Nghiên cứu điều kiện tách chiết alkaloid từ cây ích mẫu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - NGUYỄN VĂN TÙNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT ALKALOID TỪ CÂY ÍCH MẪU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Cơng nghệ thực phẩm Lớp : 48 Cơng nghệ thực phẩm Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2016 - 2020 Người hướng dẫn : TS Vũ Thị Hạnh Người hướng dẫn : TS Trần Văn Chí Thái Nguyên, năm 2020 i LỜI CẢM ƠN Lời xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, phòng ban liên quan, Ban Chủ Nhiệm khoa CNSH – CNTP giảng dạy, hướng dẫn để tơi có kiến thức ngày hơm Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh cố gắng nỗ lực thân nhận giúp đỡ nhiều cá nhân tập thể Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Vũ Thị Hạnh, TS Trần Văn Chí ThS Lưu Hồng Sơn Khoa CNSH – CNTP, người tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo Khoa CNSH – CNTP giúp đỡ thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ bạn nhóm sinh viên thực tập phịng thí nghiệm Khoa CNSH – CNTP giúp đỡ suốt q trình thực đề tài Tơi xin cảm ơn Khoa CNSH – CNTP cung cấp địa điểm thực tập cho tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Dù cố gắng nhiều, xong khóa luận khơng thể tránh khỏi thiếu sót hạn chế Kính mong nhận chia sẻ ý kiến đóng góp q báu thầy, giáo bạn Thái Nguyên, ngày tháng 07 năm 2020 Sinh viên Nguyễn Văn Tùng ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT vi Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát .2 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.4 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học .2 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan nguyên liệu ích mẫu 2.1.1 Nguồn gốc, đặc điểm, phân bố ích mẫu 2.2.2 Thành phần hóa học ích mẫu 2.2.3 Công dụng 2.2 Tổng quan nhóm hoạt chất alkaloid 17 2.2.1 Khái niệm tạo thành alkaloid 17 2.2.2 Phân loại 18 2.2.3 Tính chất 19 2.2.4 Tác dụng 20 2.2.5 Phương pháp tách chiết 20 2.3 Tình hình nghiên cứu nước giới .21 2.3.1 Trên giới 21 2.3.1 Trong nước 23 iii Phần ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 24 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24 3.1.2 Dụng cụ, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 24 3.1.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 25 3.2 Nội dung nghiên cứu 26 3.3 Phương pháp nghiên cứu .26 3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 26 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện tách chiết thu dịch chiết tổng từ ích mẫu 33 4.1.1 Khảo sát mợt số yếu tố ảnh hướng tới q trình tách chiết nhóm hợp chất alkaloid từ ích mẫu .33 4.2 Tối ưu trình tách chiết 36 4.2.1 Kết tối ưu hóa q trình tách chiết alkaloid từ ích mẫu 36 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Kết nghiên cứu tác dụng leonurine tử cung chuột sống cô lập Bảng 2.2 Tác dụng tử cung phần chiết từ ích mẫu Bảng 2.3 Tác dụng bảo vệ tim mạch máu phân đoạn chiết xuất từ ích mẫu 11 Bảng 2.4 Tác dụng nhóm hoạt chất alkaloid người 20 Bảng 2.5 Một số hợp chất phân lập xác định từ ích mẫu 22 Bảng 3.1 Hóa chất sử dụng thí nghiệm 24 Bảng 3.2 Dụng cụ, thiết bị sử dụng thí nghiệm 25 Bảng 3.3 Bảng mã hóa điều kiện tối ưu .31 Bảng 3.4 Ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố hàm lượng alkaloid dịch chiết ích mẫu .31 Bảng 4.1 Kết khảo sát ảnh hưởng loại dung môi chiết đến hàm lượng alkaloid 33 Bảng 4.2 Kết khảo sát cứu ảnh hưởng nồng độ dung môi đến hàm lượng alkaloid 34 Bảng 4.3 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết đến hàm lượng alkaloid 35 Bảng 4.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ dung môi nguyên liệu đến hàm lượng alkaloid 36 Bảng 4.5 Kết ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố chiết 37 alkaloid từ ích mẫu .37 Bảng 4.6 Kết ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố chiết alkaloid từ ích mẫu 38 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Hình ảnh ích mẫu - Susan Kelley Hình 3.1 Sơ đồ quy trình tách chiết hoạt chất alkaloid từ ích mẫu 32 Hình 4.1 Bề mặt đáp ứng hàm lượng alkaloid 39 Hình 4.2 Hàm kỳ vọng điều kiện tối ưu hàm lượng alkaloid 39 vi DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Cs Cợng Ct Cơng thức TN Thí nghiệm NXB Nhà xuất H Giờ G Gam V Thể tích W Khối lượng Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới với nguồn dược liệu phong phú đa dạng Hệ thực vật Việt Nam có 10.000 lồi có khoảng 3.200 lồi thuốc Mặc dù loại thuốc tây y chiếm một phần lớn phương pháp điều trị bệnh thuốc có nguồn gốc thảo dược đứng mợt vị trí quan trọng Cả Việt Nam giới dược liệu đối tượng nghiên cứu nhiều tác giả mục đích tìm kiếm chất có hoạt tính sinh học ngun liệu chữa bệnh [10] Việc nghiên cứu thành phần công dụng thuốc dược liệu giúp nhà khoa học giải thích cơng dụng thuốc dân gian, tìm hiểu sâu sử dụng hiệu nguồn dược liệu có sẵn đồng thời thúc đẩy ngành sản xuất dược liệu nói riêng ngành y học nói chung phát triển Cây ích mẫu tên khoa học Leonurus japonicus Houtt., họ Bạc hà (Lamiaceae) [1], hạt gọi sung úy tử [2] Trong y học cổ truyền ích mẫu một dược liệu biết đến từ lâu dùng mợt vị thuốc có khả hỗ trợ người bị đau bụng kinh Hiện có khoảng 140 thành phần hóa học phân lập xác định từ ích mẫu bao gồm alkaloid, diterpenoid, flavonoid, phenylethanoid glycoside một số dầu béo [30] Hàm lượng alkaloid toàn phần khoảng 0,1% - 2,65%, cao non [29]; có leonuridin, leonurine, leonurinin, stachydrin alkaloid nghiên cứu đầy đủ, có tác dụng sinh học tốt sử dụng để giám sát chất lượng vị thuốc [30] Đặc biệt nghiên cứu giới chứng minh leonurine có nhiều tác dụng với sức khỏe Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nước tách chiết hàm lượng hoạt chất sinh học từ ích mẫu Vị thuốc ích mẫu chưa ứng dụng nhiều đời sống hàng ngày Xuất phát từ thực tế đó, tơi thực đề tài “Nghiên cứu điều kiện tách chiết alkaloid từ ích mẫu” một hướng đầy triển vọng 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Xây dựng quy trình tối ưu hóa điều kiện tách chiết hoạt chất alkaloid từ ích mẫu 1.2.2 Mục tiêu cụ thể Nghiên cứu lựa chọn điều kiện tách chiết thu dịch chiết tổng từ ích mẫu Tối ưu hóa mợt số điều kiện q trình tách chiết hoạt chất 1.4 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học Xây dựng quy trình tối ưu hóa điều kiện tách chiết hoạt chất có ích mẫu với số liệu xác Giúp sinh viên củng cố hệ thống lại kiến thức học, ứng dụng lý thuyết vào thực tiễn, nâng cao lực nghiên cứu kỹ phân tích phịng thí nghiệm Cung cấp thơng tin, tư liệu làm sở cho việc nghiên cứu sau phục vụ cho nghiên cứu có liên quan 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Nhằm giúp cho việc ứng dụng ích mẫu phạm vi rộng một cách khoa học vấn đề chăm sóc sức khỏe Nâng cao giá trị ích mẫu từ nâng cao đời sống người trồng thảo mộc người sản xuất chế phẩm Là sở cho thử nghiệm sử dụng thuốc ích mẫu y học, dược học đời sống người Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan nguyên liệu ích mẫu 2.1.1 Nguồn gốc, đặc điểm, sự phân bố ích mẫu Hình 2.1 Hình ảnh ích mẫu - Susan Kelley Nguồn gốc: Ích Mẫu hay cịn gọi Sung Uý, Chói Đèn, Làm Ngài, Xác Điến (Tày), Chạ Linh Lo (Thái) Tên khoa học Leonurus japonicas Houtt., thuộc họ hoa mơi (Lamiaceae) [1] Đặc điểm hình thái: Ích mẫu mợt lồi cỏ, sống – năm, cao 0,6 – m Thân đứng, hình vng, thẳng xốp, có rãnh dọc, đường kính 0,2 – 0,8 cm, phân nhánh, tồn thân có phủ lơng nhỏ ngắn [1] Lá mọc đối chữ thập, tùy theo mọc gốc, thân hay đầu cành mà có hình dạng khác nhau: - Lá gốc có cuống dài, phiến xẻ sâu, mép có cưa thơ sâu 34 C2H5OH đạt 1,31 g, CH3OH đạt 1,15 g hàm lượng alkaloid thấp chiết với dung môi H2O đạt 0,98 g Theo nghiên cứu có liên quan tác giả Liu cợng - Đại học Hebei (2011) [20] nhóm tác giả Liang cộng (2011) [18] sử dụng C2H5OH dung môi tách chiết alkaloid ích mẫu Vì vậy, dung mơi C2H5OH thích hợp để thực trình tách chiết alkaloid từ ích mẫu Kết sử dụng cho thí nghiệm 4.1.1.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ dung môi chiết đến hàm lượng alkaloid Mức đợ hịa tan mợt chất hệ dung mơi khác khác Mợt chất hịa tan mợt loại dung mơi ngun chất lại hịa tan tốt hệ dung mơi bậc Nồng đợ ethanol ảnh hưởng đến khả hịa tan alkaloid Vì để xác định nồng đợ ethanol thích hợp chúng tơi tiến hành sau: Thí nghiệm chúng tơi tiến hành với công thức nồng độ ethanol 60%, 70%, 80%, 90% thời gian 24 giờ, nhiệt độ phịng tỉ lệ dung mơi/ngun liệu 2/1 ml/g, sau xác định hàm lượng alkaloid, kết thu biểu diễn bảng 4.2: Bảng 4.2 Kết khảo sát cứu ảnh hưởng nồng độ dung môi đến hàm lượng alkaloid Nồng độ Hàm lượng alkaloid (%) (g/100g) CT1 60 1,14c CT2 70 1,31b CT3 80 1,63a CT4 90 1,29b Công thức Ghi chú: Các chữ cột biểu thị sai khác có ý nghĩa thống kê mức α=0,05 Từ kết bảng 4.2 cho thấy chiết nồng độ khác cho hàm lượng alkaloid khác hàm lượng alkaloid bắt đầu tăng lên chiết nồng độ từ 60% đến 70% Hàm lượng alkaloid đạt cao nồng độ ethanol 80% tương ứng với hàm lượng alkaloid đạt 1,63 g Tiếp tục tăng nồng độ ethanol lên 35 90% hàm lượng alkaloid giảm xuống 1,29 g Do vậy, nồng đợ ethanol 80% thích hợp để thực trình tách chiết alkaloid từ ích mẫu Kết sử dụng cho thí nghiệm 4.1.1.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết đến hàm lượng alkaloid Thời gian chiết một yếu tố ảnh hưởng lớn tới hàm lượng alkaloid Nếu thời gian chiết kéo dài khơng hàm lượng alkaloid giảm mà cịn làm tăng lượng tạp chất trình chiết Nhưng thời gian chiết ngắn khơng đủ cho hàm lượng alkaloid hịa tan hết cịn có bã gây tổn thất lớn Do cần phải xác định thời gian chiết tối ưu Kết biểu diễn bảng sau: Bảng 4.3 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết đến hàm lượng alkaloid Thời gian chiết Hàm lượng alkaloid (giờ) (g/100g) CT1 20 1,13d CT2 22 1,23c CT3 24 1,64a CT4 26 1,32b Công thức Ghi chú: chữ số cột biểu thị sai khác có ý nghĩa thống kê mức α=0,05 Từ bảng 4.3 ta thấy thời gian tách chiết có ảnh hưởng đến q trình chiết tách alkaloid từ ích mẫu Ta nhận thấy hàm lượng alkaloid tăng tăng thời gian chiết từ 20 đến 22 Tiếp tục tăng thời gian chiết lên 24 hàm lượng alkaloid tiếp tục tăng từ 1,23 g lên 1,64 g Tuy nhiên tăng thời gian chiết lên 26 hàm lượng alkaloid giảm xuống 1,32 g Khi chiết thời gian 24 cho hàm lượng alkaloid cao Nghiên cứu Trần Thị Văn Thi cộng (2011) [8], nghiên cứu tách chiết alkaloid cho thời gian tách chiết tương đồng với kết thí nghiệm chúng tơi Vì chúng tơi chọn thời gian chiết thích hợp 24 Kết sử dụng cho thí nghiệm 36 4.1.1.4 Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng alkaloid Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu ảnh hưởng tới hàm lượng alkaloid thu Nếu lượng dung mơi q khơng đủ để hịa tan, chiết rút cấu tử bên ngồi mơi trường, đủ làm ướt nguyên liệu Nếu dùng lượng dung mơi lớn gây lãng phí, tốn dung mơi, chi phí cao Thí nghiệm tiến hành để khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng alkaloid thu tìm tỉ lệ dung mơi/ngun liệu tốt cho q trình chiết Thí nghiệm tiến hành với công thức tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 2/1, 4/1, 6/1, 8/1, thời gian 24 nhiệt đợ phịng, sau xác định hàm lượng alkaloid, kết thu biểu diễn bảng 4.4: Bảng 4.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ dung môi nguyên liệu đến hàm lượng alkaloid Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu Hàm lượng alkaloid (ml/g) (g/100g) CT1 2/1 1,65c CT2 4/1 1,87b CT3 6/1 2,1a CT4 8/1 2,12a Công thức Ghi chú: Các chữ cột biểu thị sai khác có ý nghĩa thống kê mức α=0,05 Từ bảng 4.4 ta thấy tỷ lệ dung môi/nguyên liệu có ảnh hưởng tới hàm lượng alkaloid chiết từ ích mẫu Hàm lượng alkaloid dịch chiết tăng lên tỷ lệ: dung môi/nguyên liệu tăng Từ tỷ lệ 2/1 đến 6/1, hàm lượng alkaloid tăng từ 1,65 g lên 2,1 g, công thức tỷ lệ 6/1 8/1 khơng có sai khác có ý nghĩa thống kê giá trị trung bình Vì chúng tơi chọn tỷ lệ dung mơi/ngun liệu thích hợp 6/1 để tránh lãng phí, tiết kiệm dung mơi 4.2 Tối ưu trình tách chiết 4.2.1 Kết tối ưu hóa q trình tách chiết alkaloid từ ích mẫu Sử dụng phương pháp bề mặt tiêu theo thiết kế thí nghiệm Box- 37 Behnken với ba biến ba cấp độ Các số liệu thu từ dịch chiết ích mẫu xử lý phần mềm Design- Expert 7.0 (Stat-Ease Inc, Minneapolis, USA) ANOVA dùng để đánh giá cao thu Tiến hành giải toán tối ưu theo phương phá “hàm mong đợi” Sử dụng phần mềm Design-Expert 7.0 để tiến hành tối ưu hóa nhằm xác định giá trị ba yếu tố mà hàm lương alkaloid cao Áp dụng phương pháp phân tích hồi quy số liệu thực nghiệm, thu mơ hình đa thức bậc hai thể hàm lượng alkaloid: Y= +2,07 – 0,078*A + 0,040*B – 0,057*C + 0,035*A*B – 0,010*A*C – (5,000E-0,03)*B*C – 0,014*A2 – 0,015*B2 – 0,53*C2 Trong Y hàm lượng alkaloid dịch chiết dự báo thu Bảng 4.5 Kết ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố chiết alkaloid từ ích mẫu Biến thực TN A (Nồng độ dung môi %) 10 11 12 13 14 15 16 17 70 90 70 90 70 90 70 90 80 80 80 80 80 80 80 80 80 B (Thời gian chiết – giờ) 22 22 26 26 24 24 24 24 22 26 22 26 24 24 24 24 24 C (Tỷ lệ DM/NL) 6/1 6/1 6/1 6/1 4/1 4/1 8/1 8/1 4/1 4/1 8/1 8/1 6/1 6/1 6/1 6/1 6/1 Hàm lượng alkaloid (g/100g) 1,80 1,68 1,82 1,80 1,48 1,46 1,55 1,13 1,39 1,50 1,29 1,39 2,08 2,09 2,10 2,08 2,09 38 Để đánh giá mơ hình chúng tơi sử dụng phân tích ANOVA Kết phân tích ANOVA thể qua bảng sau: Bảng 4.6 Kết ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố chiết alkaloid từ ích mẫu Nguồn SS DF MS Chuẩn F Giá trị p Model 1,63 0,18 101,62 < 0,0001 A 0,42 0,042 23,63 0,0018 B 0,015 0,015 8,61 0,0219 C 0,028 0,028 15,52 0,0056 AB 2,500E-003 2,500E-003 1,41 0,0274 AC 0,040 0,040 22,48 0,0021 BC 2,500E-005 2,500E-005 0,014 0,0909 A2 0,095 0,095 53,42 0,0002 B2 0,11 0,11 62,68 0,0001 C2 1,20 1,20 671,64 < 0,0001 Residual 0,012 1,779E-003 Lack of Fit 0,012 4,058E-003 57,98 0,19 Sai số 2,800E-004 7,000E-005 1,64 16 (pure error) SS tổng Số SS: Tổng phương sai; DF:Bậc tự do; MS: Trung bình phương sai; chuẩn F: Chuẩn Fisher; Residual: Phần dư; “Lack of Fit”: Chuẩn đánh giá độ khơng tương thích mơ hình với thực nghiệm Từ kết phân tích ANOVA ta thấy giá trị xác suất mơ hình P-value = 0,0001