Nghiên cứu phương pháp xác định một số steviol glycosides trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LƢU THỊ HUYỀN TRANG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ STEVIOL GLYCOSIDES TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LƢU THỊ HUYỀN TRANG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ STEVIOL GLYCOSIDES TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 8440112.03 Cán hƣớng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Ánh Hƣờng TS Trần Cao Sơn Hà Nội - 2020 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan cỏ ngọt………………………………………………………3 1.1.1 Giới thiệu…………………………………………………………………… 1.1.1.1 Thực vật học ………………………………………………………………3 1.1.1.2 Tác dụng.…………………………… …………………………………….4 1.1.1.3 Liều dùng an toàn ngƣời………………………………………………….6 1.1.2 Thành phần hóa học cỏ ngọt……………………………………….7 1.2 Tổng quan Steviol glycoside……………………………………………… 1.2.1 Giới thiệu…………………………………………………………………… 1.2.2 Tính chất vật lý, hóa học……………………………………………………10 1.2.3 Ứng dụng thực tế Steviol glycosides………………………………… 11 1.3 Các phƣơng pháp xác định Steviol glycosides………………… ………… 12 1.3.1 Sắc ký lớp mỏng…………………………………………………………….13 1.3.2 Phƣơng pháp quang phổ…………………………………………………….14 1.3.3 Phƣơng pháp điện di mao quản…………………………………………… 15 1.3.4 Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ…………………………………………17 1.3.5 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao UV-Vis/PDA…………………….19 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .27 2.1 Mục tiêu nghiên cứu………………………………………………………….27 2.2 Nội dung nghiên cứu…………………………………………………………27 2.3 Đối tƣợng nghiên cứu……………………………………………………… 27 2.4 Nguyên vật liệu – thiết bị, dụng cụ………………………………………… 28 2.4.1 Nguyên vật liệu…………………………………………………………… 28 2.4.2 Thiết bị, dụng cụ……………………………………………………………28 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu ………………………………… ……………….29 2.5.1 Phƣơng pháp phân tích…………………………………………………… 29 2.5.2 Phƣơng pháp xử lý mẫu…………………………………………………….31 2.5.3 Xác nhận giá trị sử dụng phƣơng pháp……………………………… 32 2.5.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu………………………………………………….33 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1.Lựa chọn điều kiện phân tích sắc ký…………………………………… 34 3.1.1 Khảo sát nồng độ đệm…………………………………………………… 34 3.1.2 Khảo sát pH pha động…………………………………………………… 36 3.1.3 Khảo sát nhiệt độ cột………………………………………………………38 3.1.4 Điều kiện tối ƣu phân tích số Steviol glycosides HPLC……… 39 3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu……………………………………………… 40 3.2.1 Khảo sát dung môi chiết mẫu………………………………………………40 3.2.2 Khảo sát nhiệt độ chiết mẫu……………………………………………… 41 3.2.3 Khảo sát thời gian chiết mẫu……………………………………………….42 3.2.4 Khảo sát điều kiện làm qua SPE…………………………………… 42 3.3 Thẩm định phƣơng pháp…………………………….……………………….44 3.3.1 Xây dựng đƣờng chuẩn…………………………………………………….44 3.3.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng phƣơng pháp……………… 46 3.3.3 Độ lặp lại………………………………………………………………… 47 3.3.4 Đánh giá độ thu hồi……………………………………………………… 51 3.4 Phân tích mẫu thực tế……………………………………………………… 56 KẾT LUẬN 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 68 LỜI CẢM ƠN Luận văn đƣợc hoàn thành với hỗ trợ, giúp đỡ, động viên Thầy Cơ, gia đình bạn bè, đồng nghiệp Với tình cảm chân thành, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Ánh Hƣờng TS Trần Cao Sơn ngƣời thầy tận tâm hƣớng dẫn, giúp đỡ động viên tơi suốt q trình làm luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tới q Thầy, Cơ Bộ mơn Hóa Phân tích, khoa Hóa Học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội tâm huyết truyền dạy kiến thức tạo điều kiện tốt để đƣợc học tập, nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện, TS Vũ Thị Trang anh chị đồng nghiệp khoa Dinh dƣỡng phụ gia thực phẩm, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi trình làm luận văn Lời sau cùng, xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới ngƣời thân gia đình, tới ngƣời bạn, tới lãnh đạo đồng nghiệp khoa Dinh dƣỡng Phụ gia thực phẩm – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia động viên, ủng hộ tạo điều kiện thuận lợi suốt thời gian học tập hoàn thành luận văn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu AOAC Tiếng Anh Association of Official Analytical Communities Tiếng Việt Hiệp hội cộng đồng phân tích Lƣợng ăn vào ADI Acceptable Daily Intake TLC Thin-layer chromatography Sắc ký lớp mỏng CE Capillary Electropherosis Điện di mao quản HPTLC High-performance thin-layer chromatography ngày chấp nhận đƣợc Sắc ký lớp mỏng hiệu cao HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao GC Gas chromatography Sắc ký khí GC-MS Gas chromatography mass spectrometry Sắc ký khí khổi phổ LC-MS Liquid chromatography mass pectrometry Sắc ký lỏng khối phổ MDL Method detection limit Giới hạn phát phƣơng pháp MQL Method quantification limit Giới hạn định lƣợng phƣơng pháp MS Mass spectrometry Khối phổ PDA Photometric Diode Array Mảng Diot quang RP- Reverse phase high performance liquid HPLC chromatography SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SPE Solid phase extration Chiết pha rắn UV-Vis Ultraviolet - Visible Tử ngoại – Khả kiến Sắc ký lỏng pha đảo DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Lá cỏ Hình 1.2: Khung cấu trúc Steviol glycosides Hình 1.3: Thành phần Steviol glycosides cỏ ngọt: a Stevioside; b Rebaudioside A Hình 2.1: Hệ thống thiết bị HPLC-PDA 29 Hình 2.2: Quy trình xử lý mẫu dự kiến 31 Hình 3.1: Sắc ký đồ Steviol glycosides 25ppm nồng độ pha động 5mM 35 Hình 3.2: Sắc ký đồ Steviol glycosides 25ppm nồng độ pha động 10mM 35 Hình 3.3: Sắc ký đồ Steviol glycosides 25ppm nồng độ pha động 20mM 35 Hình 3.4: Sắc ký đồ Steviol glycosides 25ppm nồng độ pha động 50mM 36 Hình 3.5: Sắc ký đồ Steviol glycosides pH = 37 Hình 3.6: Ảnh hƣởng pH đến độ phân giải Stevioside Rebaudioside A 37 Hình 3.7: Sắc ký đồ chất Steviol glycosides nhiệt độ cột 20oC 38 Hình 3.8: Sắc ký đồ chất Steviol glycosides nhiệt độ cột 40oC 38 Hình 3.9: Sắc ký đồ chất Steviol glycosides nhiệt độ cột 60oC 39 Hình 3.10: Sắc ký đồ chất Steviol glycoside nhiệt độ cột 79oC 39 Hình 3.11: Hàm lƣợng Steviol glycosides sử dụng dung môi chiết khác 40 Hình 3.12: Hiệu suất thu hồi (H%) Steviol glycosides làm cột C18 HLB 43 Hình 3.13: Quy trình xử lý mẫu tối ƣu 44 Hình 3.14: Đồ thị tƣơng quan diện tích pic nồng độ RebA 45 Hình 3.15: Đồ thị tƣơng quan diện tích pic nồng độ Stevioside 45 Hình 3.16: Kết phân tích tổng hàm lƣợng Steviol glycosides mẫu cỏ đƣờng ăn kiêng 57 Hình 3.17: Kết phân tích tổng hàm lƣợng Steviol glycosides mẫu nƣớc giải khát 58 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Cấu trúc chất nhóm Steviol glycosides độ so với đƣờng sucrose Bảng 1.2: Mức quy định giới hạn sử dụng Steviol glycosides thực phẩm 11 Bảng 1.3: Tóm tắt kết số phƣơng pháp xác định Steviol glycosides 23 Bảng 3.1: Kết khảo sát ảnh hƣởng pH đến thời gian lƣu nhóm chất Steviol glycosides 37 Bảng 3.2: Hàm lƣợng chất Steviol glycosides (mg/g) thu đƣợc với dung môi chiết khác 41 Bảng 3.3: Hàm lƣợng chất Steviol glycosides nhiệt độ khác 41 Bảng 3.4: Hàm lƣợng Steviol glycosides (mg/g) thu đƣợc với thời gian chiết khác 42 Bảng 3.5: Quy trình làm qua SPE 43 Bảng 3.6: Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ chất Steviol glycosides 44 Bảng 3.7: Đƣờng hồi quy tuyến tính diện tích pic nồng độ Steviol glycosides 46 Bảng 3.8: Giới hạn phát phƣơng pháp (MDL) giới hạn định lƣợng phƣơng pháp (MQL) Steviol glycosides 47 Bảng 3.9: Độ lặp lại phân tích Steviol glycosides mẫu cỏ 48 Bảng 3.10: Độ lặp lại phân tích Steviol glycosides mẫu đƣờng ăn kiêng 49 Bảng 3.11: Độ lặp lại phân tích Steviol glycosides mẫu nƣớc 50 Bảng 3.12: Độ thu hồi chất Steviol glycosides mẫu cỏ 52 Bảng 3.13: Độ thu hồi chất Steviol glycosides mẫu đƣờng ăn kiêng 53 Bảng 3.14: Độ thu hồi chất Steviol glycosides mẫu nƣớc giải khát 54 Bảng 3.15: Bảng kết độ thu hồi so với yêu cầu AOAC 55 Bảng 3.16: Kết phân tích số mẫu thực tế nguyên liệu đƣờng cỏ ngọt, cỏ ngọt, đƣờng ăn kiêng 56 Bảng 3.17: Kết phân tích số mẫu thực tế mẫu trà giảm cân nƣớc giải khát 57 Kết phân tích mẫu thực tế thu đƣợc hàm lƣợng Steviol glycosides khác mẫu lá, điều kiện canh tác mùa vụ thu hoạch Hàm lƣợng mẫu dao động từ 3,20 đến 7,08 %, mẫu nƣớc có mẫu khơng phát mẫu có hàm lƣợng khoảng từ 0,003-0,050 mg/mL mẫu trà giảm cân từ 0,64-2,24 mg/g Hàm lƣợng mẫu lớn nhiều so với cành, nhƣ nguyên liệu để làm đƣờng cỏ chủ yếu từ cỏ Hàm lƣợng mẫu bột cỏ tƣơng đối cao với thành phần Stev RebA, Stev chiếm chủ yếu từ 69,32 – 83,85% Ở mẫu bột cỏ ngọt, hàm lƣợng Stev cao RebA mẫu trà nƣớc hàm lƣợng RebA cao Stev có dƣ vị đắng thực phẩm ngƣời ta thƣờng cho hàm lƣợng Stev RebA Các chất Rubu, RebB StevB phát Kết phù hợp với nghiên cứu trƣớc thành phần nhóm đƣờng Stevia Đồng thời hàm lƣợng nƣớc giải khát tỷ lệ với hàm lƣợng đƣờng mẫu nguyên liệu, điều nói lên việc bổ sung đƣờng cỏ vào mẫu nƣớc giải khát đƣợc sử dụng nguyên liệu tự nhiên, có thành phần tƣơng ứng với thành phần mẫu ngun liệu tự nhiên mà khơng có hợp chất đƣợc tổng hợp nhóm stevia Hàm lƣợng tổng Steviol glycoside mẫu nƣớc nhỏ nhiều so với giới hạn cho phép Bộ y tế đƣờng Steviol glycosides nhiều lần so với đƣờng mía nên hàm lƣợng đƣợc bổ sung vào mẫu thực phẩm thấp 59 KẾT LUẬN Sau hoàn thành nghiên cứu này, sở nghiên cứu điều kiện thực nghiệm, với mục đích ứng dụng phƣơng pháp HPLC xác định hàm lƣợng số Steviol glycosides, luận văn thu đƣợc kết nhƣ sau: - Đã lựa chọn đƣợc điều kiện phân tích HPLC chất phân tích:  Cột C18 (250mm x 4,6mm x µm)  Thể tích bơm mẫu: 20 µL  Pha động: Kênh A: NaH2PO4 10 mM pH 2,6 - Kênh B: ACN (68:32, v/v), chế độ đẳng dòng  Thời gian: 29 phút  Bƣớc sóng: 210 nm  Nhiệt độ cột 40oC - Đã khảo sát đƣợc quy trình chiết số Steviol glycosides mẫu nguyên liệu cỏ khô, đƣờng ăn kiêng, nƣớc giải khát:  Dung môi chiết Methanol  Điều kiện chiết mẫu rung siêu âm 50oC vòng 60 phút  Làm cột SPE HLB (3mL, 60mg) - Thẩm định phƣơng pháp phân tích: xây dựng khoảng đƣờng chuẩn chất từ – 100 mg/L; Độ lặp lại RSD% khoảng 0,137-3,18% độ thu hồi khoảng 91,3 – 107% đạt theo yêu cầu AOAC MDL khoảng 12,525,0 mg/kg; MQL khoảng 41,2 – 82,5 mg/kg Nhƣ vậy, phƣơng pháp cho thấy có độ tin cậy xác tƣơng đối cao, đảm bảo áp dụng phân tích đƣợc chất mẫu - Đã thực phân tích 25 mẫu thực phẩm bao gồm cỏ khô, bột cỏ ngọt, đƣờng ăn kiêng, trà giảm cân nƣớc giải khát lƣu hành thị trƣờng Hà Nội Thành phần chất tạo khác mẫu khác nhau, hàm lƣợng Stevioside Rebaudioside A chiếm tỷ lệ chủ yếu so với thành phần 60 lại Hàm lƣợng chất tạo sản phẩm nƣớc giải khát trà cỏ tỷ lệ tƣơng ứng với tỷ lệ thành phần nguyên liệu - Kiến nghị: Kết thu đƣợc đƣợc áp dụng thành quy trình thao tác chuẩn phân tích số Steviol glycosides Ngồi ra, tƣơng lai phƣơng pháp phân tích mở rộng để phân tích đồng thời nhiều chất khác thuộc nhóm glycosides nhƣ đối tƣợng mẫu thực phẩm khác 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ y tế - Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia (2018), Phương pháp kiểm nghiệm chất lượng an toàn thực phẩm - Tập - Nhóm sản phẩm dinh dưỡng, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Nguyễn Kim Cẩn, Lê Nguyệt Nga (2001), Định lượng Stevioside cỏ ngọt, Cơng trình nghiên cứu khoa học 1987-2000, Viện dƣợc liệu, Nhà Xuất Khoa học Kỹ thuật, tr 125-128 Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Xuân Trung, Nguyễn Văn Ri (2003), Các phương pháp phân tích công cụ, Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc gia Hà Nội Tơn Nữ Liên Hƣơng, Võ Hồng Duy, Dƣơng Mộng Hòa, Đỗ Duy Phúc Nguyễn Duy Thanh (2015), “Chiết xuất Stevioside từ cỏ ngọt”, Tạp chí khoa học trường đại học Cần Thơ, Phần A: Khoa học tự nhiên, công nghệ môi trường, 36, tr 73-76 Trƣơng Hƣơng Lan, Lại Quốc Phong, Nguyễn Thị Làn, Nguyễn Thị Việt Hà, Phạm Linh Khoa, Lê Hồng Dũng (2014), “Xác định thành phần cỏ Việt Nam”, Tạp chí khoa học phát triển, 12(1), tr 73-77 Phạm Luận (2014), Phương pháp sắc ký chiết tách, NXB Bách Khoa Hà Nội Hồ Viết Q (2006), Phân tích Lý –Hóa, NXB Giáo dục Tạ Thị Thảo (2010), Giáo trình mơn học Thống kê Hóa phân tích, Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc gia Hà Nội 62 Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội Tiếng Anh 10.Abbas Momtazi-Borojeni, A., et al (2017), “A review on the pharmacology and toxicology of Steviol glycosides extracted from Stevia rebaudiana”, Current pharmaceutical design, 23(11): p 1616-1622 11.Abou-Arab, A.E., A.A, M.F Abu-Salem (2010), “Physico-chemical assessment of natural sweeteners Steviosides produced from Stevia rebaudiana Bertoni plant”, African Journal of Food Science, 4(5): p 269281 12 Annie Shirwaikar, Vinit Parmar, Jay Bhagat and Saleemulla Khan (2011), “Identification and estimation of Stevioside in the commercial samples of stevia leaf and powder by HPTLC and HPLC”, Int J of Pharm & Life Sci (IJPLS), pp 1050-1058 13.Brusick, D (2008), “A critical review of the genetic toxicity of steviol and Steviol glycosides”, Food and Chemical Toxicology, 46(7): p S83-S91 14.Chatsudthipong, V a C Muanprasat (2009), “Stevioside and related compounds: therapeutic benefits beyond sweetness” Pharmacology & therapeutics, 121(1): p 41-54 15.Claudio Gardana, Martina Scaglianti, Paolo Simonetti (2010), “Evaluation of steviol and its glycosides in Stevia rebaudiana leaves and commercial sweetener by ultra-high-performance liquid chromatography-mass spectrometry”, Journal of Chromatography A, 1217, pp 1463–1470 16.Dacome, A.S., et al (2005), “Sweet diterpenic glycosides balance of a new cultivar of Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni: Isolation and quantitative distribution by chromatographic, spectroscopic, methods”, Process Biochemistry, 40(11): p 3587-3594 63 and electrophoretic 17.Dominik Bergs, Bernhard Burghoff, Matthias Joehnck, Georg Martin, Gerhard Schembecker (2012), “Fast and isocratic HPLC-method for Steviol glycosides analysis from Stevia rebaudiana leaves”, Journal of Consumer Protection and Food Safety, 7:147–154 18.Elsevier Science Publishers B.V (1989), “Separation of natural product sweetening agents using overpressured layer chromatography”, Journal of Chromatography, 464, pp 213-219 19.Food and agriculture organization of the United Nations (2016), Steviol glycosides – Chemical and technical assessment, the 82nd JECFA 20.Hajime Miukami, Keiko Shiiba and Hiromu Ohashi (1982), “Enzymatic determination of Stevioside in stevia rebaudiana”, Phytochemistry, 21(8), pp 127-193 21.Jan M C Geuns, Johan Buýe, Annelies Vankeirsbilck, Elisabeth H M T, Frans Compernolie, Suzanne Toppet (2006), “Identification of Steviol Glucuronide in Human Urine”, J Agric Food Chem., 54, 2794-2798 22.J Liu and S F Y Li (1995), “Separation and Determination of Stevia Sweeteners by Capillary Electrophoresis and High Performance Liquid Chromatography”, Journal of Liquid Chromatography, 18(9), pp 1703-1719 23.Katarzyna Marcinek and Zbigniew Krejpcio (2015), “Stevia rebaudiana Bertoni – chemical composition and functional properties”, Acta Sci Pol Technol Aliment, 14(2), 145–152 24.Lemus-Mondaca, R., et al (2012), “Stevia rebaudiana Bertoni, source of a high-potency natural sweetener: A comprehensive review on the biochemical, nutritional and functional aspects”, Food chemistry, 132(3): p 1121-1132 25.Mauri, P., et al (1996), “Analysis of Stevia glycosides by capillary electrophoresis”, Electrophoresis, 17(2): p 367-371 64 26.Marcinek, K and Z Krejpcio (2015), “Stevia rebaudiana Bertoni chemical composition and functional properties”, Acta Scientiarum Polonorum Technologia Alimentaria, 14(2): p 145-152 27.Molina-Calle M., Sánchez de Medina V., Delgado de la Torre M P., PriegoCapote F and Luque de Castro M D (2016), “Development and application of a quantitative method based on LC–QqQ MS/MS for determination of Steviol glycosides in Stevia leaves”, Talanta, 154(C), pp 263–269 28.Morlock G.E., S Meyer, B.F Zimmermann, J.-M Roussel (2014), “Highperformance thin-layer chromatography analysis of Steviol glycosides in Stevia formulations and sugar-free food products, and benchmarking with (ultra) high- performance liquid chromatography”, Journal of Chromatography A, 9673(14), pp 1-31 29.Paula M Martins, Bhaskar N Thorat, Aurea D Lanchote and Luis A.P Freitas (2016), “Green extraction of glycosides from Stevia rebaudiana (Bert.) with low solvent consumption: A desirability approach”, ResourceEfficient Technologies Resource-Efficient Technologies, pp 1-7 30.Paweł Kubica, Jacek Namieśnik, Andrzej Wasik (2014), “Determination of eight artificial sweeteners and common Stevia rebaudiana glycosides in nonalcoholic and alcoholic beverages by reversed-phase liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry”, Anal Bioanal Chem, 407(5), pp 31.Prepared at the 73rd JECFA (2010) and published in FAO JECFA Monographs, Steviol glycoside, INS no.960 32.R Amery, E Jooken, J Geuns4 and B Meesschaert (2010),“Determination of Steviol glycosides in Various dairy matrices and soy drink” Centre for Surface Chemistry and Catalysis And Leuven Food Science and Nutrition Research Centre 33.Roberto Lemus-Mondaca, Antonio Vega-Gálvez, Liliana Zura-Bravo and Kong Ah-Hen (2012), “Stevia rebaudiana Bertoni, source of a high-potency 65 natural sweetener: A comprehensive review on the biochemical, nutritional and functional aspects”, Food Chemistry, 132, pp 1121-1132 34.Udompaisarn, S., D Arthan, J Somana (2017), “Development and validation of an enzymatic method to determine Stevioside content from Stevia rebaudiana”, Journal of agricultural and food chemistry, 65(15): p 32233229 35.Ursula Woelwer-Rieck, Christa Lankes, Andreas Wawrzun, Matthias Wus (2010), “Improved HPLC method for the evaluation of the major Steviol glycosides in leaves of Stevia rebaudiana”, Eur Food Res Technol, 231:581– 588 36.Varanuj Chatsudthipong, Chatchai Muanprasat (2009), “Stevioside and related compounds: Therapeutic benefits beyond sweetness”, Pharmacology & Therapeutics ,121, pp 41–54 37.Václav Pavlícˇek, Petr Tuma (2017),”The use of capillary electrophoresis with contactless conductivity detection for sensitive determination of Stevioside and Rebaudioside A in foods and beverages”, Food Chemistry, 219, pp 193–198 38.Venkata Sai Prakash Chaturvedula, Julian Zamora (2014), “Reversed-Phase HPLC analysis of Steviol glycoside isolated from stevia rebaudiana bertoni” Food and Nutrition Sciences, 18(9), pp 1703-1719 39.Vikas Jaitak, A.P Gupta, V.K Kaul and P.S Ahuja (2008), “Validated highperformance thin-layer chromatography method for Steviol glycosides in Stevia rebaudiana”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 47, pp 790–794 40.Yadav A K., Singh S., Dhyani, D and Ahuja, P S (2011), “A review on the improvement of Stevia [Stevia rebaudiana (Bertoni)]”, Institute of Himalayan Bioresource Technology, 91, pp 1-127 66 41.Yan-Hong Wang , Bharathi Avula , Wenzhao Tang , Mei Wang , Mahmoud A Elsohly, Ikhlas A Khan (2015), “Ultra-HPLC method for quality and adulterant assessment of Steviol glycosides sweeteners – Stevia rebaudiana and stevia products”, Food Additives & Contaminants: Part A, Vol 32, No 5, 674–685 67 PHỤ LỤC Phụ lục Đƣờng chuẩn số Steviol glycosides 600000 y = 4930x - 1683,8 R² = 500000 400000 Tín 300000 hiệu 200000 100000 0 20 40 60 80 100 120 C (mg/L) Hình PL1.1: Đường chuẩn xác định RebC phương pháp HPLC-PDA 600000 y = 5128,7x - 1085,5 R² = 0,9998 500000 400000 Tín hiệu 300000 200000 100000 0 20 40 60 80 100 120 C (mg/L) Hình PL1.2: Đường chuẩn xác định Dul phương pháp HPLC-PDA 68 600000 y = 5049,4x - 169,67 R² = 500000 400000 Tín 300000 hiệu 200000 100000 0 20 40 60 C (mg/L) 80 100 120 Hình PL1.3: Đường chuẩn xác định Rubu phương pháp HPLC-PDA 500000 y = 4203,3x - 1229,8 R² = 400000 300000 Tín 200000 hiệu 100000 0 20 40 60 80 100 120 C (mg/L) Hình PL1.4: Đường chuẩn xác định Reb B phương pháp HPLC-PDA 450000 y = 3888,4x + 315,66 R² = 0,9999 400000 350000 300000 Tín 250000 hiệu 200000 150000 100000 50000 0 20 40 60 C (mg/L) 80 100 120 Hình PL1.5: Đường chuẩn xác định Stev B phương pháp HPLC-PDA 69 30 /22.043/418688 40 20 /23.615/389495 50 /14.942/504933 /7.307/597262 /7.693/257695 mAU 210nm,4nm (1.00) /10.098/491428 /10.944/510289 Phụ lục Sắc ký đồ số nồng độ chuẩn nhóm Steviol glycosides 10 -10 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 Hình PL2.1: Sắc ký đồ chuẩn 100 mg/L nhóm Steviol glycosides phương pháp HPLC-PDA /23.830/9806 /22.297/8916 /15.058/12607 /10.262/10138 /11.086/12728 /7.385/13007 /7.769/6003 mAU 210nm,4nm (1.00) -1 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 Hình PL2.2: Sắc ký đồ chuẩn 2,5 mg/L nhóm Steviol glycosides phương pháp HPLC-PDA Phụ lục Sắc ký đồ phần thẩm định phƣơng pháp mAU 210nm4nm (1.00) 1.00 StevB/24.082/76 /24.696/19 -0.50 Reb B/22.536/84 /21.329/32 Rubu/14.984/125 /14.344/40 Reb C/10.182/140 Dul A/11.044/176 /11.792/39 -0.25 /9.726/27 0.00 /6.543/44 0.25 /8.667/46 0.50 Reb A/7.389/253 SteV/7.687/270 0.75 -0.75 -1.00 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 Hình PL 3.1: Sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn mức LOD 70 mAU 210nm,4nm (1.00) 2500 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 /24.100/10497 500 /22.582/4742 1000 /15.218/73161 1500 /10.517/214673 /11.349/121968 /7.558/1051306 /7.970/2207469 2000 25.0 Hình PL3.2: Sắc ký đồ độ lặp lại mẫu cỏ 0.0 5.0 10.0 Reb B/22.607/9993 1000 Rubu/15.326/86218 2000 Reb C/10.536/304608 Dul A/11.335/160363 Reb A/7.595/1753482 SteV/8.025/3143876 3000 15.0 20.0 /23.701/10534 StevB/24.165/20531 mAU 4000 210nm4nm (1.00) 25.0 Hình PL3.3: Sắc ký đồ độ thu hồi mẫu cỏ mAU 210nm,4nm (1.00) Reb A/7.713/5673007 800 700 600 500 SteV/8.166/7235989 900 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 StevB/24.233/81133 Reb B/22.684/53556 100 Rubu/15.389/135060 Reb C/10.592/540439 200 Dul A/11.397/89077 300 /10.953/49864 400 25.0 27.5 Hình PL3.4: Sắc ký đồ độ lặp lại mẫu nước giải khát 71 Phụ lục Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết mẫu mAU 210nm4nm (1.00) 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 StevB/23.998/33355 Reb B/22.201/57149 500 Rubu/14.887/70750 1000 Reb C/10.205/347113 Dul A/11.033/81270 Reb A/7.402/1443327 SteV/7.790/2407558 1500 25.0 Hình PL4.1: Sắc ký đồ mẫu cỏ sử dụng dung môi chiết methanol mAU 210nm4nm (1.00) 1000 900 800 700 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 StevB/23.967/99927 100 /24.634/45188 200 Reb B/22.443/44695 300 /15.887/133076 400 Reb C/10.024/318781 500 /10.802/36072 Dul A/11.122/69155 Reb A/7.277/1463028 SteV/7.659/2169086 600 25.0 27.5 Hình PLD 2: Sắc ký đồ mẫu cỏ sử dụng dung môi chiết nước Phụ lục Sắc ký đồ khảo sát nhiệt độ chiết mẫu mAU 210nm4nm (1.00) 0.0 5.0 10.0 15.0 72 20.0 StevB/23.998/33355 Reb B/22.201/57149 500 Rubu/14.887/70750 1000 Reb C/10.205/347113 Dul A/11.033/81270 Reb A/7.402/1443327 SteV/7.790/2407558 1500 25.0 Hình PL5.1: Sắc ký đồ mẫu cỏ sử dụng dung môi chiết methanol 30 oC 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 StevB/23.976/33808 /24.644/65710 500 Reb B/22.141/67326 1000 Rubu/14.897/76505 Reb A/7.364/1640447 SteV/7.754/2564154 1500 Reb C/10.174/387242 Dul A/11.016/81458 mAU 210nm,4nm (1.00) 25.0 Hình PL5.2: Sắc ký đồ mẫu cỏ sử dụng dung môi chiết methanol 50 oC 73 ... phƣơng pháp sắc 12 ký: sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu cao với detector UV (PDA) sắc ký lỏng khối phổ Một số phƣơng pháp phân tích đƣợc liệt kê dƣới tài liệu tham khảo cho nghiên cứu 1.3.1 Sắc ký. .. LƢU THỊ HUYỀN TRANG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ STEVIOL GLYCOSIDES TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 8440112.03 Cán hƣớng dẫn: PGS.TS... tích 30 phút Tóm tắt kết số nghiên cứu phƣơng pháp xác định Steviol glycosides đƣợc thể bảng 1.3 22 Bảng 1.3: Tóm tắt kết số nghiên cứu phương pháp xác định Steviol glycosides STT Phƣơng Chất