Xây dựng kỹ thuật real time pcr để kiểm tra chất lượng men tiêu hóa chứa lactobacilus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRẦN THỊ TUYẾT DUNG XÂY DỰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR ĐỂ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG MEN TIÊU HÓA CHỨA LACTOBACILLUS Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MS: 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP.HỒ CHÍ MINH, tháng 08, năm 2011 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học : TS BS Phạm Hùng Vân (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét :PGS.TS Nguyễn Thúy Hương (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét : PGS.TS Nguyễn Đức Lượng (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày tháng năm Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Bộ môn quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Bộ môn quản lý chuyên ngành ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Trần Thị Tuyết Dung MSHV: 03137109 Ngày, tháng, năm sinh: 04-03-1982 Nơi sinh: Tây Ninh Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số : 60.42.80 I TÊN ĐỀ TÀI: Xây dựng kỹ thuật real-time PCR để kiểm tra chất lượng men tiêu hóa chứa Lactobacillus II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Xây dựng phương pháp định lượng Lactobacillus acidophilus phương pháp real-time PCR Ứng dụng để kiểm tra chất lượng sản phẩm men tiêu hóa chứa Lactobacillus acidophilus III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : (Ghi theo QĐ giao đề tài) 14/02/2011 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: (Ghi theo QĐ giao đề tài) 01/07/2011 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên): TS.BS Phạm Hùng Vân, Tp HCM, ngày tháng năm 20 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) TS.BS Phạm Hùng Vân TRƯỞNG KHOA….……… (Họ tên chữ ký) Ghi chú: Học viên phải đóng tờ nhiệm vụ vào trang tập thuyết minh LV LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn thầy Phạm Hùng Vân tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn truyền đạt cho em nhiều kiến thức quý báu suốt trình làm đề tài tốt nghiệp Em xin cảm ơn anh, chị bạn Phòng R&D, phịng vi sinh, phịng dịch vụ cơng ty Nam Khoa hỗ trợ tạo điều kiện tốt phƣơng tiện để em hoàn thành đề tài Tp Hồ Chí Minh, tháng 8/2011 Trần Thị Tuyết Dung TÓM TẮT NỘI DUNG Lactobacillus acidophilus thuộc giống Lactobacillus Ngày nay, Lactobacillus acidophilus có vai trị quan trọng mặt cơng nghiệp có nhiều chủng đƣợc biết đến có chức nhƣ probiotic Trong đề tài này, xây dựng kỹ thuật real-time PCR nhằm mục đích phát định lƣợng Lactobacillus acidophilus có số sản phẩm men tiêu hóa đƣợc phân phối thị trƣờng tp.HCM Các mồi đƣợc thiết kế dựa trình tự 16s rRNA đặc hiệu cho Lactobacillus acidophilus Phƣơng pháp định lƣợng Lactobacillus acidophilus có sản phẩm men tiêu hóa đƣợc thực nhanh kết đáng tin cậy, nhằm hƣớng tới mục tiêu đáp ứng yêu cầu phân tích kiểm kiệm việc kiểm soát chất lƣợng sản phẩm ABSTRACT Lactobacillus acidophilus is one of the Lactobacillus genus Lactobacillus acidophilus today have an industrially important role because many strains are known to have propiotic properties In this thesis, we have developed a real-time PCR method for detection and quantification this Lactobacillus species in probiotics samples that being distributed in Ho Chi Minh City market The primers were designed from the sequence of 16S rRNA gene specific for Lactobacillus acidophilus The method was rapid and reliable for the enumeration of the number of Lactobacillus acidophilus in probiotic samples, in order to satisfy with the requirement of testing analysis for the quality control of the products LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Bản luận văn tốt nghiệp công trình nghiên cứu thực cá nhân, đƣợc thực sở nghiên cứu lý thuyết, kiến thức kinh điển, nghiên cứu khảo sát tình hình thực tiễn dƣới hƣớng dẫn khoa học TS.BS Phạm Hùng Vân Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình khác Tp Hồ Chí Minh, tháng 8/2011 Trần Thị Tuyết Dung MỤC LỤC 1.1 Tổng quan chế phẩm probiotic 1.1.1 Khái niệm probiotic 1.1.2 Lịch sử probitics .1 1.1.3 Sản phẩm có bổ sung vi khuẩn probiotic 1.1.4 Cơ chế họat động probiotics .3 1.1.5 Vai trò probiotics 1.1.6 Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả phát triển sống sót vi khuẩn probiotic sữa biện pháp cải thiện 1.1.7 Tình hình sử dụng sản phẩm probiotic 1.2 Tổng quan vi khuẩn Lactobacillus 10 1.2.1 Đặc điểm giống Lactobacillus 10 1.2.2 Phân loại .12 1.2.3 Hoạt động sinh hóa, trao đổi chất vi khuẩn lactic số chủng vi khuẩn lactic điển hình 12 1.3 Tổng quan L acidophilus .14 1.3.1 Phân loại .14 1.3.2 Hình thái .15 1.3.3 Đặc điểm nuôi cấy 16 1.3.4 Đặc điểm sinh hoá .16 1.3.5 Đặc điểm sinh thái .17 1.3.6 Tác dụng L acidophilus probiotic 18 1.4 Tổng quan phƣơng pháp PCR .20 1.4.1 Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction ) .20 1.4.2 Nguyên tắc phƣơng pháp PCR 20 1.4.3 Các tiêu ảnh hƣởng đến phản ứng PCR 22 1.5 Tổng quan Real-time PCR 23 1.5.1 Real-time PCR 23 1.5.2 Các vấn đề kỹ thuật cần thiết real-time PCR 23 1.5.3 Thiết bị 27 1.5.4 Hóa chất thuốc thử cho real-time PCR 28 1.5.5 Giải trình tự 30 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 Trang thiết bị, hóa chất, vật liệu 34 2.1.1 Trang thiết bị, hóa chất 34 2.1.2 Vật liệu 37 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .39 2.2.1 Tăng sinh làm vi khuẩn 39 2.2.2 Phƣơng pháp định lƣợng cấy trải 39 2.2.3 Chiết thô DNA từ vi khuẩn chế phẩm probiotic 39 2.2.4 Thiết kế mồi 43 2.2.5 Bố trí thí nghiệm 43 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 52 3.1 Kiểm tra độ đặc hiệu mồi 52 3.1.1 Kiểm tra độ đặc hiệu mồi L acidophilus 52 3.1.2 Kiểm chứng độ đặc hiệu mồi vi khuẩn L acidophilus 53 3.2 Kiểm tra khả khuếch đại độ tuyến tính hiệu PCR 56 3.3 Thiết lập biểu đồ chuẩn real-time PCR 58 3.4 Đánh giá chất lƣợng chế phẩm men vi sinh chứa L.acidophilus thu thập từ thị trƣờng 60 3.4.1 Kiểm chứng sản phẩm khuếch đại 68 3.4.2 Kiểm tra chất lƣợng sản phẩm men tiêu hóa chứa vi khuẩn sống L acidophilus phƣơng pháp định lƣợng vi sinh truyền thống .71 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75 4.1 Kết luận 75 4.2 Kiến nghị .75 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Phần 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận  Thiết kế đƣợc cặp mồi với độ đặc hiệu cao để khuếch đại đoạn gen mục tiêu thuộc trình tự 16S rRNA đặc hiệu cho L acidophilus  Xác định đƣợc khoảng nhiệt độ chảy DNA: 77÷79oC Điều có ý nghĩa quan trọng; sản phẩm đƣợc khuếch đại cặp mồi I-Acid IS & R-Acid IS, có nhiệt độ chảy khoảng 77÷79oC, kết luận sản phẩm khuếch đại L.acidophilus  Xây dựng thành công kỹ thuật Real-time PCR việc đánh giá chất lƣợng men vi sinh chứa L.acidophilus  Chất lƣợng sản phẩm men tiêu hóa chứa L.acidophilus thị trƣờng: không đạt chất lƣợng vi khuẩn sống L.acidophilus, phần lớn không đạt số lƣợng nhƣ công bố bao bì 4.2 Kiến nghị Do thời gian thực cịn hạn chế, chúng tơi xin có số kiến nghị sau: Cần tiến hành thử nghiệm thống kê thêm mẫu khác nhƣ dạng dịch thể Tiếp tục nghiên cứu thêm phản ứng real-time PCR cho chủng khác thuộc giống Latobacillus 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng (1999), Sinh học phân tử, Nhà xuất giáo dục Huỳnh Quế Trang (2010), xác định số lƣợng vi khuẩn sống Lactobacillus sản phẩm bổ sung vi khuẩn probiotic Lâm Xuân Thanh (2004), Giáo trình cơng nghệ sản phẩm từ sữa, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội Lê Thị Liên Thanh, Lê Văn Hồng (2002), Cơng nghệ chế biến sữa sản phẩm sữa, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội Lê Văn Việt Mẫn (2004), Công nghệ sản xuất sản phẩm từ sữa thức uống, tập 1: Công nghệ sản xuất sản phẩm từ sữa, NXB Đại học Quốc gia TP HCM Phạm Văn Ty, TS Vũ Nguyên Thành, Công nghệ sinh học tập năm Nguyễn Hữu Hiệp, Ứng dụng probiotics sản xuất bảo vệ ngƣời Nguyễn Lân Dũng cộng (1980), vi sinh vật học, tập 2, NXB Đại học trung học chuyên nghiệp Phạm Hùng Vân 2009, PCR Real-time PCR – Các vấn đề áp dụng thƣờng gặp Nhà Xuất Bản Y Học, chi nhánh Thành phố Hồ Chí Minh TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGỒI Abdulamir A S., Yoke T S., Nordin N.and Abu Bakar F, 2009 Detection and quantification of probiotic bacteria using optimized DNA extraction, traditional and real-time PCR methods in complex microbial communities 10 Ana M.P Gomes F Xavier Malcata (1999), Bifidobacterium spp and Lactobacillus acidophilus: biological, biochemical and therapeutical properties relevant for use as probiotics, Tạp chí Trends in food Science & Technology số 10, 139-152 77 11 Anukam K.C., Osazuwa E.O., Osadolor B.E., Bruce A.W Reid G., 2008 Yogurt containing probiotic Lactobacillus rhamnosus GR - and L reuteri RC - 14 helps resolve moderate diarrhea and increases CD4 count in HIV/AIDS patients Journal of Clinical Gastroenterology 42: 239 - 24 da Cruz A.G, Faria J., Van Dender A.G.F., 2007 Review Packaging system and probiotic dairy foods Food Research International 40: 951 - 956 12 Asa ljungh and Torkel Wadstrom, 2009 Lactobacillus molecular biology from genmomics to probiotic, 3-5 13 Beausoleil M., Fortier N., Guénette S., L’Ecuyer A., Savoie A., Franco M., Lachaine J., Weiss K., 2007 Can J Gastroenterol 21: 732 – 736 14 Belen Martın, Anna Jofre, Margarita Garriga, Maria Pla, and Teresa Aymerich, 2006 Rapid Quantitative Detection of Lactobacillus sakei in Meat and Fermented Sausages by Real-Time PCR 15 Bellengier P., Richard J., Foucaud C.,1997.Associative growth of Lactococcus lactis and Leuconostoc mesenteroides strains in milk Journal of Dairy Science 80, 1520 – 15 16 Brady L.J., Gallaher D.D Busta F.F, 2000 The Role of Probiotic Cultures in the Prevention of Colon Cancer The Journal of Nutrition 130: 410S - 414S 17 Dimitris Charalampopoulos Robert A Rastall,2009, prebiotics and probiotics science and technology, 619-620 18 Forchielli M.L Walker W.A., 2005 The role of gut-associated lymphoid tissues and mucosal defence British Journal of Nutrition 93: S41S48 19 Guarino A., Vecchio A.L Canani R.B., 2008 Probiotics as prevention and treatment for diarrhea Current Opinion in Gastroenterology 25: 18 - 23 20 Hattingh A.L., Viljoen B.C., 2001 Yogurt as probiotic carrier food International Dairy Journal 11, - 17 78 21 Hickson M., D’Souza A.L., Muthu N., Rogers T.R., Want S., Rajkumar C., Bulpitt C.J.,2007 “Use of probiotic Lactobacillus preparation to prevent diarrhoea associated with antibiotics: randomised double blind placebo controlled trial” Clinical Research Edition 355(7610), 80 22 I KM, Chandan RC, 1979 Nutritional and healthful aspects of cultured and culture-containing dairy foods Journal of Dairy Science 62: 1685 – 94 23 Isolauri E., 2001 Probiotics in human disease American Journal of Clinical Nutrition 73, 1142 - 1146 24 Johnston B.C., Supina A.L., Vohra S., 2006 Probiotic for pediatric antibiotic- associated diarrhea a meta - analasis of randomized placebo controlled trial Canadian Medical Association 174, 373 - 383 25 Kullisaar T., Zilmer M., Mikelsaar M., Vihalemm T., Annuk H., Kairane C Kilk A., 2002 Two antioxidative lactobacilli strains as promising probiotics The Australian journal of dairy technology 72, 215 - 224 26 Maragkoudakis P.A, Miaris C., Rojez P., Manalis N., Magkanari F., Kalantzopoulos G., Tsakalidou E., 2006 Production of traditional Greek using Lactobacillus strains with probiotic potential as starter adjuncts International Dairy Journal 16, 52–60 27 Mark J Hopkins, George T Macfarlane, Elizabeth Furrie, Alemu Fite, Sandra Macfarlane, 2005 Characterisation of intestinal bacteria in infant stools using real-time PCR and northern hybridisation analyses 28 Marshall V.M., 1992 Inoculated ecosystems in a milk environment Journal of Applied Bacteriology 73, 127S - 135S 29 Monique Haarman and Jan Knol, 2006 Quantitative Real-Time PCR Analysis of Fecal Lactobacillus Species in Infants Receiving a Prebiotic Infant Formula 30 Mortazavian A.M., Ehsani M.R., Mousavi S.M., Sohrabvandi S 79 Reinheimer J.A., 2006 Combined effects of temperature - related variables on the viability of probiotic microorganisms in yogurt The Australian journal of dairy technology 61, 248 – 252 31 Nezami H.S.E., Polychronaki N.N., Ma J., Zhu H., Ling W., Salminen E.K., 2006 Probiotic supplementation reduces a biomarker for increased risk of liver cancer in young men from Southern China American Journal of Clinical Nutrition 83, 1199 – 1203 32 Nguyen T.D., Kang J.H Lee M.S., 2007 Characterization of Lactobacillus plantarum PH04, a potential probiotic bacterium with cholesterol-lowering effects International Journal of Food Microbiology 113: 358 – 361 33 Oliveira R.B.P., Afonso de L Oliveira Glória M.B.A., 2008 Screening of lactic acid bacteria from vacuum packaged beef for antimicrobial activity Brazilian Journal of Microbiology vol 39 34 Richard Walker, Merry Buckley 2006 Probiotic microbes: the scientific basis American Academy of Microbiology, http://www.asm.org 35 Sanders M.E.và Klaenhammer T.R., 2001 Invited Review: The Scientific Basis of Lactobacillus acidophilus NCFM Functionality as a Probiotic The Journal of Nutrition 84, 319 – 331 36 SCD Probiotics 2010 White Paper: Application of SCD Probiotics Technology In Aquaculture SCD Probiotics, www.SCDProbiotics.com 37 Shah N.P., Lankaputhra W.E.V., Britz M Kyle W.S.A., 1995 Survival of Lactobacillus and Bifidobacterium bifidum in commercial yoghurt during refrigerated storage International Dairy Journal 5, 515 – 521 38 Shankar P Davies F., 1976 Associative bacterial growth in yogurt starters, initial observation on stimulatory factors Journal of the Society of Dairy Technology 30, 31 – 32 39 Talwalkar A Kailasapathy K., 2003 A Review of Oxygen 80 Toxicity in Probiotic Yogurts: Influence on the Survival of Probiotic Bacteria and Protective Techniques Comprehensive reviews in food science and food safety 3, 117 – 124 40 The dairy council, 2009 Lactose intolerance The dairy council, 14 41.Vinderola C.G., Mocchiutti P., Reinheimer J.A., 2002 Interactions Among Lactic Acid Starter and Probiotic Bacteria Used for Fermented Dairy Products Journal of Dairy Science 85, 721 – 729 42.Wollowski I., Rechkemmer G Pool-Zobel B.L., 2001 Protective role of probiotics and prebiotics in colon cancer American Journal of Clinical Nutrition 73, 451S - 5S WEBSITE 43 Tự điển Microbe wiki, microbe.kenyon.edu 81 PHỤ LỤC Phụ lục Kết nhuộm gram, quan sát hình thái dƣới kính hiển vi vi sinh vật đƣợc phân lập từ sản phẩm men tiêu hóa Hình thái L acidophilus (chứng +) đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi 82 Hình thái vi khuẩn phân lập từ M5 đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi Hình thái vi khuẩn phân lập từ M6 đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi 83 Hình thái vi khuẩn phân lập từ M7 đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi Hình thái vi khuẩn phân lập từ M10 đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi 84 Hình thái vi khuẩn phân lập từ M13 đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi Hình thái vi khuẩn phân lập từ M14 đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi 85 Hình thái vi khuẩn phân lập từ M15 đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi Phụ lục Kết BLAST search trình tự DNA ngân hàng gene NCBI Kết BLAST search ngân hàng gene NCBI L acidophilus (chứng +) Kết BLAST search ngân hàng gene NCBI M1 Kết BLAST search ngân hàng gene NCBI M2 86 Kết BLAST search ngân hàng gene NCBI M3 Kết BLAST search ngân hàng gene NCBI M4 Kết BLAST search ngân hàng gene NCBI M5 Kết BLAST search ngân hàng gene NCBI M7 Kết BLAST search ngân hàng gene NCBI M8 Kết BLAST search ngân hàng gene NCBI M9 Kết BLAST search ngân hàng gene NCBI M10 87 Kết BLAST search ngân hàng gene NCBI M11 Kết BLAST search ngân hàng gene NCBI M12 Kết BLAST search ngân hàng gene NCBI M13 Kết BLAST search ngân hàng gene NCBI M14 Kết BLAST search ngân hàng gene NCBI M13 88 PHẦN LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: Trần Thị Tuyết Dung Ngày, tháng, năm sinh: 04-03-1982 Nơi sinh: Tây Ninh Địa liên lạc: 731, đƣờng tháng 2, P6, Q10, tp.HCM Q TRÌNH ĐÀO TẠO  2000-2004: theo học chƣơng trình cử nhân Công nghệ sinh học, trƣờng đại học Khoa học tự nhiên tp.HCM  2007-2011: theo học chƣơng trình đào tạo thạc sĩ, chuyên ngành công nghệ sinh học, đại học Bách khoa tp.HCM Q TRÌNH CƠNG TÁC  2005-2006: công ty cổ phần chăn nuôi CP Việt Nam  2006-2009: công ty liên doanh Unilever Việt Nam  2009 đến nay: công ty TNHH Néstle Việt Nam  2011 đến nay: công ty cổ phần Hội Doanh Nhân ... ĐỀ TÀI: Xây dựng kỹ thuật real- time PCR để kiểm tra chất lượng men tiêu hóa chứa Lactobacillus II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Xây dựng phương... tài “ Xây dựng kỹ thuật real- time PCR để kiểm tra chất lƣợng men tiêu hóa chứa Lactobacillus” nhằm đề giải pháp phát định lƣợng Lactobacillus chế phẩm probiotic lƣu hành thị trƣờng Mục tiêu nghiên... Hóa chất thuốc thử cho real- time PCR Chìa khóa kỹ thuật hóa chất thuốc thử có tube phản ứng real- time PCR chất huỳnh quang đƣợc thêm vào PCR mix Chất huỳnh quang phải làm để tube phản ứng phát