VŨ THỊ HỒNG NGỌC MSV 1201420 NGHIÊN cứu TÁC DỤNG CỦA CAO CHIẾT LÁ HỒNG TRÊN CHUỘT THỰC NGHIỆM gây tắc ĐỘNG MẠCH NÃO GIỮA KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ HỒNG NGỌC MSV: 1201420 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA CAO CHIẾT LÁ HỒNG TRÊN CHUỘT THỰC NGHIỆM GÂY TẮC ĐỘNG MẠCH NÃO GIỮA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  VŨ THỊ HỒNG NGỌC MSV: 1201420 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA CAO CHIẾT LÁ HỒNG TRÊN CHUỘT THỰC NGHIỆM GÂY TẮC ĐỘNG MẠCH NÃO GIỮA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đào Thị Thanh Hiền TS Lê Thị Xoan Nơi thực hiện: Bộ môn Dược học cổ truyền Viện Dược liệu HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS Lê Thị Xoan – khoa Dược lý Sinh hóa – Viện Dược Liệu, người thầy, người chị nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi để thực hiện đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn TS Đào Thị Thanh Hiền, TS Hà Vân Oanh đã tạo điều kiện cho tham gia thực hiện khóa luận và hết lòng giúp đỡ, đóng góp những ý kiến quý báu để hoàn thành khóa luận này Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thị Phượng, CN Trần Nguyên Hồng, cùng các anh chị khoa Dược lý - Sinh hóa và khoa Hóa Thực Vật – Viện Dược Liệu đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ hoàn thành khóa luận Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt những kiến thức quý giá và giúp đỡ quá trình học tập tại trường Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên giúp đỡ, là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho suốt thời gian qua Do thời gian thực hiện có hạn, điều kiện nghiên cứu và trình độ bản thân còn hạn chế nên không thể tránh khỏi những sai sót khóa luận Vì vậy, rất mong nhận được các ý kiến đóng góp của các thầy cô để khóa luận này được hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 11 tháng năm 2017 Sinh viên Vũ Thị Hồng Ngọc MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ iv ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Đột quỵ thiếu máu não cục bộ 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Hậu quả và tình hình dịch tễ .3 1.1.3 Sinh lý bệnh 1.1.4 Yếu tố nguy .4 1.1.5 Biện pháp điều trị hiện Xử trí chung 1.2 Mô hình gây đột quỵ chuột 1.2.1 Mô hình MCAO 1.2.2 Photothrombosis 11 1.3 Lá hồng .11 1.3.1 Đặc điểm thực vật và phân bố 11 1.3.2 Bộ phận dùng .11 1.3.3 Thành phần hóa học 12 1.3.4 Tác dụng dược lý .14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng nghiên cứu .18 2.1.1 Nguyên liệu 18 2.1.2 Động vật thí nghiệm 18 2.1.3 Hóa chất và trang thiết bị 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Định lượng flavonoid toàn phần cao chiết lá hồng bằng phương pháp đo quang .20 2.2.2 Đánh giá tác dụng dược lý 21 2.2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 21 2.2.2.2 Mô hình gây tắc động mạch não giữa 22 2.2.2.3 Nhuộm 2,3,5-triphenyltetrazolium chlorid (TTC) 24 2.2.2.4 Triển khai mô hình gây tắc động mạch não giữa 25 2.2.2.5 Áp dụng mô hình vào đánh giá tác dụng của cao chiết lá hồng 25 2.2.2.6 Xử lý thống kê 29 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31 3.1 Định lượng flavonoid toàn phần cao chiết EtOH lá hồng 31 3.2 Triển khai mô hình gây tắc động mạch não giữa .33 3.3 Tác dụng bảo vệ thần kinh của cao chiết lá hồng thực nghiệm 34 3.3.1 Ảnh hưởng của cao chiết lá hồng mức độ thiếu hụt thần kinh vận động 34 3.3.2 Ảnh hưởng của cao chiết lá hồng lên thể tích nhồi máu não 36 CHƯƠNG BÀN LUẬN 39 4.1 Mô hình gây đột quỵ động vật thực nghiệm .39 4.2 Tác dụng bảo vệ thần kinh của cao chiết lá hồng 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATP Adenosine triphosphate CAT Catalase CCA Động mạch cảnh chung (Common carotid artery) COX Cyclooxygenase CT Chụp cắt lớp vi tính (Computed tomography) DMSO Dimethyl sulfoxide ECA Đợng mạch cảnh ngồi (External carotid artery) EtOH Ethanol FDA Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) FLDK-P70 Flavonoid chuẩn chiết xuất từ lá hồng với 77,4% flavonoid Glasgow Thang điểm hôn mê đánh giá tình trạng ý thức của người bệnh GSH Glutathione GSH-Px Glutathione peroxidase HDL Lipoprotein tỷ trọng cao i.p Tiêm phúc mạc i.v Tiêm tĩnh mạch ICA Động mạch cảnh (Internal carotid artery) IL Interleukin INR Chỉ số bình thường hóa quốc tế (International Normalized Ratio) LDL Lipoprotein tỷ trọng thấp MCA Động mạch não giữa (Middle cerebral artery) MCAO Mô hình gây tắc động mạch não giữa (Middle Cerebral Artery Occlusion) Mean Giá trị trung bình MeOH Methanol NXQ Cao chiết chuẩn hóa từ hồng (Naoxinqing) PAf Proanthocyanidin chiết xuất từ lá hồng i PLF Flavonoid từ dịch chiết lá hồng PLF - PC Phức hợp phospholipid của flavonoid tổng từ dịch chiết lá hồng rt-PA, tPA Chất hoạt hóa plasminogen mô tái tổ hợp SE Sai số chuẩn SOD Superoxide dismutase THA Tăng huyết áp TNF Yếu tố hoại tử khối u (Tumor necrosis factor) TTC 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride WHO World Health Organization ii DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Bảng 1.1 Yếu tố nguy của thiếu máu não cục bộ Bảng 1.2 Các mô hình gây thiếu máu não Bảng 2.1 Chế độ dùng thuốc của các lô chuột nghiên cứu 28 Bảng 3.1 Kết quả sự phụ thuộc giữa độ hấp thụ quang và nồng độ 31 Trang của Quercetin đo ở bước sóng 510 nm Bảng 3.2 Kết quả định lượng flavonoid cao chiết EtOH lá 32 hồng Bảng 3.3 Kết quả khảo sát kích thước dây gây đột quỵ 33 monofilament Bảng 3.4 Kết quả đánh giá hành vi vận động của các lô chuột thực nghiệm iii 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình Trang Hình 1.1 Lá hồng 12 Hình 1.2 Công thức của flavonoid 13 Hình 2.1 Dây gây đột quỵ - monofilament 20 Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 22 Hình 2.3 Quy trình gây tắc động mạch não giữa 24 Hình 2.4 Đường bregma 25 Hình 2.5 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu tác dụng dược lý của cao chiết lá 27 hồng Hình 2.6 Thang điểm đánh giá thiếu hụt thần kinh vận động 29 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và độ hấp thụ 31 quang của Quercetin ở 510 nm Hình 3.2 Hình ảnh các lát cắt não nhuộm TTC thử triển khai 34 mơ hình Hình 3.3 Hình ảnh đặc trưng lát cắt não của nhóm cḥt nghiên 36 cứu nhuộm TTC Hình 3.4 Biểu đồ so sánh tỷ lệ phần trăm nhồi máu não của các lô chuột thực nghiệm iv 37 ĐẶT VẤN ĐỀ Đột quỵ (hay còn gọi là tai biến mạch máu não) là nguyên nhân thứ hai gây tử vong toàn thế giới [28]][47] sau bệnh tim mạch và nằm nhóm các bệnh gây tử vong hàng đầu toàn cầu 15 năm qua [47] Tại nước ta, tai biến mạch máu não là nguyên nhân hàng đầu gây gánh nặng bệnh tật nhóm bệnh không lây nhiễm [2] Đột quỵ hiện tượng máu lên não bị gián đoạn đột ngột chảy máu não, hậu quả tế bào não bị chết thiếu oxy, gây các tổn thương nghiêm trọng cho thể, nếu không được điều trị kịp thời có thể dẫn tới tử vong Cho đến đợt quỵ vẫn cịn một thách thức lớn của y học Tử vong bệnh cao gánh nặng về tàn phế sau đột quỵ là nỗi lo của cá nhân, gia đình và xã hội Đột quỵ gồm thể: đột quỵ thể nhồi máu (thiếu máu não cục bộ) và đột quỵ thể xuất huyết, đó đột quỵ thể nhồi máu chiếm khoảng 87% [16] [22] Cho đến nay, việc điều trị đột quỵ còn nhiều hạn chế Chất hoạt hóa plasminogen mô tái tổ hợp (rtPA - recombinant tissue plasminogen activator) là thuốc nhất được FDA phê duyệt để điều trị thiếu máu não cục bộ Tuy nhiên, tPA phải được dùng càng sớm càng tốt, tối đa 4,5 giờ sau xuất hiện triệu chứng đột quỵ đầu tiên [8][22][27][41] Do sự ngắn hạn của thời gian cửa sổ điều trị, nên số bệnh nhân được điều trị và hưởng lợi từ thuốc nhỏ Do đó, việc nghiên cứu phát triển liệu pháp điều trị đột quỵ não mới rất cần thiết Bên cạnh việc nghiên cứu phát triển các thuốc điều trị thì việc phòng chống thiếu máu não cục bộ càng cần phải được quan tâm Việt Nam có nguồn dược liệu, thuốc dân gian phong phú việc gìn giữ, ứng dụng phát triển di sản nhiều hạn chế chứng khoa học về tác dụng của chúng còn chưa được sáng tỏ Cây hồng (Diospyros kaki L.f.) một ăn quả lâu năm, được trồng rộng khắp khu vực Đông Nam Á Hồng có chứa các hợp chất khác các acid amin, carotenoid, flavonoid, tanin, catechin vitamin A [23][37] Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu chứng minh chất được phân lập từ hồng có nhiều tác dụng sinh học hạ huyết áp [32], kháng khuẩn, chống viêm, chống dị ứng [32], chống Hình 3.4: Biểu đồ so sánh tỷ lệ phần trăm nhồi máu não của các lô chuột thực nghiệm Giá trị được biểu diễn là Mean ± SEM, n=6-8 * p < 0,05, ** p < 0,001 so với nhóm chứng bệnh lý không được điều trị Trong nghiên cứu này, phương pháp nhuộm TTC được sử dụng để đánh giá tổn thương não bộ chuột sau ngày gây MCAO Kết quả chỉ Hình 3.3 đã cho thấy, chuột bệnh lý MCAO không được điều trị có diện tích nhồi máu não lên đến 41,0 ± 5,8 % diện tích bán cầu Trong đó, chuột sinh lý không thấy bất kỳ thương tổn nào nhuộm TTC Edaravone, thuốc đối chứng dương cho thấy tác dụng làm giảm diện tích nhồi máu não mô hình này xuống còn 18,2 ± 7,6 % (p= 0,037 < 0,05) Chuột được cho uống cao chiết lá hồng ở liều 125, 250, 500 mg/kg/ngày 14 ngày (8 ngày trước gây đột quỵ) cho kết quả: + Lô chuột được điều trị cao lá hồng liều 125 và 250 mg/kg cho thấy không có sự cải thiện rõ rệt diện tích nhồi máu não so với lô bệnh lý không được điều trị (p= 0,752; 0,622) 37 + Ở liều 500 mg/kg, diện tích nhồi máu não chuột chiếm 21,6 ± 4,7 %, giảm đáng kể so với chứng bệnh lý không được điều trị và đạt ý nghĩa thống kê p= 0,027 < 0,05 38 CHƯƠNG BÀN LUẬN Việc nghiên cứu và sử dụng về dược liệu hồng Diospyros kaki L.f ở nước ta còn rất hạn chế Y học cổ truyền nước ta đã sử dụng tai hồng, quả hồng, vỏ thân, vỏ rễ để làm thuốc Trên thế giới việc nghiên cứu lá hồng rất được quan tâm Đặc biệt, cao chiết chuẩn hóa của lá hồng NXQ đã được hội Y Học Cổ Truyền Trung Quốc chấp nhận để hỗ trợ điều trị đột quỵ và các bệnh tim mạch khác chế chưa rõ Do đó, chúng tiến hành nghiên cứu bước đầu về lá hồng tại Việt Nam tác dụng bảo vệ thần kinh với mẫu là cao khô toàn phần, chiết EtOH 70% Chúng đã tiến hành định lượng flavonoid toàn phần cao chiết EtOH lá hồng Yên Bái để có sở tính liều theo hàm lượng flavonoid cho nghiên cứu này, đồng thời cũng là số liệu tham khảo cho các nghiên cứu khác sau này 4.1 Mô hình gây đột quỵ động vật thực nghiệm Đột quỵ ngày càng là gánh nặng cho toàn thế giới với tình hình dân số già hóa và sự gia tăng các bệnh tim mạch, chuyển hóa Phương pháp điều trị thiếu máu não cục bộ còn hạn chế, chỉ có một tỷ lệ nhỏ bệnh nhân được hưởng lợi từ liệu pháp điều trị Do đó, các phương pháp điều trị mới hướng tới các chế bệnh sinh gây tổn thương não thiếu máu cục bộ là rất cần thiết Các mô hình gây đột quỵ động vật là một công cụ đắc lực cho sự hiểu biết về chế bệnh sinh của thiếu máu não cục bộ và phát triển các thuốc mới Mô hình MCAO sử dụng sợi chỉ monofilament là mô hình được sử dụng nhiều nhất chuột [24][35] Mô hình MCAO này có ưu điểm là phẫu thuật vùng cổ, xâm lấn tối thiểu, đơn giản, gây tổn thương có tính lặp lại tại vùng vỏ não (cortex) và thể vân (striatum), gây tắc nghẽn động mạch não tương tự ở người Phương pháp có thể chủ động gây mô hình thiếu máu não tạm thời vĩnh viễn có thể rút sợi monofilament này khỏi mạch máu một cách chủ động Làm thông mạch cách loại bỏ sợi monofilament ít nhất có thể mô hình hóa được trạng thái phục hồi mạch máu não sau huyết khối bị đánh tan một cách tự nhiên dùng tPA bệnh nhân đột quỵ [20] Hơn nữa, mô hình này đã được triển khai thành công tại khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược Liệu vào năm 2016 39 [49] Do vậy, phương pháp mà chúng sử dụng là phù hợp để đánh giá tác dụng bảo vệ thần kinh của thuốc Với các kinh nghiệm từ nghiên cứu đã triển khai trước tại khoa Dược lý – Sinh hóa (sử dụng dây 0,23, 0,24 mm), nhóm nghiên cứu đã tiến hành triển khai mô hình chuột với sợi monofilament có kích thước 0,24- 0,27 mm Với chuột dùng dây 0,27 mm, dây không thể luồn vào được đến gốc động mạch não giữa, thực tế chỉ vào được khoảng 5mm, có thể chỉ luồn đến ngã ba giữa ICA và PTG và đầu dây quá to không thể vào được mạch Nếu dây vào được, chuột bị chết Điều này có thể kích thước đầu dây quá to gây xuất huyết ở chuột Do đó chúng sử dụng dây có kích thước 0,24 - 0,26 mm cho nghiên cứu này Từ kết quả thực nghiệm (Bảng 3.3, Bảng 3.4), các nhóm gây mô hình MCAO đều có tổn thương thần kinh tại bán cầu não gây tắc MCA Điều này cho thấy mô hình MCAO sử dụng sợi monofilament được triển khai đã thành công Edarvavone, chất có hoạt tính dọn dẹp gốc tự mạnh, đã được chấp nhận sử dụng tại Nhật Bản nhiều trị đột quỵ tắc mạch máu não cấp tính và hiện được thử nghiệm lâm sàng tại nhiều quốc gia khác Hoạt tính chống oxy hoá của edaravone là chế hoạt động chính của nó Hơn nữa, nhiều nghiên cứu đã gợi ý edaravone có thể làm chậm quá trình chết tế bào thần kinh, chống lại độc tính thần kinh gây vi khuẩn; edaravone có thể ức chế lipoxygenase, một enzyme chịu trách nhiệm oxy hóa lipid và cũng có thể trực tiếp ức chế quá trình oxy hóa LDL Ngoài giảm các ảnh hưởng có hại gây bởi hiện tượng thiếu máu cục bộ, người ta đã gợi ý thuốc có thể ngăn ngừa sự phát triển phù nề sau đột quỵ cách ức chế sự sản yếu tố tăng trưởng nội mô mạch Hơn nữa, Kituchi và cộng sự đã đưa giả thuyết edaravone có thể làm giảm hoạt động của kênh aquaporin-4 (kênh vận chuyển nước não) sau thiếu máu, đó làm giảm phù nề [33] Trong đề tài này, chúng sử dụng edaravone làm chất đối chứng dương để đánh giá mô hình MCAO đã xây dựng cũng để phần nào so sánh với tác dụng của dược liệu nghiên cứu 40 Kết quả đã chỉ rằng, edaravone có thể làm giảm những tổn thương mô thần kinh và cải thiện sự thiếu hụt thần kinh vận động của chuột gây mô hình MCAO so với chuột bệnh lý, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Điều này đã chứng tỏ edaravone đã thể hiện được vai trò chứng dương của mình và một lần nữa khẳng định mô hình của nhóm nghiên cứu là đúng đắn Tuy nhiên, thực hiện mô hình này, chúng gặp phải vấn đề tỷ lệ chết tương đối lớn, 20%, với nguyên nhân chủ yếu gây mê, phẫu thuật và xuất huyết dưới nhện Khi sử dụng dây monofilament có thể gây tổn thương nội mô mạch máu, gây nguy vỡ mạch và xuất huyết dưới nhện Việc gây mê và phẫu thuật còn có thể dẫn đến sự thay đổi kết quả các nghiên cứu bảo vệ thần kinh Và mô hình còn có một vài hạn chế: không thể xác nhận MCAO thành công hay không, khả lặp lại của mô hình phụ thuộc vào việc xác định kích thước tối ưu của dây monofilament (đường kính, hình dáng lớp silicone, chiều dài dây luồn vào mạch máu, độ mịn lớp silicone bao ngoài dây), chủng và thể trọng chuột [24] Ngoài ra, sự tác động lên vùng cổ và động mạch cảnh ngoài ECA làm các nhai và nuốt thiếu máu cục bộ, dẫn đến khó khăn việc ăn và gây giảm cân Mặc dù điều này không làm thay đổi kích thước nhồi máu tổng thể, nó có liên quan đến các hành vi sau đột quỵ [19] 4.2 Tác dụng bảo vệ thần kinh của cao chiết hồng Nghiên cứu tác dụng của NXQ mô hình MCAO và – VO cho kết quả với liều NXQ 40, 80 mg/kg và FLDK – P70 40, 80 mg/kg có tác dụng bảo vệ thần kinh chấn thương thiếu máu não cục bộ, các nghiên cứu đều cho thấy tác dụng phụ thuộc liều của cao chiết lá hồng [14][15] NXQ có 25% flavonoid Mức liều 40 mg/kg NXQ tương đương với mức liều 125 mg/kg cao chiết lá hồng sử dụng nghiên cứu này về hàm lượng flavonoid toàn phần FLDK-P70 – flavonoid chuẩn chiết xuất từ lá hồng với 77,4% flavonoid Liều 40 mg/kg FLDK – P70 tương đương với liều 390 mg/kg cao chiết sử dụng nghiên cứu của chúng 41 Từ các nghiên cứu trên, chúng chọn mức liều 125, 250, 500 mg/kg với chế độ liều ngày trước, ngày sau gây MCAO Sự suy giảm của các chân bên đối diện bên não gây đột quỵ là vấn đề chung đã được phát hiện ở các mô hình gây đột quỵ, vùng vận động ở vỏ não bị tổn thương [10] Do đó, một bài kiểm tra chân trước phối hợp với chức vận động đã được sử dụng để đánh giá mức độ thiếu hụt thần kinh vận động của chuột sau gây đột quỵ phương pháp MCAO Mức độ nhồi máu não một yếu tố quan trọng để đánh giá tổn thương sau đột quỵ nó liên quan đến tổn thương các tế bào thần kinh ở vùng khác nhau, hậu quả của các tổn thương thần kinh này là làm suy giảm chức thần kinh TTC là thuốc nhuộm giúp phát hiện vị trí nhồi máu não theo chế đã được nêu trước đó Với phương pháp nhuộm TTC, vị trí nhồi máu não có thể được xác định một cách đơn giản, nhanh chóng và ít tốn so với các phương pháp khác (so với nhuộm Hematoxylin và eosin; nhuộm bạc; microtubule associated protein 2) [24] Do đó, nhóm nghiên cứu đã xác định thể tích nhồi máu não cách nhuộm TTC Kết quả trình bày đã cho thấy, nhóm chứng bệnh lý MCAO có thể tích nhồi máu não khá lớn (hơn 40%) và suy giảm về chức vận động Trong mô hình này, chuột được cho sử dụng cao chiết lá hồng đã cho kết quả khả quan về khả cải thiện mô thần kinh và chức vận động với mức liều 500 mg/kg/ngày, tác dụng bảo vệ thần kinh của cao chiết có xu hướng phụ thuộc vào liều Kết quả nghiên cứu của chúng tương đồng với kết quả đã công bố trước của Bei [14][15] với mức liều 500 mg/kg và tác dụng phụ thuộc liều Với mức liều 125, 250 mg/kg, kết quả cho thấy sự giảm phần trăm diện tích nhồi máu não và điểm số hành vi khác biệt không có ý nghĩa thống kê với lô bệnh lý Sự khác biệt về kết quả này so với kết quả của Bei 2007 [14] có thể sự khác về chủng chuột tiến hành MCAO (chuột nghiên cứu của Bei là chuột Sprague – Dawley) và quy trình tiến hành: sợi monofilament nghiên cứu là sợi được bao đầu tròn được làm máy, dây gây đột quỵ của chúng được làm thủ 42 công, để đảm bảo đồng nhất độ mịn màng và bề dày lớp phủ silicone là rất khó khăn; sự khác về chiều dài monofilament được chèn vào mạch và sự khác về thành phần hoạt chất của cao chiết lá hồng Từ các nghiên cứu thế giới, chúng nghi ngờ thành phần có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh là flavonoid có lá hồng Lá hồng được biết đến một chất chống oxy hóa, khả dọn dẹp mạnh mẽ bởi các flavonoid: quercetin, kaempferol, các hợp chất polyphenol catechin, epicatechin, epigallocatechin, acid chlorogenic, acid caffeic acid gallic [48] Bộ não đặc biệt nhạy cảm với những tổn thương stress oxy hóa gây bởi vì các tế bào thần kinh chứa một lượng lớn các axit béo không no và một lượng nhỏ các enzyme chống oxy hoá nội sinh [26] Đột quỵ thiếu máu cục bộ có thể gây sự chết theo chu trình của tế bào thần kinh stress oxy hóa, có thể chủ yếu là sự xuất hiện của các phản ứng oxy hóa suốt quá trình thiếu máu não, đặc biệt là bắt đầu tái tưới máu [11] Một số nghiên cứu in vitro đã báo cáo NXQ giúp làm giảm malondialdehyde, tăng hàm lượng CAT, GSH-Px, GSH với các tế bào NG108-15 được thêm NXQ tiếng trước phơi nhiễm H2O2 (300 µM) 10 tiếng so với các tế bào không được thêm NXQ, tác dụng phụ thuộc liều [13] Tổn thương tế bào gây bởi H2O2 đã được giảm nhẹ một cách đáng kể và khả sống của tế bào đã được cải thiện [12] FLDK-P70 có thể tăng khả tồn tại của nơ-ron vùng hải mã gây độc glutamat Tế bào thần kinh vỏ não bị gây thiếu oxy máu và thiếu máu, ủ trước với FLDK-P70 làm giảm đáng kể tỷ lệ chết theo chu trình của các tế bào này một cách phụ thuộc liều [15] Với mô hình MCAO, gây thiếu máu cục bộ đầu silicone, nên tác dụng cao chiết lá hồng bảo vệ thần kinh được chứng minh nghiên cứu này không liên quan đến tác dụng làm tan cục máu đông (nếu có) của dược liệu này Nghiên cứu của Sa YS và cộng sự đã báo cáo lá hồng có thành phần có tác dụng chớng đơng máu Nó làm trì hoãn thời gian thrombin, APTT và thời gian prothrombin sử dụng huyết tương người Nó không gây thủy phân fibrin sau ủ Tuy nhiên, nó ức chế thrombin xúc tác chuyển fibrinogen thành fibrin cách ức chế cạnh tranh [45] Những kết quả này chỉ lá hồng có thể có tác dụng chống huyết khối Nên 43 chúng đề xuất nghiên cứu thêm về tác dụng phòng và điều trị đột quỵ của cao chiết lá hồng các mô hình khác (Photothrombosis mô hình gây tắc MCA cách tiêm cục máu đông vào lòng mạch) Kết quả nghiên cứu của chúng tương đồng với kết quả của các nhóm nghiên cứu khác thế giới về tác dụng của cao chiết lá hồng Diospyros kaki L.f việc bảo vệ tế bào thần kinh in vitro và in vivo [12][13][14][15] Nghiên cứu đã giúp cung cấp thêm chứng khoa học về tác dụng bảo vệ thần kinh theo hướng chống đột quỵ của cao chiết lá hồng Ngoài ra, thế giới cũng đã có nhiều nghiên cứu chứng minh về tác dụng hạ huyết áp, hạ lipid máu, hạ đường huyết [29][48][50] – những yếu tố nguy gây đột quỵ Các kết quả của nghiên cứu này một lần nữa cho thấy triển vọng ứng dụng của lá hồng lâm sàng 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Hàm lượng flavonoid cao chiết EtOH lá hồng định lượng phương pháp đo quang là 7,99% - Mô hình gây tắc động mạch não giữa được triển khai thành công với kích thước đầu monofilament là 0,24 – 0,26 mm - Việc đánh giá tác dụng cao chiết lá hồng mô hình gây tắc động mạch não giữa với chế độ liều ngày trước và ngày sau phẫu thuật: + Với liều 125, 250 mg/kg/ngày, cao chiết không thể hiện tác dụng bảo vệ thần kinh + Với liều 500 mg/kg/ngày cho thấy tác dụng bảo vệ thần kinh mô hình MCAO: giảm đáng kể diện tích nhồi máu não và cải thiện chức thần kinh Kiến nghị Từ kết quả nghiên cứu bước đầu này, kiến nghị đề tài cần được tiếp tục nghiên cứu để có thể sử dụng nguồn dược liệu lá hồng hiệu quả, an toàn, với một số nội dung sau: - Nghiên cứu về thành phần hóa học, định lượng một số hoạt chất bản cao chiết lá hồng để góp phần tiêu chuẩn hóa cao chiết lá hồng - Nghiên cứu thêm về chế bảo vệ thần kinh cũng thành phần có tác dụng chính của cao chiết lá hồng - Tiến hành nghiên cứu cao chiết lá hồng đã được làm giàu flavonoid và tiếp tục nghiên cứu tác dụng của cao các mô hình dược lý khác để làm sáng tỏ thêm tác dụng của cao chiết - Kiểm tra độc tính cấp, độc tính bán trường diễn đường uống của cao chiết lá hồng 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung và cộng sự (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập 1, tr.994 – 997, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội Bộ y tế Việt Nam (2015), Báo cáo chung tổng quan ngành y tế năm 2014: tăng cường dự phòng và kiểm soát bệnh không lây nhiễm, tr.28-29, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội Nguyễn Văn Chi (2016), Cập nhật về chẩn đoán và xử trí đột quỵ não cấp, Hội nghị tim mạch toàn quốc 2016 Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, tập 1, tr.143, Nhà xuất bản y học Bạc Cầm My (2014), Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng kháng khuẩn của lá hồng, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, Đại học Dược Hà Nội Stephen Davis (2013), Vietnam challenges in acute stroke therapy, RMH comprehensive stroke centre Tiếng Anh Adams HP Jr, del Zoppo G, et al (2007), “Guidelines for the Early Management of Adults With Ischemic Stroke A Guideline From the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, Clinical Cardiology Council, Cardiovascular Radiology and Intervention Council, and the Atherosclerotic Peripheral Vascular Disease and Quality of Care Outcomes in Research Interdisciplinary Working Groups: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists”, Stroke 38, pp.1655– 1711, 2007 American Stroke Association (2015),"let’s talk about Ischemic Stroke", Let’s talk about Stroke Ashry OM, Hussein EM, et al (2017), “Restorative role of persimmon leaf (Diospyros kaki) to gamma irradiation-induced oxidative stress and tissue injury in rats”, International Journal of Radiation Biology 93, pp.324-329 10 Balkaya M, KrÖber JM, et al (2013), “Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia”, Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism 33, pp.330-338 11 Barinaga M (1998), “Stroke damaged neurons may commit cellular suicide”, Science 281, pp.1302–1303 12 Bei W, Peng W, et al (2005), “Flavonoids from the leaves of Diospyros kaki reduce hydrogen peroxide-induced injury of NG108-15 cells”, Life Sci 76, pp.1975-88 13 Bei W, Peng W, et al (2004), “NaoXinQing, an anti-stroke herbal medicine, reduces hydrogen peroxide-induced injury in NG108-15 cells”, Neurosci Lett 363, pp.262-267 14 Bei W, Peng W, et al (2007), “Neuroprotective effects of a standardized extract of Diospyros kaki leaves on MCAO transient focal cerebral ischemic rats and cultured neurons injured by glutamate or hypoxia”, Planta Med 73, pp.636-679 15 Bei W, Zang L, et al (2009), “Neuroprotective effects of a standardized flavonoid extract from Diospyros kaki leaves”, J Ethnopharmacol 126, pp.134-176 16 Benjamin EJ, Blaha MJ, et al (2017), “Heart Disease and Stroke Statistics— 2017 Update: A Report From the American Heart Association”, Circulation 135, e229-268 17 Bhat DP, Dretler A, et al (2016), The Washington Manual of Medical Therapeutics, 35 edition, Lippincott Williams & Wilkins, p.841 – 849 18 Brott T, Bogousslavsky J (2000), “Treatment of Acute Ischemic Stroke”, New england journal of medecine 343, pp.710-722 19 Carmichael ST (2005), “Rodent Models of Focal Stroke: Size, Mechanism, and Purpose”, NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics 2, pp.396 – 409 20 Chiang T, Messing RO, et al (2011), “Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion”, J Vis Exp 48, pp.2761 21 Choi MS, Jeong MJ, et al (2016), “The Leaf of Diospyros kaki Thumb Ameliorates Renal Oxidative Damage in Mice with Type Diabetes”, Prev Nutr Food Sci 21, pp.378–383 22 Dipiro JT, Talbert RL, et al (2017), Pharmacotherapy: A Pathophysiologic Approach, Tenth Edition, McGraw-Hill Education, the United States of America 23 Duan J, Zheng Y, et al (2004), “Structural analysis of a pectic polysaccharide from the leaves of Diospyros kaki”, Phytochemistry 65, pp.609–615 24 Durukan A, Strbian D, et al (2008), “Rodent Models of Ischemic Stroke: A Useful Tool for Stroke Drug Development”, Current Pharmaceutical Design 14, pp.359-370 25 Engel O, Kolodziej S, et al (2011), “Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model”, J Vis Exp 47 26 Facchinetti F, Dawson VL, et al (1988), “Free radicals as mediator of neuronal injury”, Cell Mol Neurobiol 18, pp.667–682 27 Jauch EC, Saver JL, et al (2013), “Guidelines for the early management of patients with acute ischemic stroke: a guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association”, Stroke 44, pp 870-947 28 Johnson W, Onuma O, et al (2016), “Stroke: a global response is needed”, Bulletin of the World Health Organization 94, pp.634-634A 29 Kawakami K, Aketa S, et al (2011), “Antihypertensive and Vasorelaxant Effects of Water-Soluble Proanthocyanidins from Persimmon Leaf Tea in Spontaneously Hypertensive Rats”, Biosci Biotechnol Biochem 75, pp.1435–1439 30 Kim KS, Lee DS, et al (2016), “Anti-Inflammatory Effects and Mechanisms of Action of Coussaric and Betulinic Acids Isolated from Diospyros kaki in Lipopolysaccharide-Stimulated RAW 264.7 Macrophages”, Molecules 21, pp.1206 31 Koda-Kimble MA, Alldredge Bk, et al (2012), Applied Therapeutics: The Clinical Use of Drugs, 10th Edition, Lippincott, Williams and Wilkins, p.1419 – 1434 32 Kotani M, Matsumoto M, et al (2000), “Persimmon leaf extract and astragalin inhibit development of dermatitis and IgE elevation in NC/Nga mice”, J Allergy Clin Immunol 106, pp.159-225 33 Lapchak PA (2010), “A critical assessment of edaravone acute ischemic stroke efficacy trials: Is edaravone an effective neuroprotective therapy?”, Expert Opin Pharmacother 11, pp.1753–1763 34 Lijun S, Jianbao Z, et al (2011), “Evaluation to the antioxidant activity of total flavonoids extract from persimmon (Diospyros kaki L.) leaves”, Food and Chemical Toxicology 49, pp.2689-2696 35 Longa EZ, Weinstein PR, et al (1989), “Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats”, Stroke 20, pp.84-91 36 Macrae IM (2011), “Review: Preclinical stroke research – advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia”, British Journal of Pharmacolog 164, pp.1062–1078 37 Mallavadhani UV, Panda AK, et al(1998), “Pharmacology chemotaxonomy of Diospyros”, Phytochemistry 49, pp.901–951 and 38 Menzies SA, Hoff JT, et al (1992), “Middle cerebral artery occlusion in rats: a neurological and pathological evaluation of a reproducible model”, Neurosurgery 31, pp.100–106; discussion 106–107 39 Miyaji Y, Yoshimura S, et al (2015), “Effect of edaravone on favorable outcome in patients with acute cerebral large vessel occlusion: subanalysis of RESCUE-Japan Registry”, Neurol Med Chir (Tokyo) 55, pp.241-248 40 Mori E, Minematsu K, et al (2010), “Japan Alteplase Clinical Trial II Group : Effects of 0.6 mg/kg intravenous alteplase on vascular and clinical outcomes in middle cerebral artery occlusion: Japan Alteplase Clinical Trial II (J-ACT II)”, Stroke 41, pp.461– 465 41 Mulder MJ, van Oostenbrugge RJ, et al (2015), 2015 AHA/ASA Focused Update of the 2013 Guidelines for the Early Management of Patients With Acute Ischemic Stroke Regarding Endovascular Treatment, American Heart Association/American Stroke Association 42 Norrving B, Leys D, et al (2013) “Stroke Definition in the ICD-11 at the WHO”, World neurology 28, pp.3 43 O'Neill MJ, Clemens JA (2001), “UNIT 9.5 Rodent Models of Global Cerebral Ischemia”, Current Protocols in Neuroscience 44 Sacco RL, Kasner SE, et al (2013), “An Updated Definition of Stroke for the 21st Century : A Statement for Healthcare Professionals From the American Heart Association/American Stroke Association”, Stroke 44, pp.2064-2089 45 Sa YS, Kim SJ, Choi HS (2005), “The anticoagulant fraction from the leaves of Diospyros kaki L has an antithrombotic activity”, Arch Pharm Res 28, pp.667-741 46 Ulrich Dirnagl (2010), Rodent Models of Stroke, Humana Press, P 219 – 220 47 World Health Organization (2017), The top 10 causes of death, Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/ 48 Xie C, Xie Z, et al (2015), “Persimmon (Diospyros kaki L.) leaves: A review on traditional uses, phytochemistry and pharmacological properties”, Journal of Ethnopharmacology 49 Lê Thị Xoan, Nguyễn Thị Phượng và cộng sự (2016), “Neuroprotective effect of Panax notoginseng against ischemic neuronal injury in mice”, Tạp chí dược liệu 21(3), tr.169-174 50 Zhang K, Zhang Y, et al (2016), “Effects of phospholipid complexes of total flavonoids from Persimmon (Diospyros kaki L.) leaves on experimental atherosclerosis rats”, Journal of Ethnopharmacology 191, pp.245-53 51 Zhisha J, Mengcheng J, et al (1999), “The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals”, Food Chemistry 64, pp.555-559 ... HỌC DƯỢC HÀ NỘI  VŨ THỊ HỒNG NGỌC MSV: 1201420 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA CAO CHIẾT LÁ HỒNG TRÊN CHUỘT THỰC NGHIỆM GÂY TẮC ĐỘNG MẠCH NÃO GIỮA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người... cao chiết EtOH lá hồng 31 3.2 Triển khai mô hình gây tắc động mạch não giữa .33 3.3 Tác dụng bảo vệ thần kinh của cao chiết lá hồng thực nghiệm 34 3.3.1 Ảnh hưởng của. .. chọn để áp dụng vào mô hình gây tắc động mạch não giữa này 3.3 Tác dụng bảo vệ thần kinh của cao chiết hồng thực nghiệm 3.3.1 Ảnh hưởng của cao chiết lá hồng mức độ