Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu nhằm mục tiêu trình bày bước đầu sử dụng so sánh với kỹ thuật real time PCR so sánh với nested PCR trong phát hiện và chẩn đoán loài plsamodium spp. Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật giem sa trong sàng lọc bệnh nhân nhiễm KSTSR ở 2 xã Đak Ơ và xã Bù Gia Mập, huyện Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phước.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 BƯỚC ĐẦU SỬ DỤNG KỸ THUẬT REAL TIME PCR SO SÁNH VỚI KỸ THUẬT NESTED - PCR TRONG PHÁT HIỆN VÀ CHẨN ĐỐN LỒI PLASMODIUM SPP Phạm Nguyễn Thúy Vy*, Trịnh Ngọc Hải*, Hoàng Thị Mai Anh*, Nguyễn Thị Vân Anh*, Võ Thế Ngọc Bích*, Nguyễn Thị Minh Châu* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Phát Plasmodium spp PCR tăng độ nhạy phân biệt loài, đặc biệt ca nhiễm phối hợp xác so với kính hiển vi miễn dịch Tuy nhiên, hầu hết phương pháp PCR công bố đọc kết gel agrose đòi hỏi kỹ thuật phức tạp chưa tối ưu điều trị lâm sàng Gần áp dụng kỹ thuật Real Time PCR, có độ nhạy cao thời gian làm việc hiệu dùng để chẩn đoán phân biệt loài ký sinh trùng sốt rét Mục tiêu: Bước đầu sử dụng so sánh với kỹ thuật Real Time PCR so sánh với Nested PCR phát chẩn đốn lồi Plsamodium spp Đối tượng Phương pháp: Sử dụng kỹ thuật Giem sa sàng lọc bệnh nhân nhiễm KSTSR xã Đak Ơ xã Bù Gia Mập, huyện Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phước, sau dùng Real time PCR so sánh với Neted PCR phát loài Kết quả: Trong 400 mẫu sàng lọc kỹ thuật Giem sa phát chủng P.falciparum P.vivax, Nested PCR Real time PCR phát thêm có chủng P.malariae Đối với mẫu kỹ thuật Nested PCR phát nhiễm phối hợp P falciparum P.malariae kỹ thuật Real time PCR phát thêm nhiễm phối hợp với P vivax Mẫu xác định âm tính với kỹ thuật Giemsa Nested PCR phát P.vivax Real time PCR lại phát thêm nhiễm P.fal Kết luận: Kỹ thuật Real time PCR có độ nhạy cao Nested PCR nhiên độ đặc hiệu chưa xác định Từ khóa: Real time PCR, Plasmodium spp, Nested PCR ABSTRACT INITIAL USING REAL TIME PCR COMPARISON WITH NESTED PCR DETECTION AND DIAGNOSIS PLASMODIUM SPP Pham Nguyen Thuy Vy, Trinh Ngoc Hai, Hoang Thi Mai Anh, Nguyen Thi Van Anh, Vo Ngoc Bich, Nguyen Thi Minh Chau * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 17 - Supplement of No - 2013: 36 - 41 Background: Detection of Plasmodium spp by PCR has increased the sensitivity and distinguishes species, particularly the exact coordinate infections more than microscopy or immune However, most published PCR methods are now reading the results on gel arose requires technical complexity is not optimal in clinical treatment The need for a more sensitive test and the time to work more effectively led to the development of Real Time PCR Objective: Initial using Real Time PCR compared to Nested PCR technique in detecting and diagnostic species Plasmodium spp Materials and methods: Giemsa method used in screening patients infected with malaria parasites in two * Viện Sốt rét - KST - CT TP HCM Tác giả liên lạc: ThS Phạm Nguyễn Thúy Vy, ĐT: 0983092900, Email: thuyvypn@yahoo.com 36 Chuyên Đề Ký Sinh Trùng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Nghiên cứu Y học communes Dak Ơ and Bu Gia Map, Bu Gia Map district, Binh Phuoc province, then using Real time PCR detection compared with Nested PCR in species Results: In 400 samples screened by Giemsa technique only detect two strains of P falciparum and P.vivax, Nested PCR and Real time PCR detected more strain P.malariae For Nested PCR samples found to be contaminated coordinate P falciparum and P.malariae, Real time PCR detection technique is to coordinate P falciparum, P.malariae and P vivax Samples were defined as negative for Giemsa technique, Nested PCR detection P.vivax and Real Time PCR to detect is a combination P falciparum and infection P.vivax Conclusions: Real time PCR technique is more sensitive nested PCR but specificity cannot be determined Key words: Real time PCR, Plasmodium spp, Nested PCR kháng thuốc sốt rét Nghiên cứu ĐẶT VẤN ĐỀ nhằm: Khoa học công nghệ phát triển, phát ký Mục tiêu sinh trùng (KST) Plasmodium kỹ thuật sinh Bước đầu sử dụng kỹ thuật Real Time PCR học phân tử tăng độ nhạy phân biệt so sánh với kỹ thuật Nested PCR phát loài, phát ca nhiễm phối hợp xác chẩn đốn lồi Plsamodium spp so với chẩn đốn bệnh sốt rét kính hiển vi miễn dịch (4,6) Tuy nhiên, hầu hết phương pháp PCR công bố dựa vào kỹ thuật điện di gel agrose, điều đòi hỏi kỹ thuật phức tạp chưa tối ưu điều trị lâm sàng Sự cần thiết cho xét nghiệm có độ nhạy cao thời gian làm việc hiệu dẫn đến phát triển kỹ thuật Real Time PCR(1,2,3,5) Xét nghiệm Real Time PCR có khả phát mật độ KST thấp, xác định đựơc ca nhiễm phối hợp, ứng dụng cho khác biệt xác lồi thơng qua phân tích đường cong nóng chảy (Melting curve) Ưu điểm Real Time PCR bước xử lý nhất, Nested PCR đòi hỏi phải có hai bứớc xử lý Real Time PCR thực hệ thống khép kín, làm giảm tiềm nhiễm chéo xử lý hóa chất độc hại điện di gel agarose Hơn nữa, kết thu nhanh Nested PCR kỹ thuật cho phép đồng thời phát định lượng KST Hiện nay, áp dụng kỹ thuật hạn chế chi phí cao đòi hỏi kỹ thuật, nhiên, phương pháp có ứng dụng quan trọng nghiên cứu lâm sàng liên quan đến việc phân tích mẫu máu thu từ thực địa, kiểu di truyền quần thể KST, thử nghiệm giám sát hiệu Chuyên Đề Ký Sinh Trùng PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Địa điểm tiến hành Nghiên cứu thực thực địa xã Bù Gia Mập xã Đak Ơ huyện Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phước Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mô tả cắt ngang Cách chọn mẫu Các mẫu máu thu thập thực địa,những bệnh nhân từ 5-60 tuổi xét nghiệm có nhiễm Plasmodium spp lấy máu đầu ngón tay nhỏ giấy Whatmann, để khơ tự nhiên, bỏ vào bì nylon, ghi tên bệnh nhân mã số, sau đem Viện Cỡ mẫu Tính theo cơng thức Z2 p (1-q) N= d2 N: số mẫu cần điều tra Z = 1.96, với x = 0.05, độ tin cậy 95% p: tỷ lệ nhiễm KSTSR ước tính khoảng 15% q = 1-p tỷ lệ người không nhiễm KSTSR 0.85 (85%) d=0.05 sai số mong muốn mức 5% 37 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Áp dụng công thức cần 400 mẫu xã, cần tối thiểu 10 mẫu dương tính với KSTSR Xác định chủng Plasmodium phưong pháp nhuộm Giem sa Áp dụng quy trình xét nghiệm Viện Sốt rét - KST -CT Trung Ương Xác định chủng Plasmodium phương pháp Nested PCR Áp dụng quy trình khuếch đại theo quy trình Viện sốt rét - KST - CT Trung ương Bảng 1: Trình tự nucleotide mồi sử dụng nghiên cứu phân tích kết KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết xác định chủng Plasmodium kỹ thuật nhuộm Giemsa Tại Xã Đak Ơ, thu thập 200 mẫu máu nghi ngờ nhiễm KSTSR, xác định kỹ thuật nhuộm Giemsa, xác định 20 mẫu nhiễm P.falciparum (10 %) 14 mẫu nhiễm P vivax (7%), không mẫu xét nghiệm nhiễm phối hợp, 166 mẫu xác định âm tính (83%) Tại xã Bù Gia Mập, thu thập 200 mẫu máu nghi ngờ nhiễm KSTSR, xác định kỹ thuật nhuộm Giemsa, có 24 mẫu nhiễm P.falciparum (12%) 13 mẫu nhiễm P vivax (6,5%), mẫu nhiễm phối hợp P.falciparum P.vivax (1%), 161 mẫu âm tính (80,5%) 400 mẫu thu thập cấu phân bố loài KSTSR biểu bảng Bảng Kết xác định chủng Plasmodium kỹ thuật nhuộm Giemsa chung cho xã Xác định chủng Plasmodium phương pháp Real time PCR Các cặp primer đưa vào lựa chọn nghiên cứu (dựa vào trình tự cặp mồi Gen Bank) Trên sở trình tự primer lựa chọn, sử dụng primer để tìm kiếm ngân hàng gen NCBI đoạn ADN chứng dương Mẫu dò cho loài sau: P falciparum: Falcprobe: 5′-FAMAGCAATCTAA AAGTCACCTC GAAAGATGAC T-TAMRA-3′, P vivax: Vivprobe: 5′-VIC-AGCAATCTAA GAATAAACTC TAMRA-3′, P CGAAGAGAAA P.falciparum P.vivax Nhiễm phối Mẫu âm Tên chủng hợp Số lượng 44 27 327 Tỷ lệ % 11 % 6,75 % 0,5 % 81,75% Tỷ lệ P.falciparum chiếm ưu thế, nhiễm phối hợp chiếm 0,5% Kết xác định chủng Plasmodium kỹ thuật Nested- PCR Bảng Kết xác định chủng phương pháp Nested –PCR P P vivax Nhiễm phối Mẫu âm falciparum hợp Số lượng 48 25 321 Tên chủng Tỷ lệ % 12% 6,25% 1,5% 80,25% ATTCT- malariae: Malaprobe: 5′FAMCTATCTAAAA GAAACACTCAT - TAMRA-3′, P ovale:Ovaprobe: 5′VICCGAAAGGAATTTTCTTATT- TAMRA-3′, Dựa vào biểu đồ chảy (melt curve chart) để 38 Chuyên Đề Ký Sinh Trùng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Nghiên cứu Y học dương tính P.vivax Giếng 4: Kết dương tính P Malariae Nhận xét: Dựa vào biểu đồ cấu KSTSR thành phần loài, ta thấy tỷ lệ nhiễm phối hợp nhiễm P.falciparum phát kỹ thuật Nested PCR nhiều kỹ thuật Giemsa Kết xác định chủng Plasmodium kỹ thuật Real time PCR Bảng Kết xác định chủng phương pháp Real time PCR Tên chủng Hình Hình ảnh kết nhiễm phối hợp P falciparum, P vivax, P malariae nhiễm đơn P Vivax Giếng 1: Thang chuẩn Giếng 2: Kết dương tính P Falciparum Giếng 3, 7: Kết Số lượng Tỷ lệ % P P Nhiễm phối Mẫu âm falciparum vivax hợp 47 24 321 11,75% 6% 2% 80,25% Hình Kết mẫu phát P.fal, P.vivax Real time PCR Nhận xét: Kỹ thuật Real time PCR Nested PCR có tương đồng xác định thành phần cấu loài phương pháp Điều cho thấy thiết kế mồi hai kỹ thuật khuếch đại đoạn gen bảo tồn chẩn đốn lồi Plasmodium 205bp Chuyên Đề Ký Sinh Trùng Dựa vào đường cong nóng chảy biểu đồ đường chuẩn có nhận biết số lượng KSTSR nhiễm máu bệnh nhân (tính theo nồng độ mẫu chuẩn) So sánh kết xác định chủng 39 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Nghiên cứu Y học Plasmodium kỹ thuật Giemsa, Nested PCR Real time PCR Bảng Kết so sánh xác định chủng kỹ thuật nhuộm Giemsa, Nested -PCR Real time PCR Thành phần Giem Tỷ lệ Nested Tỷ lệ Real time Tỷ lệ loài PCR (%) sa (%) PCR (%) P.falciparum 44 11 48 12 47 11,75 P.vivax Nhiễm phối hợp Âm tính 27 6,75 25 6,25 24 0,5 1,5 321 80,25 327 81,75 321 80,25 Tổng số mẫu 400 400 400 Nhận xét: Tổng số mẫu thực so sánh 400 Tỷ lệ dương tính kỹ thuật Nested PCR Real Time PCR cao hẳn so với nhuộm giêmsa Bảng Kết so sánh loài cụ thể kỹ thuật Giemsa, Nested -PCR Real Time PCR Loài Giem sa P P falciparum (44) falciparum Nested PCR Real time PCR P falciparum (42) P falciparum (42) P falciparum + P falciparum + P.malariae + P P.malariae+ P vivax(1) vivax(1) P falciparum + P falciparum + P vivax (1) P vivax (1) P.vivax P vivax (27) P vivax(24) P vivax(24) P falciparum + P falciparum + P vivax (2) P vivax (2) P Falciparum(1) P Falciparum(1) Nhiễm P.fal +P.vivax P falciparum + P falciparum + phối hợp (2) P vivax (1) P vivax (1) P falciparum + P falciparum + P.malariae (1) P vivax+ P.malariae (1) Negative Âm tính (327) P falciparum (5) P falciparum (4) P vivax (1) P falciparum + P vivax (2) Âm tính(321) Âm tính (321) Nhận xét: Đối với mẫu xác định dương tính kỹ thuật nhuộm Giemsa kỹ thuật Nested PCR Real Time PCR cho kết 40 cao xác định loài KST SR Sử dụng kỹ thuật Nested PCR làm chuẩn kỹ thuật Real time phát 79 mẫu (độ nhạy 100%) không phát Plasmodium 321 mẫu xác định âm tính BÀN LUẬN Kết chúng tơi bảng 3.5: 44 mẫu xác định P.falciparum kỹ thuật nhuộm Giem sa kỹ thuật Nested PCR Real time PCR xác định 42 mẫu P.falciparum, mẫu nhiễm phối hợp loài P falciparum, P.malariae P vivax mẫu nhiễm phối hợp loài P falciparum P vivax Với 42 mẫu xác định P.vivax kỹ thuật nhuộm Giemsa kỹ thuật Nested PCR Real time PCR xác định 24 mẫu nhiễm P.vivax, mẫu nhiễm P falciparum P vivax mẫu nhiễm P.falciparum Trong mẫu nhiễm phối hợp P falciparum P.vivax xác định kỹ thuật nhuộm Giemsa kỹ thuật Nested PCR phát mẫu nhiễm P falciparum P.vivax, mẫu nhiễm phối hợp P falciparum P.malariae Và kỹ thuật Real time PCR phát mẫu nhiễm phối hợp P falciparum P.vivax, mẫu nhiễm phối hợp P falciparum, P.vivax P.malariae Với mẫu xác định âm tính kỹ thuật nhuộm Giemsa kỹ thuật Nested PCR phát thêm mẫu nhiễm P falciparum mẫu nhiễm P.vivax, kỹ thuật Real time PCR phát thêm mẫu nhiễm P falciparum mẫu nhiễm phối hợp P falciparum P.vivax Như so với kỹ thuật Nested PCR, kỹ thuật Real Time PCR cho kết với độ xác cao hơn, thời gian phân tích ngắn định lượng nồng độ KSTSR mẫu Hiện kết nghiên cứu kỹ thuật Real Time PCR để xác định loài ký sinh trùng sốt rét hạn chế Việt Nam Hầu hết báo cáo kết tác giả nước ngồi Kết bước đầu chúng tơi cho thấy kỹ thuật Real Time PCR có độ nhậy cao so với Nested PCR, tiền đề cho nghiên Chuyên Đề Ký Sinh Trùng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Nghiên cứu Y học cứu Viện tương lai phát thêm nhiễm P falciparum KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ Xác định loài KST sốt rét Cần thực thêm kỹ thuật giải trình tự mẫu đươc xác định dương tính để có thêm sở để khẳng định loài Kỹ thuật Giem sa phát 44 mẫu nhiễm P falciparum, 27 mẫu nhiễm P vivax, mẫu nhiễm P falciparum P.vivax, 327 mẫu nhiễm âm tính Kỹ thuật Nested PCR phát 48 mẫu nhiễm P falciparum, 25 mẫu nhiễm P vivax, mẫu nhiễm P falciparum P.vivax, 321 mẫu nhiễm âm tính Kỹ thuật Real Time PCR phát 47 mẫu nhiễm P falciparum, 24 mẫu nhiễm P vivax, mẫu nhiễm P falciparum P.vivax, 321 mẫu nhiễm âm tính Tiếp tục nghiên cứu phân tích thêm số mẫu năm tới TÀI LIỆU THAM KHẢO So sánh kỹ thuật phát KSTSR Kỹ thuật Giem sa phát chủng P.falciparum P.vivax, kỹ thuật Nested PCR Real Time PCR phát thêm có chủng P.malariae Đối với mẫu kỹ thuật Nested PCR phát nhiễm phối hợp P falciparum P.malariae kỹ thuật Real Time PCR phát thêm nhiễm P vivax Với mẫu xác định âm tính với kỹ thuật Giemsa kỹ thuật Nested PCR phát P.vivax kỹ thuật Real Time PCR lại Chuyên Đề Ký Sinh Trùng Brown, AE, Kain KC, Pipithkul J, and Webster HK.(1992) “Demonstration by the polymerase chain reaction of mixed Plasmodium falciparum and P vivax infections undetected by conventional microscopy” Trans R Soc Trop Med Hyg 86:609612 De Monbrison F, Angei C, Staal A, Kaiser K, and Picot S (2003), “Simultaneous identification of the four human Plasmodium species and quantification of Plasmodium DNA load in human blood by real-time polymerase chain reaction” Trans R Soc Trop Med Hyg 97:387-390 Hermsen CC, Telgt DS, Linders EH, van de Locht LA, Eling WM, Mensink EJ, and Sauerwein RW (2001),” Detection of Plasmodium falciparum malaria parasites in vivo by real-time quantitative PCR.”, Mol Biochem Parasitol 118:247-251 Lê Đức Đào, Bùi Quang Phúc, Nguyễn Văn Tuấn cs (2003), “So sánh độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật giemsa, paracheck, PCR phát KSTSR xã Daksong, tỉnh Gia Lai 6/2002”, Tạp chí Phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, số - 2003, tr 55 - 63 Lee MA, Tan CH, AW LT, Tang, Singh M, Lee SH, Chia HP, and Yap EP (2002), “Real- CS time fluorescence-based PCR for detection of malaria parasites” J Clin Microbiol 40:4343-4345 Mangold KA, Manson RU (2005), “Real-Time PCR for Detection and Identification of Plasmodium spp.”, J Clin Microbiol 2005 May; 43(5): 2435–2440 41 ... Bước đầu sử dụng kỹ thuật Real Time PCR học phân tử tăng độ nhạy phân biệt so sánh với kỹ thuật Nested PCR phát loài, phát ca nhiễm phối hợp xác chẩn đốn lồi Plsamodium spp so với chẩn đoán bệnh... tính kỹ thuật Nested PCR Real Time PCR cao hẳn so với nhuộm giêmsa Bảng Kết so sánh loài cụ thể kỹ thuật Giemsa, Nested -PCR Real Time PCR Loài Giem sa P P falciparum (44) falciparum Nested PCR Real. .. xét: Đối với mẫu xác định dương tính kỹ thuật nhuộm Giemsa kỹ thuật Nested PCR Real Time PCR cho kết 40 cao xác định loài KST SR Sử dụng kỹ thuật Nested PCR làm chuẩn kỹ thuật Real time phát 79