Nghiên cứu nhằm mục tiêu trình bày bước đầu sử dụng so sánh với kỹ thuật real time PCR so sánh với nested PCR trong phát hiện và chẩn đoán loài plsamodium spp. Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật giem sa trong sàng lọc bệnh nhân nhiễm KSTSR ở 2 xã Đak Ơ và xã Bù Gia Mập, huyện Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phước.
Trang 1BƯỚC ĐẦU SỬ DỤNG KỸ THUẬT REAL TIME PCR
SO SÁNH VỚI KỸ THUẬT NESTED - PCR TRONG PHÁT HIỆN
VÀ CHẨN ĐOÁN LOÀI PLASMODIUM SPP Phạm Nguyễn Thúy Vy*, Trịnh Ngọc Hải*, Hoàng Thị Mai Anh*, Nguyễn Thị Vân Anh*,
Võ Thế Ngọc Bích*, Nguyễn Thị Minh Châu*
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Phát hiện Plasmodium spp bằng PCR đã tăng độ nhạy và phân biệt các loài, đặc biệt các ca
nhiễm phối hợp chính xác hơn so với kính hiển vi hoặc miễn dịch Tuy nhiên, hầu hết các phương pháp PCR được công bố hiện nay đều đọc kết quả trên gel agrose đòi hỏi kỹ thuật phức tạp chưa tối ưu trong điều trị lâm sàng Gần đây đã áp dụng kỹ thuật Real Time PCR, có độ nhạy cao hơn và thời gian làm việc hiệu quả hơn dùng
để chẩn đoán và phân biệt loài ký sinh trùng sốt rét
Mục tiêu: Bước đầu sử dụng so sánh với kỹ thuật Real Time PCR so sánh với Nested PCR trong phát hiện
và chẩn đoán loài Plsamodium spp
Đối tượng và Phương pháp: Sử dụng kỹ thuật Giem sa trong sàng lọc bệnh nhân nhiễm KSTSR ở 2 xã
Đak Ơ và xã Bù Gia Mập, huyện Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phước, sau đó dùng Real time PCR so sánh với Neted PCR trong phát hiện loài
Kết quả: Trong 400 mẫu sàng lọc bằng kỹ thuật Giem sa chỉ phát hiện được 2 chủng P.falciparum và
P.vivax, Nested PCR và Real time PCR phát hiện thêm có chủng P.malariae Đối với mẫu kỹ thuật Nested PCR phát hiện là nhiễm phối hợp P falciparum và P.malariae thì kỹ thuật Real time PCR phát hiện thêm nhiễm phối hợp với cả P vivax Mẫu được xác định là âm tính với kỹ thuật Giemsa thì Nested PCR phát hiện là P.vivax và Real time PCR lại phát hiện thêm nhiễm P.fal
Kết luận: Kỹ thuật Real time PCR có độ nhạy cao hơn Nested PCR tuy nhiên độ đặc hiệu chưa xác định
được
Từ khóa: Real time PCR, Plasmodium spp, Nested PCR
ABSTRACT
INITIAL USING REAL TIME PCR COMPARISON WITH NESTED PCR DETECTION AND
DIAGNOSIS PLASMODIUM SPP
Pham Nguyen Thuy Vy, Trinh Ngoc Hai, Hoang Thi Mai Anh, Nguyen Thi Van Anh, Vo Ngoc Bich, Nguyen Thi Minh Chau * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 17 - Supplement of No 1 - 2013: 36 - 41
Background: Detection of Plasmodium spp by PCR has increased the sensitivity and distinguishes species,
particularly the exact coordinate infections more than microscopy or immune However, most published PCR methods are now reading the results on gel arose requires technical complexity is not optimal in clinical treatment The need for a more sensitive test and the time to work more effectively led to the development of Real
Time PCR
Objective: Initial using Real Time PCR compared to Nested PCR technique in detecting and diagnostic
species Plasmodium spp
Materials and methods: Giemsa method used in screening patients infected with malaria parasites in two
Trang 2communes Dak Ơ and Bu Gia Map, Bu Gia Map district, Binh Phuoc province, then using Real time PCR detection compared with Nested PCR in species
Results: In 400 samples screened by Giemsa technique only detect two strains of P falciparum and P.vivax,
Nested PCR and Real time PCR detected more strain P.malariae For Nested PCR samples found to be contaminated coordinate P falciparum and P.malariae, Real time PCR detection technique is to coordinate P falciparum, P.malariae and P vivax Samples were defined as negative for Giemsa technique, Nested PCR detection P.vivax and Real Time PCR to detect is a combination P falciparum and infection P.vivax
Conclusions: Real time PCR technique is more sensitive nested PCR but specificity cannot be determined Key words: Real time PCR, Plasmodium spp, Nested PCR
ĐẶT VẤN ĐỀ
Khoa học công nghệ phát triển, phát hiện ký
sinh trùng (KST) Plasmodium bằng kỹ thuật sinh
học phân tử đã tăng độ nhạy và phân biệt các
loài, phát hiện các ca nhiễm phối hợp chính xác
hơn so với chẩn đoán bệnh sốt rét bằng kính
hiển vi hoặc miễn dịch (4,6). Tuy nhiên, hầu hết
các phương pháp PCR được công bố hiện nay
đều dựa vào kỹ thuật điện di trên gel agrose,
điều nay đòi hỏi kỹ thuật phức tạp chưa tối ưu
trong điều trị lâm sàng
Sự cần thiết cho một xét nghiệm có độ nhạy
cao hơn và thời gian làm việc hiệu quả hơn đã
dẫn đến sự phát triển kỹ thuật Real Time
PCR(1,2,3,5) Xét nghiệm Real Time PCR có khả
năng phát hiện mật độ KST thấp, xác định đựơc
ca nhiễm phối hợp, và có thể ứng dụng cho sự
khác biệt chính xác của các loài thông qua phân
tích đường cong nóng chảy (Melting curve) Ưu
điểm của Real Time PCR là chỉ một bước xử lý
duy nhất, trong khi Nested PCR đòi hỏi phải có
ít nhất hai bứớc xử lý Real Time PCR được thực
hiện trong một hệ thống khép kín, làm giảm
tiềm năng nhiễm chéo và xử lý hóa chất độc hại
và điện di gel agarose Hơn nữa, kết quả thu
được nhanh hơn Nested PCR và kỹ thuật này
cho phép đồng thời phát hiện và định lượng
được KST Hiện nay, áp dụng kỹ thuật này vẫn
đang còn hạn chế vì chi phí cao và đòi hỏi kỹ
thuật, tuy nhiên, những phương pháp này có
ứng dụng quan trọng trong nghiên cứu lâm
sàng liên quan đến việc phân tích các mẫu máu
thu được từ thực địa, các kiểu di truyền trong
quần thể KST, thử nghiệm và giám sát hiệu quả
trong kháng thuốc sốt rét Nghiên cứu này của chúng tôi nhằm:
Mục tiêu
Bước đầu sử dụng kỹ thuật Real Time PCR
so sánh với kỹ thuật Nested PCR trong phát hiện và chẩn đoán loài Plsamodium spp
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Địa điểm tiến hành
Nghiên cứu được thực hiện tại thực địa tại
xã Bù Gia Mập và xã Đak Ơ huyện Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phước
Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang
Cách chọn mẫu
Các mẫu máu được thu thập tại thực địa,những bệnh nhân từ 5-60 tuổi được xét
nghiệm có nhiễm Plasmodium spp được lấy máu
tại đầu ngón tay nhỏ trên giấy Whatmann, để khô tự nhiên, bỏ vào bì nylon, ghi tên bệnh nhân
và mã số, sau đó đem về Viện
Cỡ mẫu
Tính theo công thức
N: số mẫu cần điều tra
Z = 1.96, với x = 0.05, độ tin cậy 95%
p: là tỷ lệ nhiễm KSTSR ước tính khoảng là 15%
q = 1-p tỷ lệ người không nhiễm KSTSR là 0.85 (85%) d=0.05 là sai số mong muốn ở mức 5%
Z2 p (1-q) N= -
d2
Trang 3Áp dụng công thức cần 400 mẫu đối với 2
xã, cần tối thiểu 10 mẫu dương tính với KSTSR
Xác định chủng Plasmodium bằng phưong
pháp nhuộm Giem sa
Áp dụng quy trình xét nghiệm của Viện Sốt
rét - KST -CT Trung Ương
Xác định chủng Plasmodium bằng phương
pháp Nested PCR
Áp dụng quy trình khuếch đại theo quy
trình của Viện sốt rét - KST - CT Trung ương
Bảng 1: Trình tự nucleotide của các mồi được sử
dụng trong nghiên cứu
Xác định chủng Plasmodium bằng phương
pháp Real time PCR
Các cặp primer được đưa vào lựa chọn
nghiên cứu (dựa vào trình tự các cặp mồi trong
Gen Bank) Trên cơ sở trình tự primer đã được
lựa chọn, sử dụng primer này để tìm kiếm ở
ngân hàng gen NCBI đoạn ADN chứng dương
Mẫu dò cho 4 loài như sau:
P falciparum: Falcprobe:
GAAAGATGAC T-TAMRA-3′,
P vivax: Vivprobe: 5′-VIC-AGCAATCTAA
ATTCT-TAMRA-3′,
P malariae: Malaprobe:
5′FAM-CTATCTAAAA GAAACACTCAT - TAMRA-3′,
5′VIC-CGAAAGGAATTTTCTTATT- TAMRA-3′,
Dựa vào biểu đồ chảy (melt curve chart) để
phân tích kết quả
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả xác định chủng Plasmodium bằng
kỹ thuật nhuộm Giemsa
Tại Xã Đak Ơ, thu thập được 200 mẫu máu nghi ngờ nhiễm KSTSR, được xác định bằng kỹ thuật nhuộm Giemsa, xác định được 20 mẫu
nhiễm P.falciparum (10 %) và 14 mẫu nhiễm P vivax (7%), không mẫu nào được xét nghiệm
nhiễm phối hợp, 166 mẫu được xác định âm tính (83%)
Tại xã Bù Gia Mập, thu thập được 200 mẫu máu nghi ngờ nhiễm KSTSR, được xác định bằng kỹ thuật nhuộm Giemsa, có 24 mẫu nhiễm
P.falciparum (12%) và 13 mẫu nhiễm P vivax (6,5%), 2 mẫu nhiễm phối hợp cả P.falciparum và P.vivax (1%), 161 mẫu âm tính (80,5%)
400 mẫu thu thập được thì cơ cấu phân bố loài KSTSR được biểu hiện như bảng 1
Bảng 2 Kết quả xác định chủng Plasmodium bằng
kỹ thuật nhuộm Giemsa chung cho cả 2 xã
Tên chủng
P.falciparum P.vivax Nhiễm phối
hợp
Mẫu âm
Số lượng 44 27 2 327
Tỷ lệ % 11 % 6,75 % 0,5 % 81,75%
Tỷ lệ P.falciparum chiếm ưu thế, nhiễm phối
hợp chỉ chiếm 0,5%
Kết quả xác định chủng Plasmodium bằng
kỹ thuật Nested- PCR
Bảng 2 Kết quả xác định chủng bằng phương pháp
Nested –PCR
falciparum
P vivax Nhiễm phối
hợp
Mẫu âm
Số lượng 48 25 6 321
Tỷ lệ % 12% 6,25% 1,5% 80,25%
Trang 4Hình 1 Hình ảnh kết quả nhiễm phối hợp P
falciparum, P vivax, P malariae và nhiễm đơn P
Vivax Giếng 1: Thang chuẩn Giếng 2: Kết quả
dương tính của P Falciparum Giếng 3, 7: Kết quả
dương tính của P.vivax Giếng 4: Kết quả dương tính của P Malariae
Nhận xét: Dựa vào biểu đồ cơ cấu KSTSR
thành phần loài, ta thấy tỷ lệ nhiễm phối hợp và
nhiễm P.falciparum được phát hiện bằng kỹ thuật
Nested PCR nhiều hơn kỹ thuật Giemsa
Kết quả xác định chủng Plasmodium bằng
kỹ thuật Real time PCR
Bảng 3 Kết quả xác định chủng bằng phương pháp
Real time PCR
falciparum
P
vivax
Nhiễm phối hợp
Mẫu âm
Số lượng 47 24 8 321
Tỷ lệ % 11,75% 6% 2% 80,25%
Hình 2 Kết quả mẫu phát hiện P.fal, P.vivax bằng Real time PCR
Nhận xét: Kỹ thuật Real time PCR và Nested
PCR có sự tương đồng trong xác định thành
phần cơ cấu loài của 2 phương pháp này Điều
này cho thấy thiết kế mồi ở hai kỹ thuật này là
đã khuếch đại được đoạn gen bảo tồn trong
chẩn đoán các loài Plasmodium
Dựa vào đường cong nóng chảy và biểu đồ của đường chuẩn có nhận biết được số lượng KSTSR nhiễm trong máu bệnh nhân (tính theo nồng độ mẫu chuẩn)
So sánh kết quả xác định chủng
205bp
Trang 5Plasmodium bằng kỹ thuật Giemsa, Nested
PCR và Real time PCR
Bảng 4 Kết quả so sánh xác định chủng bằng kỹ
thuật nhuộm Giemsa, Nested -PCR và Real time
PCR
Thành phần
loài
Giem
sa
Tỷ lệ (%)
Nested PCR
Tỷ lệ (%)
Real time PCR
Tỷ lệ (%)
Nhiễm phối
hợp 2 0,5 6 1,5 8 2
Âm tính 327 81,75 321 80,25 321 80,25
Tổng số mẫu 400 400 400
Nhận xét: Tổng số mẫu thực hiện so sánh là
400 Tỷ lệ dương tính của kỹ thuật Nested PCR
và Real Time PCR cao hơn hẳn so với nhuộm
giêmsa
Bảng 5 Kết quả so sánh các loài cụ thể kỹ thuật
Giemsa, Nested -PCR và Real Time PCR
P
falciparum
P falciparum
(44)
P falciparum
(42)
P falciparum
(42)
P falciparum + P.malariae + P
vivax(1)
P falciparum + P.malariae+ P
vivax(1)
P falciparum +
P vivax (1)
P falciparum +
P vivax (1)
P falciparum +
P vivax (2)
P falciparum +
P vivax (2)
Falciparum(1)
Nhiễm
phối hợp
P.fal +P.vivax
(2)
P falciparum +
P vivax (1)
P falciparum +
P vivax (1)
P falciparum + P.malariae (1)
P falciparum +
P vivax+
P.malariae (1)
Negative Âm tính (327) P falciparum (5) P falciparum
(4)
P vivax (2)
Âm tính(321) Âm tính (321)
Nhận xét: Đối với các mẫu được xác định là
dương tính ở kỹ thuật nhuộm Giemsa thì kỹ
thuật Nested PCR và Real Time PCR cho các kết
quả cao hơn trong xác định từng loài KST SR
Sử dụng kỹ thuật Nested PCR làm chuẩn thì
kỹ thuật Real time phát hiện ra 79 mẫu (độ nhạy
là 100%) và không phát hiện Plasmodium trong
321 mẫu được xác định là âm tính
BÀN LUẬN
Kết quả của chúng tôi trong bảng 3.5: 44
mẫu xác định là P.falciparum ở kỹ thuật nhuộm
Giem sa thì ở kỹ thuật Nested PCR và Real time
PCR xác định là 42 mẫu P.falciparum, 1 mẫu nhiễm phối hợp 3 loài P falciparum, P.malariae và
P vivax và 1 mẫu nhiễm phối hợp 2 loài P falciparum và P vivax Với 42 mẫu xác định là P.vivax ở kỹ thuật nhuộm Giemsa thì kỹ thuật
Nested PCR và Real time PCR xác định là 24
mẫu nhiễm P.vivax, 2 mẫu nhiễm P falciparum
và P vivax và 1 mẫu nhiễm P.falciparum Trong 2 mẫu nhiễm phối hợp P falciparum và P.vivax
được xác định bằng kỹ thuật nhuộm Giemsa thì
ở kỹ thuật Nested PCR phát hiện 1 mẫu nhiễm
P falciparum và P.vivax, 1 mẫu nhiễm phối hợp
P falciparum và P.malariae Và ở kỹ thuật Real time PCR phát hiện 1 mẫu nhiễm phối hợp P falciparum và P.vivax, 1 mẫu nhiễm phối hợp P falciparum, P.vivax và P.malariae
Với các mẫu được xác định là âm tính ở kỹ thuật nhuộm Giemsa thì kỹ thuật Nested PCR
phát hiện thêm 5 mẫu nhiễm P falciparum và 1 mẫu nhiễm P.vivax, kỹ thuật Real time PCR phát hiện thêm 4 mẫu nhiễm P falciparum và 2 mẫu nhiễm phối hợp P falciparum và P.vivax
Như vậy so với kỹ thuật Nested PCR, kỹ thuật Real Time PCR cho ra kết quả với độ chính xác cao hơn, thời gian phân tích ngắn hơn
và còn định lượng được nồng độ KSTSR trong mẫu
Hiện nay kết quả nghiên cứu về kỹ thuật Real Time PCR để xác định loài ký sinh trùng sốt rét đang còn rất hạn chế ở Việt Nam Hầu hết các báo cáo kết quả đều của các tác giả nước ngoài Kết quả bước đầu của chúng tôi cho thấy
kỹ thuật Real Time PCR có độ nhậy cao hơn so với Nested PCR, đây sẽ là tiền đề cho các nghiên
Trang 6cứu tiếp theo của Viện trong tương lai
KẾT LUẬN
Xác định loài KST sốt rét
Kỹ thuật Giem sa đã phát hiện được 44 mẫu
nhiễm P falciparum, 27 mẫu nhiễm P vivax, 2
mẫu nhiễm P falciparum và P.vivax, 327 mẫu
nhiễm âm tính
Kỹ thuật Nested PCR đã phát hiện được 48
mẫu nhiễm P falciparum, 25 mẫu nhiễm P vivax,
6 mẫu nhiễm P falciparum và P.vivax, 321 mẫu
nhiễm âm tính
Kỹ thuật Real Time PCR đã phát hiện được
47 mẫu nhiễm P falciparum, 24 mẫu nhiễm P
vivax, 8 mẫu nhiễm P falciparum và P.vivax, 321
mẫu nhiễm âm tính
So sánh 3 kỹ thuật phát hiện KSTSR
Kỹ thuật Giem sa chỉ phát hiện được 2
chủng P.falciparum và P.vivax, trong khi đó kỹ
thuật Nested PCR và Real Time PCR phát hiện
được thêm có chủng P.malariae
Đối với mẫu kỹ thuật Nested PCR phát hiện
là nhiễm phối hợp P falciparum và P.malariae thì
kỹ thuật Real Time PCR phát hiện thêm là
nhiễm P vivax
Với mẫu được xác định là âm tính với kỹ
thuật Giemsa thì ở kỹ thuật Nested PCR phát
hiện là P.vivax và kỹ thuật Real Time PCR lại
phát hiện thêm là nhiễm P falciparum
ĐỀ NGHỊ
Cần thực hiện thêm kỹ thuật giải trình tự những mẫu đươc xác định là dương tính để có thêm cơ sở để khẳng định loài
Tiếp tục nghiên cứu phân tích thêm số mẫu trong năm tới
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Brown, AE, Kain KC, Pipithkul J, and Webster HK.(1992)
“Demonstration by the polymerase chain reaction of mixed Plasmodium falciparum and P vivax infections undetected by conventional microscopy” Trans R Soc Trop Med Hyg
86:609-612
2 De Monbrison F, Angei C, Staal A, Kaiser K, and Picot S (2003),
“Simultaneous identification of the four human Plasmodium species and quantification of Plasmodium DNA load in human blood by real-time polymerase chain reaction” Trans R Soc Trop Med Hyg 97:387-390
3 Hermsen CC, Telgt DS, Linders EH, van de Locht LA, Eling WM, Mensink EJ, and Sauerwein RW (2001),” Detection of Plasmodium falciparum malaria parasites in vivo by real-time quantitative PCR.”, Mol Biochem Parasitol 118:247-251
4 Lê Đức Đào, Bùi Quang Phúc, Nguyễn Văn Tuấn và cs (2003),
“So sánh độ nhạy và độ đặc hiệu giữa 3 kỹ thuật giemsa, paracheck, PCR phát hiện KSTSR tại xã Daksong, tỉnh Gia Lai 6/2002”, Tạp chí Phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, số 3 - 2003, tr 55 - 63
5 Lee MA, Tan CH, AW LT, Tang, Singh M, Lee SH, Chia HP, and Yap EP (2002), “Real- CS time fluorescence-based PCR for detection of malaria parasites” J Clin Microbiol 40:4343-4345
6 Mangold KA, Manson RU (2005), “Real-Time PCR for Detection
and Identification of Plasmodium spp.”, J Clin Microbiol 2005
May; 43(5): 2435–2440