Để góp phần vào công tác kiểm tra, phát hiện các chất cấm có trong mỹ phẩm, chúng tôi đã tiến hành xác định một số paraben bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và áp dụng quy trình đã xây dựng để xác định paraben trong một số đối tượng mỹ phẩm như kem dưỡng da, son dưỡng môi.
ISSN: 1859-2171 TNU Journal of Science and Technology 194(01): 181 - 187 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ PARABEN CÓ TRONG MỸ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Nguyễn Thị Hồng Hạnh*, Bùi Thị Thanh Châm, Bùi Thị Luyến Trường Đại học Y Dược – ĐH Thái Nguyên TĨM TẮT Để góp phần vào cơng tác kiểm tra, phát chất cấm có mỹ phẩm, tiến hành xác định số paraben phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) áp dụng quy trình xây dựng để xác định paraben số đối tượng mỹ phẩm kem dưỡng da, son dưỡng mơi Mẫu hòa tan methanol: nước (50:50), lọc định lượng phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao, cột sắc kí pha đảo cột pha đảo (C8, 150 mm x 4,6 mm, µm), pha động methanol / nước (60:40 v/v) tốc độ dòng chảy 1.0 ml / phút, bước sóng phát 254 nm Phương pháp phân tích có độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, giới hạn phát giới hạn định lượng phù hợp để xác định paraben có mỹ phẩm Bằng phương pháp này, xác định paraben 07 mẫu mỹ phẩm (gồm 04 mẫu kem dưỡng da, 03 mẫu son mơi) có mặt thị trường tỉnh Thái Nguyên Kết có 02 mẫu chứa MP PP, 04 mẫu chứa MP 01 mẫu chứa PP Từ khóa: paraben, methylparaben, propylparaben, mỹ phẩm Ngày nhận bài: 12/10/2018; Ngày hoàn thiện: 13/01/2019; Ngày duyệt đăng: 31/01/2019 DETERMINATION OF PARABENS IN COSMETIC PRODUCTS BY HIGH PERFOMANCE LIQIUD CHROMATOGRAPHY Nguyen Thi Hong Hanh*, Bui Thi Thanh Cham, Bui Thi Luyen University of Medicine and Pharmacy - TNU ABSTRACT In order to contribute and detection of substances not banned in cosmetics, we have developed to determined some parabens by high-performance liquid chromatography (HPLC) in lotion, lip balm The samples have dissolved by methanol : water (50:50), filted and eluted by highperformance liquid chromatography, reverse phase column chromatography column (C8, 150 mm x 4.6 mm, µm), methanol / water mobile phase (60:40 v / v) flow rate is 1.0 ml / min, detection wavelength is 254 nm The analytical method has specificity, linearity, accuracy, repeatability, limit of detection, LOD and limit of quantitation, LOQ suitability for determining parabens in cosmetics By this method, we have successfully applied to identify parabens in 07 cosmetic samples (including 04 samples of skin lotion, 03 sample of lipstick) have been in Thai Nguyen province There were 02 samples containing both MP and PP, 04 samples containing only MP and 01 sample containing only PP Key words: parabens, methylparaben, propylparaben, cosmetic Received: 12/10/2018; Revised: 13/01/2019; Approved: 31/01/2019 * Corresponding author: Tel: 0985 810888; Email: hanhnguyen1388@gmail.com http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn 181 Nguyễn Thị Hồng Hạnh Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN 194(01): 181 - 187 ĐẶT VẤN ĐỀ Hóa chất, chất chuẩn: Paraben ester acid 4-hydroxy benzoic Trước đây, paraben chấp nhận phương thức rẻ tiền thiếu để kiềm chế phát triển vi khuẩn, lên men nấm mốc sản phẩm mỹ phẩm chăm sóc sắc đẹp cá nhân bao gồm: kem dưỡng da, kem dưỡng thể, sữa rửa mặt, dầu gội đầu, dầu xả, gel cạo râu, kem chống nắng, Dù chưa có đủ chứng để khẳng định nhiều nghiên cứu paraben sử dụng phổ biến cơng nghiệp sản xuất mỹ phẩm có liên quan đến ung thư, đặc biệt ung thư vú phụ nữ thường xuyên dùng mỹ phẩm [5], [6] Vì vậy, dựa kết họp định kì Hội đồng mỹ phẩm ASEAN 21, Cục quản lý dược ban hành công văn 6577/QLD-MP cập nhật quy định chất dùng mỹ phẩm Trong có loại paraben không dùng mỹ phẩm isopropylparaben, isobutylparaben, benzylparaben, phenylparaben, pentylparaben - Các chất chuẩn methylparaben propylparaben Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Nhằm mục đích kiểm sốt chất lượng chất bảo quản nói sản phẩm mỹ phẩm, nghiên cứu xây dựng quy trình xác định số chất bảo quản paraben (methylparaben (MP) propylparaben (PP)) phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) áp dụng quy trình xây dựng để xác định chúng số đối tượng mỹ phẩm (sữa rửa mặt, kem dưỡng da, tẩy trắng da, tái tạo da, trị nám, trị mụn,…) lưu hành địa bàn tỉnh Thái Nguyên - Hóa chất (Merck): ethanol, acid sulfuric, methanol, acetonitril, tetrahydrofuran,… Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: Phương pháp nghiên cứu xây dựng, thẩm định áp dụng để xác định MP PP số mẫu mỹ phẩm sữa rửa mặt, kem dưỡng da, son môi, Phương pháp nghiên cứu: Xây dựng phương pháp định lượng: - Khảo sát phương pháp chiết tách MP PP từ mẫu mỹ phẩm khác nhau: cách phân tán mẫu, lựa chọn dung mơi, điều kiện thích hợp, phương pháp chiết lỏng rắn, - Điều kiện sắc ký: Tham khảo điều kiện phương pháp hòa hợp ASEAN [1] để lựa chọn chương trình sắc ký cho phù hợp với điều kiện thực tế phòng thí nghiệm Phương pháp nghiên cứu Điều kiện sắc ký THỰC NGHIỆM Sau trình khảo sát: thành phần pha động, tỉ lệ dung môi hữu cơ, nhiệt độ cột, tốc độ dòng, chương trình sắc ký để định lượng MP PP mẫu mỹ phẩm xây dựng sau: Pha động: Methanol – Nước (60:40) Điều kiện sắc ký: Cột sắc ký pha đảo C8 (150 mm × 4,6 mm) nhồi octylsilan (5µm) Thiết bị, dụng cụ, chất chuẩn đối chiếu, hóa chất: Detector quang phổ hấp thụ tử ngoại đặt bước sóng 254 nm Thiết bị, dụng cụ: Tốc độ dòng: ml/phút Thể tích tiêm: 20 µl Phương pháp xử lý mẫu Dung dịch chuẩn: cân xác khoảng 0,01 mg MP PP chuẩn vào bình định mức dung tích 100 ml, thêm methanol vừa đủ 100 ml Lọc qua màng lọc 0,45 µm - Máy sắc ký lỏng hiệu cao Hitachi LaChrom Elite L-2400 UV Detectors - Cột sắc ký RESTEK C8 (150 mm ì 4,6 mm; àm) - Cõn phân tích Precisa XB 220A - Các dụng cụ thủy tinh cần thiết 182 http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn Nguyễn Thị Hồng Hạnh Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN Dung dịch thử: Cân xác khoảng 0,5g mẫu thử vào bình định mức 50ml, thêm 1ml acid H2SO4 2M 25 ml methanol Lắc siêu âm 10 phút, thêm nước vừa đủ 50 ml dung dịch Lắc đều, lọc qua giấy lọc lọc qua màng lọc 0,45μm để tiêm sắc ký (dung dịch sử dụng vòng 24 giờ) Phương pháp định lượng - Xây dựng phương pháp định lượng HPLC: Khảo sát pha động, tốc độ dòng, thể tích tiêm - Thẩm định phương pháp xây dựng: độ đặc hiệu,tính thích hợp hệ thống, độ thu hồi lặp lại, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, tính tuyến tính [1], [2] - Ứng dụng để phân tích số mẫu mỹ phẩm có địa bàn tỉnh Thái nguyên Thẩm định phương pháp: Thẩm định chỉ: tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, độ tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, giới hạn phát giới hạn định lượng KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Xây dựng phương pháp phân tích: Lựa chọn điều kiện sắc ký: Chọn bước sóng phát hiện: Trên sở tham khảo tài liệu [3, 4, 5, 6], xác định bước sóng thích hợp để phát MP PP, tiến hành quét phổ UV dung dịch MP PP 50 μg/ml máy quang phổ UV-vis Kết cực đại hấp thụ dung dịch 254 nm Pha động: dựa vào tài liệu tham khảo điều kiện phòng thí nghiệm, lựa chọn hệ dung môi methanol: nước khảo sát với tỉ lệ khác - Methanol: nước = 50:50: đường nhiễu, pic MP PP không cân xứng - Methanol: nước = 60:40: pic chất cân đối, chân pic gọn - Methanol: nước = 40:60: pic chất rửa giải sớm, chân pic doãng Như tỉ lệ pha động tốt methanol: nước = 60:40 Tốc độ dòng: khảo sát tốc độ 0,5 http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn 194(01): 181 - 187 ml/ phút; 1,0 ml/ phút; 1,5 ml/ phút nhận thấy: với tốc độ dòng ml/ phút thời gian lưu chất phân tích ngắn áp suất khơng q lớn Thể tích tiêm mẫu: tiêm 20 µl cho pic chất phân tích gọn so với tiêm 15µl Từ khảo sát trên, chúng tơi xây dựng quy trình sắc kí có khả phân tích MP PP sau: Cột sắc ký pha đảo C8 (150 mm × 4,6 mm) nhồi octylsilan (5µm); pha động: methanol – nước (60:40); detector quang phổ hấp thụ tử ngoại đặt bước sóng 254 nm; tốc độ dòng: ml/phút; thể tích tiêm: 20 µl Khảo sát quy trình xử lý mẫu: Sau trình khảo sát sơ số dung mơi hòa tan mẫu nước, ethanol, methanol, acetonitril, ethanol - nước, methanol - nước, acetonitril - nước, nhận thấy hỗn hợp dung môi methanol nước (50 : 50) hệ dung mơi phù hợp, hòa tan hoạt chất cần phân tích, lẫn tạp chất loại nhiều thành phần khác có mẫu, cho pic MP PP cân đối Quy trình xử lý mẫu tiến hành sau: Cân xác khoảng 0,5 g mẫu thử vào bình định mức 50 ml, thêm 1ml acid H2SO4 2M 25 ml methanol Lắc siêu âm 10 phút, thêm nước vừa đủ 50 ml dung dịch Lắc đều, lọc qua giấy lọc lọc qua màng lọc 0,45 μm để tiêm sắc ký (dung dịch sử dụng vòng 24 giờ) Thẩm định phương pháp: 2.1 Tính đặc hiệu: Với điều kiện sắc ký mục 1.1, tiến hành tiêm vào hệ thống sắc ký dung dịch sau: - Dung môi pha mẫu - Dung dịch chuẩn: Dung dịch chuẩn hỗn hợp MP PP dung mơi pha mẫu có nồng độ khoảng μg/ml - Dung dịch thử: Cân xác khoảng 0,5 g mẫu mỹ phẩm (son kem dưỡng da) tiến hành xử lý mẫu theo quy trình nêu mục Hóa chất 183 Nguyễn Thị Hồng Hạnh Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN 194(01): 181 - 187 B A C D Hình Kết đánh giá tính đặc hiệu với MP PP A: Sắc ký đồ dung môi pha mẫu; B: Sắc ký đồ mẫu chuẩn MP PP; C, D: Sắc ký đồ mẫu thử Kết thu cho thấy: sắc ký đồ dung môi pha mẫu (A) không xuất pic nào; sắc ký đồ dung mơi pha mẫu có thêm hỗn hợp chuẩn MP PP (B) xuất rõ ràng pic MP PP có thời gian lưu tương ứng khoảng phút phút; sắc ký đồ mẫu thử C D xuất rõ ràng pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu MP PP tách xa Như vậy, phương pháp nghiên cứu có tính đặc hiệu MP PP Tính tương thích hệ thống: Tính tương thích hệ thống đánh giá thông qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) thời gian lưu diện tích pic thu sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ methylparaben propylparaben khoảng μg/ml Tiến hành sắc ký theo điều kiện mục 1.1, ghi lại sắc ký đồ diện tích pic MP PP Kết thu cho thấy: phương pháp phân tích MP PP với điều kiện sắc ký chọn có tính tương thích hệ thống tốt với RSD thời gian lưu diện tích pic MP PP nhỏ 0,2% (RSD thời gian lưu tương ứng 184 0,09% 0,13%, RSD diện tích pic tương ứng 0,1% 0,09%) Bên cạnh đó, số đĩa lý thuyết (tương ứng 3744 7171), hệ số bất đối pic MP (1,05) PP (1,06), độ phân giải pic MP với pic PP (bằng 17,12) đạt yêu cầu theo quy định phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (Bảng 1) Bảng Kết khảo sát độ thích hợp hệ thống sắc ký STT Thông số Kết MP PP Thời gian lưu (tR) (phút) 4,004 6,47 RSD thời gian lưu (%) 0,09 0,13 RSD diện tích pic (%) 0,10 0,09 RSD chiều cao pic (%) 0,12 0,11 Số đĩa lý thuyết 3744 7171 Hệ số đối xứng 1,05 1,06 Khoảng nồng độ tuyến tính: Để đánh giá khoảng nồng độ tuyến tính phương pháp, chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn có nồng độ MP PP xác khoảng 1; 2; 4; 8; 16 μg/ml dung môi pha mẫu, lọc qua màng lọc 0,45μm Tiến hành sắc ký mục 1.1, ghi lại sắc ký đồ diện tích pic MP PP, thu phương trình hồi quy tuyến tính đồ thị http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn Nguyễn Thị Hồng Hạnh Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 194(01): 181 - 187 2500000 Diện tích 2000000 y = 140355x + 14641 R² = 0.9979 1500000 S MP y = 119764x - 21579 R² = 0.9995 1000000 500000 S PP Linear (S MP) Linear (S PP) 0 10 15 20 Nồng độ Hình Đường hồi quy tuyến tính diện tích pic nồng độ MP PP Bảng Kết khảo sát độ lặp lại độ phương pháp Lượng mẫu (g) 0,5011 0,5025 0,5021 0,5018 0,5002 0,5019 Lượng thêm vào (μg/ml) MP PP 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 Lượng tìm thấy (μg/ml) MP 9,892 9,761 9,605 9,783 9,911 9,913 Từ kết thu được, tính tốn xử lý số liệu phương pháp hồi quy tuyến tính (bình phương tối thiểu) để xác định khoảng tuyến tính phương pháp, kết minh họa Hình Kết thu cho thấy: khoảng nồng độ khảo sát có phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ diện tích pic MP PP với nồng độ MP PP với hệ số tương quan R tương ứng 0,9989 0,9997 Độ lặp lại độ đúng: Việc đánh giá độ lặp lại độ phương pháp thực đồng thời mẫu kem dưỡng da thêm chuẩn MP PP Độ lặp lại phương pháp đánh giá thông qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) kết hàm lượng MP PP lần phân tích độc lập mẫu thêm chuẩn Độ phương pháp đánh giá cách so sánh lượng MP PP tìm lại mẫu thêm chuẩn so với lượng MP PP cho vào ban đầu http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn PP 9,946 9,852 9,788 9,802 10,149 9,965 Tỷ lệ thu hồi (%) MP PP 98,92 99,46 97,61 98,52 96,05 97,88 97,83 98,02 99,11 101,49 99,13 99,65 Số liệu thống kê MP: XTB = 98,11% RSD = 1,21% PP: XTB = 99,50% RSD = 1,35% Cân xác khoảng 0,5g mẫu với lần cân khác từ mẫu kem dưỡng da không chứa MP PP (KD), thêm xác khoảng 200 μg chất chuẩn MP PP vào mẫu thử, trộn tiến hành xử lý mẫu theo quy trình nêu mục 1.2 Tiến hành sắc ký theo điều kiện mục 1.1, ghi lại sắc ký đồ diện tích pic MP PP Song song tiến hành với dãy mẫu chuẩn MP PP (khơng có mẫu) điều kiện có nồng độ MP PP xác khoảng 4; 8; 16; 32 64 μg/ml dung môi pha mẫu Từ diện tích pic mẫu chuẩn, mẫu thử thu hàm lượng chất chuẩn MP PP, tính tốn xử lý số liệu Kết khảo sát độ lặp lại độ phương pháp trình bày Bảng Kết thu cho thấy: với điều kiện sắc ký chọn, kết lần định lượng MP PP mẫu mỹ phẩm thêm chuẩn cho độ lặp lại tương đối tốt Như vậy, phương pháp phân tích có độ lặp lại chấp nhận 185 Nguyễn Thị Hồng Hạnh Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN với mẫu mỹ phẩm có phức tạp Kết thu cho thấy: phương pháp xác định MP PP nghiên cứu có độ tốt (tỷ lệ tìm lại MP nằm khoảng 96,05% ÷ 99,13%; tỷ lệ tìm lại PP nằm khoảng 97,88% ÷ 101,49%) Giới hạn phát giới hạn định lượng: Pha loãng dung dịch chuẩn MP PP dung môi pha mẫu đến nồng độ thấp mà 194(01): 181 - 187 tín hiệu máy đáp ứng (gấp lần so với nhiễu đường nền) để xác định giới hạn phát (LOD) phương pháp LOD xác định 0,001 μg/ml MP 0,01 μg/ml PP Kết xác định LOD minh họa Hình Từ xác định giới hạn định lượng 0,003 μg/ml với MP 0,03 μg/ml với PP Hình Kết xác định giới hạn phát A: Sắc ký đồ mẫu chuẩn MP PP có nồng độ 0,01 μg/ml; B: Sắc ký đồ mẫu chuẩn MP PP có nồng độ 0,001 μg/ml Áp dụng phương pháp để phân tích số mẫu mỹ phẩm thực tế: Với quy trình xây dựng được, áp dụng để phát định lượng MP PP 05 mẫu mỹ phẩm (gồm 03 mẫu son, 04 mẫu kem dưỡng da) có mặt thị trường Thái Nguyên Kết thu Bảng cho thấy: có 02 mẫu chứa MP PP, 04 mẫu chứa MP 01 mẫu chứa PP TT Bảng Kết xác định MP PP mỹ phẩm Hàm lượng (mg/g) (*) Tên mẫu MP PP Son dưỡng môi Lipice 0,138 Son dưỡng môi DHC 0,225 Son L’Ocean 0,286 Kem nẻ Valentine Thái Dương 0,463 Kem nẻ Nivea 0,121 Kem Nghệ Thái Dương 0,519 0,341 Kem nẻ bubchen 0,302 0,620 Ghi chú: (-): khơng phát KẾT LUẬN - Quy trình phân tích MP PP mỹ phẩm xây dựng bao gồm phương pháp xử lý mẫu phương pháp phân tích HPLC Qua khảo sát, chọn dung môi pha mẫu methanol- nước (50 : 50), điều kiện phân tích sắc ký lỏng hiệu cao phù hợp cột, pha 186 http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn Nguyễn Thị Hồng Hạnh Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN động, detector, tốc độ dòng, thể tích tiêm mẫu cho phép phân tích MP PP mỹ phẩm với giới hạn phát nhỏ - Phương pháp xây dựng thẩm định đầy đủ tiêu tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại, độ đúng, đáp ứng yêu cầu phân tích MP PP mẫu mỹ phẩm - Phương pháp áp dụng để phân tích MP PP 07 mẫu mỹ phẩm (gồm 04 mẫu kem dưỡng da 03 mẫu son) có mặt thị trường tỉnh Thái Nguyên Khuyến nghị: Phát triển phương pháp xây dựng để tiến hành định lượng nhiều chất cấm có mỹ phẩm mở rộng thêm đối tượng nghiên cứu địa bàn tỉnh Thái Nguyên TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Tử An (2010), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất Y học, Hà Nội http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn 194(01): 181 - 187 ASEAN (2005), Identification and Determination of 2-phenoxy-ethanol, methyl, ethyl, prpyl, and butyl 4-hydroxybenzoate in cosmetic products by TLC and HPLC, pp 1-10 Xiaoyun Ye, Zsuzsanna Kuklenyik, (2006), “Quantification of the urinary concentrations of parabens in humans by on-line solid phase extraction-high performance liquid chromatography–isotope dilution tandem mass spectrometry”, Journal of Chromatography B, 844, pp 53–59 Rebbeck C et al (2006), “Solid-Phase Extraction and HPLC Analysis of Methylparaben and Propylparaben in a Concentrated Antibiotic Suspension”, Drug Development and Industrial Pharmacy, 32, pp.1095–1102 Irena Baranowska, Iwona Wojciechowska, (2013), “The Determination of Preservatives in Cosmetics and Environmental Waters by HPLC”, Pol J Environ Stud., Vol 22, No 6, pp 16091625 Archana Jain, Soumitra Soni, (2015), “Determination of Parabens in Cosmetics by Liquid-Phase Microextractions and HighPerformance Liquid Chromatography–Diode Array Detection”, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 38, pp 82–91 187 188 http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn ... quy trình xác định số chất bảo quản paraben (methylparaben (MP) propylparaben (PP)) phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) áp dụng quy trình xây dựng để xác định chúng số đối tượng mỹ phẩm (sữa... họp định kì Hội đồng mỹ phẩm ASEAN 21, Cục quản lý dược ban hành công văn 6577/QLD-MP cập nhật quy định chất dùng mỹ phẩm Trong có loại paraben không dùng mỹ phẩm isopropylparaben, isobutylparaben,... Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: Phương pháp nghiên cứu xây dựng, thẩm định áp dụng để xác định MP PP số mẫu mỹ phẩm sữa rửa mặt, kem dưỡng da, son môi, Phương pháp nghiên