Đồng thị thùy linh nghiên cứu xây dựng bộ dấu vân tay hóa học một số loài đinh lăng chi polyscias đƣợc trồng ở việt nam khóa luận tốt nghiệp dƣợc sĩ

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐỒNG THỊ THÙY LINH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG BỘ DẤU VÂN TAY HĨA HỌC MỘT SỐ LỒI ĐINH LĂNG CHI POLYSCIAS ĐƢỢC TRỒNG Ở VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2023 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐỒNG THỊ THÙY LINH Mã sinh viên: 1801374 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG BỘ DẤU VÂN TAY HĨA HỌC MỘT SỐ LỒI ĐINH LĂNG CHI POLYSCIAS ĐƢỢC TRỒNG Ở VIỆT NAM Người hướng dẫn: PGS TS Trần Văn Ơn NCS Vũ Hƣơng Thủy Nơi thực hiện: Công ty cổ phần Traphaco Bộ môn Thực vật HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên với tình cảm sâu sắc chân thành nhất, cho phép em đƣợc bày tỏ lòng biết ơn đến tất cá nhân tổ chức tạo điều kiện hỗ trợ, giúp đỡ em suốt trình học tập nghiên cứu đề tài Trong suốt thời gian từ bắt đầu học tập trƣờng đến em nhận đƣợc nhiều quan tâm, giúp đỡ quý thầy cô bạn bè nhƣ ban giám hiệu nhà trƣờng Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Trần Văn Ơn, ThS Phạm Thị Linh Giang – Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ truyền đạt kiến thức cho em suốt trình học tập nghiên cứu Nhờ có hƣớng dẫn, dạy bảo thầy nên đề tài nghiên cứu em hoàn thành tốt đẹp Em xin chân thành cảm ơn NCS ThS Vũ Hương Thủy – Phịng NC&PT Đơng dược, Công ty cổ phần Traphaco trực tiếp hƣớng dẫn, với hỗ trợ tận tình nghiên cứu viên, kiểm nghiệm viên Công ty Cổ phần Traphaco quan tâm giúp đỡ em hoành thành tốt báo cáo thời gian qua Cuối cùng, em xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình bạn bè ln khích lệ giúp đỡ em suốt thời gian học tập nghiên cứu Em mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp quý báu quý thầy cô để củng cố kiến thức khóa luận em đƣợc hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 05 tháng 06 năm 2023 Sinh viên Đồng Thị Thùy Linh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Polyscias 1.1.1 Tên khoa học vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố loài chi Polyscias 1.1.3 Thành phần hóa học loài thuộc chi Polyscias 1.1.4 Tác dụng sinh học số loài thuộc chi Polyscias 1.2 Chi Polycias Việt Nam 11 1.2.1 Loài Polyscias fruticosa (L.) Harms 11 1.2.2 Loài Polyscias filicifolia (C.Moore ex E.Fourn.) L.H.Bailey 11 1.2.3 Loài Polyscias guilfoylei (Bull) L.H Bailey 12 1.2.4 Loài Polyscias balfouriana (Andre) L.H Bailey 12 1.2.5 Loài Polyscias scutellaria (Burm.f.) Fosberg 13 1.3 Vân tay sắc ký thực vật phƣơng pháp HPLC 13 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 15 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 15 2.1.2 Trang thiết bị nghiên cứu 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký lựa chọn quy trình chiết mẫu nghiên cứu 18 2.2.2 Xây dựng dấu vân tay sắc ký số loài thuộc chi Polyscias đƣợc trồng Việt Nam 18 2.2.3 Xây dựng phân loại dựa sắc ký đồ mẫu nghiên cứu 18 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu thử 18 2.3.2 Phƣơng pháp lựa chọn điều kiện triển khai sắc ký 19 2.3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu tối ƣu hóa quy trình chiết xuất mẫu thử 20 2.3.4 Phƣơng pháp phân tích vân tay sắc ký dịch chiết số lồi chi Polyscias theo quy trình tối ƣu hóa 21 2.3.5 Xây dựng phân loại dựa hình ảnh sắc ký đồ 22 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 23 3.1 Kết khảo sát điều kiện sắc ký lựa chọn quy trình chiết mẫu nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp bề mặt đáp ứng (RSM) 23 3.1.1 Kết khảo sát điều kiện sắc ký 23 3.1.2 Kết lựa chọn quy trình chiết mẫu nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp bề mặt đáp ứng (RSM) 24 3.2 Kết xây dựng dấu vân tay sắc ký số loài thuộc chi Polyscias đƣợc trồng Việt Nam 29 3.3 Kết xây dựng phân loại dựa kết HPLC mẫu nghiên cứu 33 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 35 4.1 Về kết khảo sát điều kiện sắc ký lựa chọn quy trình chuẩn bị mẫu thử 35 4.1.1.Về kết khảo sát điều kiện sắc ký 35 4.1.2.Về kết lựa chọn quy trình chuẩn bị mẫu thử 35 4.2 Về kết xây dựng dấu vân tay hóa học số mẫu nghiên cứu chi Polyscias 36 4.2.1.Về phƣơng pháp phân tích liệu sắc ký đồ 36 4.2.2.Về pic sắc ký đặc trƣng chi pic sắc ký đặc trƣng loài 36 4.3 Về khác biệt diện tích pic số chất chuẩn đối chiếu sắc ký đồ mẫu nghiên cứu 37 4.4 Về kết xây dựng phân loại hóa học mẫu nghiên cứu 40 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 5.1 Kết luận 41 5.1.1 Về kết vân tay sắc ký 41 5.1.2 Về phân loại dựa vào đặc điểm hóa học 41 5.2 Đề xuất 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt 2FI AdeqP CV% EtOH Glc GlcA HPLC LoF MeOH MLR MSE P RO RSM Tên đầy đủ Nghĩa Tiếng Việt Two factor interaction Adequate precision Coefficient of Variation Ethanol β-D-glucopyranosyl β-D-Glucuronopyranosyl High Performance Liquid Chromatography Lack of fit Methanol Multivarible Linear Regression Mean squared error Polyscias Reverse osmosis Respone Surface Methodology Tƣơng tác yếu tố Độ xác đầy đủ Hệ số biến thiên Sắc ký lỏng hiệu cao Sự thiếu phù hợp Hồi quy tuyến tính đa biến Sai số tồn phƣơng trung bình Thẩm thấu ngƣợc Phƣơng pháp đáp ứng bề mặt DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Cơng thức số saponin lồi thuộc chi Polyscias Bảng 2.1 Danh mục ký hiệu mẫu nghiên cứu 15 Bảng 2.2 Cơng thức hóa học tên khoa học chất đối chiếu 16 Bảng 3.1 Ma trận thiết kế thí nghiệm kết thực nghiệm 25 Bảng 3.2 Phƣơng trình hồi quy tuyến tính MLR1 MLR2 .25 Bảng 3.3 Kết đánh giá mơ hình MLR1 MLR2 ANOVA 27 Bảng 3.4 Kết phân tích thống kê hai mơ hình MLR1 MLR2 27 Bảng 3.5 Điều kiện tối ƣu biến đầu vào 28 Bảng 3.6 Kết kiểm định thực nghiệm 29 Bảng 3.7 Sự xuất pic sắc ký sắc ký đồ dịch chiết mẫu nghiên cứu 32 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Công thức hợp chất sterol Hình 1.2 Dẫn xuất acid propanoic hợp chất lignan Hình 1.3 Dẫn xuất cyanogen Hình 1.4 Các hợp chất phenolic .7 Hình 1.5 Công thức cerebrosid Hình 1.6 Cơng thức hợp chất polycetylen Hình 1.7 Cơng thức hợp chất tinh dầu Hình 3.1 Sắc ký đồ hỗn hợp chất đối chiếu PF2M3, PG3B điều kiện sắc ký .23 Hình 3.2 Sắc ký đồ hỗn hợp chất đối chiếu PF2M3, PG3B điều kiện sắc ký 23 Hình 3.3 Sắc ký đồ hỗn hợp chất đối chiếu PF2M3, PG3B điều kiện sắc ký .23 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan X1, X2 Y1, Y2, dung môi cố định nƣớc 26 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan X1, X2 Y1, Y2, dung môi cố định cồn 50% .26 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan X1, X2 Y1, Y2, dung môi cố định cồn 70% .26 Hình 3.7 Cây phân loại 30 mẫu nghiên cứu dựa kết sắc ký đồ 34 Hình 4.1 Biểu đồ so sánh diện tích pic PF2M3, PF2M10, PF2K4 mẫu nghiên cứu .39 ĐẶT VẤN ĐỀ Chi Polyscias - có tên chung Việt Nam Đinh lăng, chi lớn thứ họ Nhân sâm, phân bố rộng khắp Đông Nam Á khu vực Thái Bình Dƣơng Tại Việt Nam đa số loài Đinh lăng đƣợc sử dụng làm cảnh, có số lồi đƣợc sử dụng làm thuốc, phổ biến Đinh lăng nhỏ Polyscias fruticosa (L.) Harms Nhiều nghiên cứu thành phần nhƣ saponin, polyacetylen, tinh dầu hay cao chiết số lồi đinh lăng có tác dụng chống oxy hóa, tăng lực [5], kích thích thần kinh trung ƣơng [9], ức chế phát triển tế bào ung thƣ [14, 19, 21, 25], kích thích hệ miễn dịch [38],… Bên cạnh Đinh lăng loại dễ trồng phát triển tốt điều kiện khí hậu Việt Nam, đƣợc Thủ tƣớng Chính phủ phê duyệt quy hoạch vùng trồng nhiều tỉnh vùng trung du miền núi Bắc Bộ, đồng sông Hồng Bắc Trung Bộ Việt Nam [10] Tuy nhiên, qua thực tế cho thấy loài Đinh lăng khác chí lồi nhƣng vùng sinh thái khác có đặc điểm hình thái, suất chất lƣợng dƣợc liệu khác Vì vậy, việc nhận biết nhƣ phân biệt loài thuộc chi Polyscias đặc biệt quan trọng ứng dụng sau Đã có số nghiên cứu phân loại lồi đinh lăng theo đặc điểm hình thái Thực vật chí Trung Quốc, Thực vật chí Malesiana [33, 35] hay dựa đặc điểm di truyền nhƣ nghiên cứu đa hình di truyền sử dụng PAPD Nguyễn Thị Ngọc Trâm giống lồi Polyscias fruticosa [12], phân tích thị DNA ITS MATK số loài đinh lăng Việt Nam Huỳnh Thị Thu Huệ [8] góp phần cung cấp liệu phân biệt loài thuộc chi Polyscias Nhằm tìm kiếm cơng cụ hóa học bên cạnh cơng cụ phân tích hình thái, đặc điểm di truyền để làm sở cho việc kiểm nghiệm sử dụng loài chi Polyscias, đề tài: “Nghiên cứu xây dựng dấu vân tay hóa học số loài Đinh lăng chi Polyscias đƣợc trồng Việt Nam” đƣợc thực với mục tiêu: - Xây dựng dấu vân tay sắc ký số loài thuộc chi Polyscias đƣợc trồng Việt Nam phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao – HPLC - Xây dựng phân loại loài chi Polyscias đƣợc trồng Việt Nam dựa thành phần hóa học (sắc ký đồ mẫu nghiên cứu) 1 1.1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN Tổng quan chi Polyscias 1.1.1 Tên khoa học vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại Armen Takhtajan “Flowering Plants” năm 2009 [13], vị trí phân loại chi Polyscias đƣợc tóm tắt nhƣ sau: Giới Thực vật (Plantae) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Cúc (Asteridae) Bộ Hoa tán (Apiales) Họ Nhân sâm (Araliaceae) Chi Đinh lăng (Polyscias) 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố loài chi Polyscias Chi Polyscias J R Forster & G Forster (chi Đinh lăng) chi lớn thứ họ Nhân sâm Araliaceae với khoảng 116 loài đƣợc sử dụng rộng rãi để làm cảnh số loài mang lại giá trị y học cao [30] Các lồi thuộc chi Polyscias có dạng gỗ nhỏ hay nhỡ có dáng mảnh tán đẹp, thƣờng xanh, không gai Lá kép chân vịt hay đơn có thùy chân vịt kép lơng chim với chét có hình dạng thay đổi; kèm khơng có hay hợp lại gốc thành phần phụ nhỏ Cụm hoa tán tạo thành chùm hay chùy, cuống hoa có khớp rụng hay có khớp Đài nguyên hay có Cánh hoa 5, tiền khai van Nhị bao phấn hình trứng hay thn; bầu dƣới, ơ, - ơ; vịi nhụy - 4, rời hay hợp gốc Quả dẹt, gần hình cầu, hạt dẹt [6] Chi Polyscias tập trung vùng nhiệt đới thƣờng phân bố nhiều vùng Đông Nam Á khu vực Thái Bình Dƣơng [30] Đinh lăng nƣớc ta đa số nhập trồng, phần lớn dùng làm cảnh số đƣợc ứng dụng làm thuốc Theo tài liệu đinh lăng trồng Việt Nam đƣợc chia thành nhóm có lồi thứ [11]: - Polyscias fruticosa (L.) Harms – Đinh lăng nhỏ, gỏi cá, nam dƣơng lâm - Polyscias filicifolia (C.Moore ex E.Fourn.) L.H.Bailey – Đinh lăng to, đinh lăng ráng Polyscias guilfoylei (Bull) L.H.Bailey – Đinh lăng trổ, đinh lăng viền bạc Polyscias balfouriana (Andre) L.H Bailey – Đinh lăng tròn Polyscias guilfoylei cv quinquefolia (Bull) L.H Bailey – Đinh lăng Polyscias scutellarie (Burm.f.) Fosberg – Đinh lăng đĩa (a) (b) M22 (a) Dịch chiết gốc; (b) Dịch chiết pha loãng lần M23 26 (a) (b) M24 (a) Dịch chiết gốc; (b) Dịch chiết pha loãng lần 27 (a) (b) M25 (a) Dịch chiết gốc; (b) Dịch chiết pha loãng lần 28 (a) (b) M26 (a) Dịch chiết gốc; (b) Dịch chiết pha loãng lần M27 29 M28 M29 M30 30 PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ HỆ SỐ MATCH GIỮA PIC SẮC KÝ CỦA CÁC MẪU NGHIÊN CỨU VÀ PIC SẮC KÝ CỦA CÁC CHẤT ĐỐI CHIẾU M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 M24 M25 M26 M27 M28 M29 M30 Quercitrin 965 998 487 478 322 843 992 130 462 987 901 993 997 994 999 990 999 783 972 939 664 914 662 826 840 710 975 452 922 867 PF2M3 990 997 976 950 977 974 999 967 986 997 994 995 973 993 980 988 997 999 991 988 997 994 999 995 994 994 988 993 997 999 PG3B 8 13 16 38 20 36 25 0 0 995 995 1000 999 998 999 995 999 999 999 900 900 952 993 31 PG4B 835 819 826 929 864 922 795 0 995 975 981 999 990 973 963 971 971 918 964 971 977 963 906 784 748 695 787 PF2M10 999 1000 1000 999 1000 900 1000 1000 1000 1000 1000 999 999 999 999 999 1000 999 1000 999 999 997 1000 999 991 998 997 987 919 997 PF2K4 996 998 999 998 1000 993 999 999 999 995 999 998 983 1000 999 985 984 958 999 1000 974 992 953 1000 1000 1000 995 976 914 956 PHỤ LỤC 6: KẾT QUẢ CHỒNG SẮC KÝ ĐỒ CỦA CÁC LOÀI ĐINH LĂNG (I) (II) (III) (IV) Chú thích: (I) Đinh lăng nhỏ (II) Đinh lăng to (III) Đinh lăng trổ (IV) Đinh lăng tròn (V) Đinh lăng (V) 32 PHỤ LỤC 7: PHỔ UV CỦA PIC SẮC KÝ TẠI tR TƢƠNG ỨNG PHỤ LỤC 7.1: CHẤT ĐỐI CHIẾU PG3B Phổ UV chất đối chiếu PG3B M1 M2 M3 M4 M5 M7 33 M8 M9 M10 M11 34 PHỤ LỤC 7.2: CHẤT ĐỐI CHIẾU PG4B Phổ UV chất đối chiếu PG4B M1 M2 M3 M4 M5 M6 35 M8 M27 M28 M29 M30 36 PHỤ LỤC 7.3: CHẤT ĐỐI CHIẾU QUERCITRIN Phổ UV chất đối chiếu Quercitrin M1 M2 M3 M4 M5 M6 37 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14 38 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 M24 39 M25 M26 M27 M28 M29 M30 40