết đánh giá mức độ tương đồng trình tự đoạn vùng ITS1 - 5,8S ITS2 chủng T6 với GenBank database sử dụng công cụ BLAST 66 Bảng 3.3 So sánh phương pháp chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men sử dụng sóng siêu âm khơng sử dụng sóng siêu âm 101 Bảng 3.4 Đánh giá sản phẩm sau bước tinh AGIs từ đỗ đen lên men 108 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ cô sấy chân khơng đến chất lượng cảm quan, hoạt tính kìm hãm α-glucosidase thời gian cô đến chất lượng chế phẩm AGIs 109 Bảng 3.6 Kết phân tích hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, dinh dưỡng tiêu lý hóa chế phẩm AGIs 113 Bảng 3.7 Kết phân tích tiêu vi sinh vật, kim loại nặng chất không mong muốn sản phẩm chế phẩm AGIs 114 Bảng 3.8 Số liệu thử độc tính cấp chế phẩm AGIs 115 Bảng 3.9 Kết điểm đánh giá cảm quan cho tiêu sản phẩm bột uống liền 118 142 Aspergillus oryzae partial 18S rRNA gene, strain ARD 115 Sequence ID: emb|FN823241.1|Length: 950Number of Matches: Query Sbjct 652 Query 61 Sbjct 592 Query 121 Sbjct 532 Query 181 Sbjct 472 Query 241 Sbjct 412 Query 301 Sbjct 352 Query 361 Sbjct 292 Query 420 Sbjct 232 Query 480 Sbjct 172 GTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACT 60 ACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCT 120 GCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTC 180 CAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCG 240 GGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTC 300 CCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATC 360 CTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCA-AGGCCAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||| CTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCATAGGCCAT 419 GCGATTCGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATGGGTTTTTTATCT ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||| GCGATTCGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATTGGTTTTTTATCT AATAAATACACCCCTTCC |||||||||||||||||| AATAAATACACCCCTTCC 593 533 473 413 353 293 233 479 173 497 155 Hình PL.2 So sánh độ tương đồng trình tự nucleotide đoạn ADN vùng ITS1-5,8S-ITS2 chủng T6 với trình tự nucleotide A oryzae công bố Ngân hàng liệu Quốc tế với mã số embFN823241.1 143 Aspergillus oryzae strain SEMCC-3.248 18S ribosomal RNA gene, partial sequence Sequence ID: gb|HM064501.1|Length: 1770Number of Matches: Query Sbjct 668 Query 61 Sbjct 608 Query 121 Sbjct 548 Query 181 Sbjct 488 Query 241 Sbjct 428 Query 301 Sbjct 368 Query 361 Sbjct 308 Query 421 Sbjct 248 Query 481 Sbjct 188 GTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACT 60 609 ACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCT 120 GCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTC 180 CAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCG 549 489 240 429 GGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTC 300 CCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATC 360 CTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATG 420 CGATTCGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATGGGTTTTTTATCTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||| CGATTCGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATTGGTTTTTTATCTA 480 ATAAATACACCCCTTCC ||||||||||||||||| ATAAATACACCCCTTCC 369 309 249 189 497 172 Hình PL.3 So sánh độ tương đồng trình tự nucleotide đoạn ADN vùng ITS1-5,8S-ITS2 chủng T6 với trình tự nucleotide A oryzae công bố Ngân hàng liệu Quốc tế với mã số gbHM064501.1 144 Conc.(x10) mAU 75 1(#1) Ch1 280nm 2(#1) Ch1 280nm 2(#2) Ch1 280nm 3(#1) Ch1 280nm 50 4(#1) Ch1 280nm 5(#1) Ch1 280nm 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 25 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 22.5 0.0 25000 50000 75000 100000 125000 150000 175000 200000 Area Hình PL.4 Đường chuẩn chất kìm hãm glucosydase Từ vùng diện tích píc suy đường tuyến tính: Y = aX + b a = 1.818422e-004 b = 11.18738 R^2 = 0.9771138 R = 0.9884907 External Standard Curve Fit Type:Linear Origin:Not Forced Weight:None Mean RF : 6.020700e-004 RF SD : 5.854472e-004 RF %RSD : 97.23906 25.0 27.5 Hình PL.5 Diện tích píc trùng sau chạy HPLC với nồng độ khác chất kìm hãm -glucosydase Bảng PL.3 Vùng diện tích píc với nồng độ khác chất kìm hãm -glucosydase Level Conc (mg/ml) Area 10 6225 20 31433 30 103323 40 171369 50 204929 - Định lượng sản phẩm AGIs dịch trích ly đỗ đen lên men đường chuẩn Conc.(x10) 5.0 Level 4.0 3.0 2.0 Bảng PL.4 Vùng diện tích sản phẩm glucosydase so sách với đường chuẩn Conc Mean Area SD %RSD Area 1 10 6225 6225 20 38577 30 103323 103323 40 171369 171369 50 204929 204929 10102.97 26.18913 31433 1.0 0.0 25000 50000 75000 100000 125000 150000 175000 200000 Area Hình PL.6 Nồng độ sản phẩm sau lên men rắn đường chuẩn Area 29862 145 Hình PL.7 Đỗ đen xanh lịng ngun liệu Hình PL.8 Cám gạo nguyên liệu Hình PL.10 Thiết bị chiết xuất Hình PL.9 Đỗ đen xanh lịng sau lên men A oryzae T6 Hình PL.11 Thử độc tính cấp chế phẩm AGIs sóng siêu âm TJS-3000 intelligent Ultrasonic Generator V6 (tần số 20 kHz cơng suất tối đa 3000W) Hình PL.12 Sản phẩm bột uống liền 146 Phụ lục KQ KP: Xác định khối lượng phân tử trình tự axit amin peptide AGIs từ đỗ đen lên men (đỗ đen xanh lòng lên men A oryzae T6) khối phổ 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 ... có hoạt tính kìm hãm α- glucosidase với hoạt lực kìm hãm α- glucosidase đạt IC50 α- glucosidase từ ruột chuột sử dụng chất sucrose 0,34 g/l [79] Tách chiết thu hồi Touchi Wang cộng nghiên cứu vào... lực AGIs thu nhận phụ thu? ??c vào vi sinh vật, điều kiện lên men - Thu nhận AGIs, tinh tạo chế phẩm AGIs cho hoạt tính, hoạt lực kìm hãm αglucosidase cao hiệu phụ thu? ??c vào công nghệ thu nhận, tinh... việc nghiên cứu có hệ thống thu nhận AGIs từ A oryzae lên men nguồn nguyên liệu nước hướng ứng dụng điều kiện Việt Nam vấn đề cấp thiết, mang ý nghĩa khoa học thực tiễn cao? ?Nghiên cứu thu nhận hoạt