Nghiên cứu tác dụng hạ huyết áp của gối hạc leea rubra b

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN TRỌNG TRIỀU NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ HUYẾT ÁP CỦA GỐI HẠC Leea rubra B KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN TRỌNG TRIỀU MÃ SINH VIÊN: 1501517 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ HUYẾT ÁP CỦA GỐI HẠC Leea rubra B KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Hà Vân Oanh TS Lê Thị Xoan Nơi thực hiện: Bộ môn Dược học cổ truyền Khoa Dược lý - Viện Dược liệu HÀ NỘI – 2020 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Hà Vân Oanh, TS Lê Thị Xoan, ThS Phí Thị Xuyến – người quan tâm, giúp đỡ hướng dẫn tơi tận tình suốt q trình thực đề tài Tơi xin cảm ơn thầy cô, anh chị Bộ môn Dược học cổ truyền hỗ trợ, động viên tơi q trình nghiên cứu Tôi xin cảm ơn PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng anh chị khoa Dược lý – Hóa sinh, Viện Dược Liệu ln tạo điều kiện, giúp đỡ tơi q trình thực đề tài khoa; cảm ơn khoa Tài nguyên cung cấp mẫu dược liệu cho đề tài, cảm ơn anh chị khoa Hóa thực vật giúp đỡ chuẩn bị mẫu nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, phịng Đào tạo tồn thể thầy giáo, cán trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho học tập rèn luyện suốt năm học vừa qua Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, thầy cô giúp đỡ, động viên tơi hồn thành khóa luận Hà Nội, ngày 22 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Trần Trọng Triều Bảng chữ viết tắt ABTS 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline6-sulfonic acid) ACE Angiotensin converting enzyme Ang I Angiotensin I Ang II Angiotensin II BSC Benzenesulfonyl chloride COX Cyclooxygenase DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 2,2’-diphenyl-1-picrylhydrazyl FRAP Ferric reducing antioxidant power GAE Gallic acid equivalent HA Acid hippuric HHL N-Hippuryl-His-Leu hydrate 5-LOX Lipoxygenase TEAC Trolox equivalent antioxidant capacity RAA Renin-angiotensin-aldosterone Danh mục bảng STT Nội dung Trang Bảng 3.1 Hoạt tính ức chế enzyme ACE cao chiết Gối hạc 24 Bảng 3.2 Hoạt tính ức chế enzyme ACE captopril 24 Bảng 3.3 Tác dụng cao chiết Gối hạc lên huyết áp tối đa 26 (HATĐ) chuột gây tăng huyết áp 2K1C Bảng 3.4 Tác dụng cao chiết Gối hạc lên huyết áp tối thiểu 27 (HATT) chuột gây tăng huyết áp 2K1C Bảng 3.5 Ảnh hưởng Gối hạc lên nhịp tim chuột 2K1C 29 Danh mục hình STT Nội dung Trang Hình 1.1 Dược liệu Gối hạc Hình 1.2 Cơ chế bệnh sinh tăng huyết áp Hình 1.3 Cơ chế điều hóa huyết áp ACE 15 Hình 2.1 Phản ứng phân cắt HHL ACE 20 Hình 2.2 Phẫu thuật gây hẹp động mạch thận chuột cống 22 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn hoạt tính ức chế ACE nồng 25 độ cao chiết Gối hạc captopril Hình 3.2 Kết HATĐ sau tuần điều trị 26 Hình 3.3 Kết HATT sau tuần điều trị 28 Hình 3.4 Kết nhịp tim sau tuần điều trị 29 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU GỐI HẠC VÀ BỆNH TĂNG HUYẾT ÁP 11 1.1 Tổng quan dược liệu Gối hạc 11 1.1.1 Đặc điểm hình thái 11 1.1.2 Phân bố, thu hái chế biến 11 1.1.3 Công dụng tác dụng dược lý Gối hạc 12 1.1.4 Thành phần hóa học 15 1.2 Tăng huyết áp vai trò hệ renin-angiotensin (RAA) 16 1.2.1 Tăng huyết áp 16 1.2.3 Mơ hình gây tăng huyết áp hẹp động mạch thận 20 1.3 Enzyme chuyển angiotensin ACE 21 1.3.1 Phân loại ACE 21 1.3.2 Cấu trúc vùng hoạt động ACE 22 1.3.3 Đặc tính ACE 23 1.3.4 Cơ chế hoạt động ACE điều hòa huyết áp 23 1.4 Một số phương pháp phổ biến để xác định tác dụng ức chế enzyme chuyển angiotensin 24 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 27 2.1.1 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 27 2.1.2 Động vật thí nghiệm 27 2.1.3 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ 27 2.2 Nội dung nghiên cứu 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu 28 2.3.1 Đánh giá tác dụng ức chế ACE in vitro 28 2.3.2 Đánh giá tác dụng hạ huyết áp Gối hạc mơ hình chuột tăng huyết áp 2K1C 30 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33 3.1 KẾT QUẢ 33 3.1.1 Tác dụng ức chế ACE in vitro dịch chiết Gối hạc 33 3.1.2 Tác dụng hạ huyết áp mơ hình 2K1C 35 3.2 BÀN LUẬN 40 3.2.1 Về phương pháp quy trình thí nghiệm 40 3.2.2 Về kết nghiên cứu 42 KẾT LUẬN 46 KIẾN NGHỊ 47 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tăng huyết áp nguyên nhân gây tử vong hàng đầu giới Việt Nam Theo kết nghiên cứu dịch tễ nước ta, có 21,1% bệnh nhân mắc tăng huyết áp đó, tỷ lệ bệnh nhân phát 9,3% bệnh nhân điều trị 4,7% Tăng huyết áp đóng vai trị yếu tố nguy số bệnh nguy hiểm suy tim, rung nhĩ, bệnh thận mạn, bệnh mạch máu ngoại vi, đột quỵ bệnh tim thiếu máu cục [29] Trong phác đồ điều trị tăng huyết áp nay, nhóm thuốc ức chế ACE lựa chọn đầu tay cho bệnh nhân Tuy nhiên, điều trị thuốc nhóm này, bệnh nhân hay gặp phải số tác dụng không mong muồn ho khan, vị giác, phát ban Do đó, để tìm thuốc an tồn hơn, số nhà khoa học giới tập trung hướng nghiên cứu tìm kiếm chất ức chế ACE từ tự nhiên Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, mưa nhiều, độ ẩm cao đặc điểm thổ nhưỡng đa dạng, tất tạo nên nguồn tài nguyên thực vật vô phong phú Do đó, có tiềm lớn nguồn nguyên liệu để phát khai thác hợp chất có tác dụng ức chế ACE Dược liệu Gối hạc đưa vào danh mục vị thuốc cổ truyền thiết yếu thuộc nhóm thuốc khu phong trừ thấp Tuy nhiên, thông qua số nghiên cứu thực trước đây, cho thấy tiềm lớn tác dụng điều trị khác Gối hạc Riêng tác dụng hạ huyết áp, khả ức chế ACE Gối hạc đánh giá nghiên cứu sàng lọc Brazil, kết cho thấy Gối hạc có tác dụng ức chế ACE mạnh [11] Ngoài ra, số loài chi với Gối hạc nghiên cứu thường dùng điều trị thuốc hạ huyết áp [18] Từ sở đó, chúng tơi định thực nghiên cứu toàn diện đầy đủ tác dụng ức chế ACE Gối hạc in vitro tác dụng hạ huyết áp in vivo Nghiên cứu tác dụng hạ huyết áp Gối hạc Leea rubra B tiến hành với mục tiêu sau: Đánh giá tác dụng ức chế ACE in vitro Gối hạc Leea rubra Đánh giá tác dụng hạ huyết áp Gối hạc Leea rubra mô hình gây hẹp động mạch thận bên chuột cống trắng 10 quercetin Quercetin chứng minh tác dụng hạ huyết áp chuột tăng huyết áp tự phát, chuột truyền angiotensin, chuột tăng huyết áp mô hình 2K1C Trên người, flavonoid thể tác dụng hạ huyết áp bệnh nhân tăng huyết áp giai đoạn 1, khơng có tác dụng với nhóm tiền tăng huyết áp [31] Đặc biệt, quercetin ức chế tác dụng bradykinin ACE, tác dụng dùng thuốc đối kháng thụ thể B2 bradykinin [22] Vì vậy, từ nghiên cứu này, quercetin thành phần quan trọng tác dụng hạ huyết áp ức chế enzyme ACE 45 KẾT LUẬN Trong khuôn khổ đề tài, thu kết sau: - Xác định dịch chiết nước rễ Gối hạc có khả ức chế ACE mạnh, kết giá trị IC50 1,31 ± 0,44 µg/ml - Chứng minh dịch chiết nước rễ Gối hạc có tác dụng hạ đồng thời huyết áp tâm thu huyết áp tâm trương mơ hình động vật 2K1C liều điều trị 300 mg/kg Đối với liều 100mg/kg tác dụng sau tuần điều trị Nhịp tim không bị ảnh hưởng trình điều trị Gối hạc 46 KIẾN NGHỊ Để tăng tính ứng dụng kết nghiên cứu, để tối ưu hóa quy trình thí nghiệm, tơi xin đề xuất số nội dung nghiên cứu tiếp theo: - Tiếp tục nghiên cứu, đánh giá thêm tác dụng hạ huyết áp Gối hạc, khả hạ huyết áp sau uống xác định thời gian bắt đầu có tác dụng - Định lượng thành phần có khả gây tác dụng Gối hạc, flavonoid - Cải tiến quy trình gây tăng huyết áp mơ hình 2K1C, nghiên cứu loại kẹp có thiết kế nguyên liệu phổ biến, để ứng dụng rộng rãi tăng tỷ lệ thành cơng xây dựng mơ hình 47 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Đỗ Huy Bích, Nguyễn Tập, et al (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT, Hà Nội, 1, tr 874-875 [2] Vũ Đức Lợi, Phạm Giang Nam, et al (2016), "Chiết xuất, phân lập số hợp chất từ Gối hạc", Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, 32(1), pp 12-17 [3] Đỗ Tất Lợi (2006), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y HỌC, Hà Nội, tr 522 [4] Cấn Văn Mão, Nguyễn Minh Núi (2017), "Xây dựng mơ hình tăng huyết áp chuột cống", Tạp chí Y – Dược học quân sự, 3, pp [5] PGS.TS Trần Thị Liên Minh, MỘT SỐ CHUYÊN ĐỀ SINH LÝ HỌC Nhà Xuất Y học, 2017 [6] Nguyễn Thị Phương (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học Gối hạc (Leea rubra Blume ex Spreng, họ Leeaceae), Luận án Tiến sĩ Dược học, Viện Dược Liệu Trung Ương Tài liệu Tiếng Anh [7] Polak A, Harasim-Symbor E, et al (2018), "Animal model of hypertension – visited", PROGRESS IN HEALTH SCIENCES, 8(1), pp 167-175 [8] Anne Adsersen, Henning Adsersen (1997), "Plants from Reunion Island with alleged antihypertensive and diuretic effects an experimental and ethnobotanical evaluation", Journal of Ethnopharmacology, 58, pp 189206 [9] Souravh Bais (2013), "A Phytopharmacological Review on an Important Medicinal Plant: Leea indica", Inventi Journal, 2013(1), pp 1-4 [10] Nidia Basso, Norberto A Terragno (2001), "History About the Discovery of the Renin-Angiotensin System", Hypertension, 38, pp 1246-1249 48 [11] Fernao C Braga, Carla P Serra, et al (2007), "Angiotensin-converting enzyme inhibition by Brazilian plants", Fitoterapia, 78, pp 353-358 [12] Daniel F Catanzaro (2018), Textbook of Nephro-Endocrinology (Second Edition), ELSEVIER INC, tr 389-400 [13] Sarinrat Chattiranan, Sirimas Niyomthai, et al (2013), "Phytochemical Screening Total Phenolic and Flavonoid Content, and Antioxidant Activity of Leea rubra Blume", The Science Journal of Phetchaburi Rajabhat University, 2, pp 20-30 [14] Stephen P Chelko, Chad W Schmiedt, et al (2012), "A novel vascular clip design for the reliable induction of 2-kidney, 1-clip hypertension in the rat", J Appl Physiol, 112, pp 362-366 [15] Jiwang Chen, Yimei Wang, et al (2013), "Comparison of analytical methods to assay inhibitors of angiotensin I-converting enzyme", Food Chemistry, 141, pp 3329-3334 [16] Hong-Son Cheung, Feng-Lai Wang, et al (1980), "Binding of Peptide Substrates and Inhibitors of Angiotensin-converting Enzyme importance of the COOH-terminal dipeptide sequence", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 255(2), pp 401-407 [17] D W Cushman, H S Cheung (1971), "Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung", Biochemical Pharmacology, 20, pp 1637-1648 [18] D.Singh, Y.Y.Siew, et al (2019), Medicinal plants: Chemistry, Pharmacology and Therapeutic applications, CRC Press, Boca Raton, tr 32 [19] Genaro Fernandez, Junsoo Alex Lee, et al (2015), "The Baroreflex in hypertension", Current Hypertension Reports, 17(3), pp 1-8 [20] J P Fisher, J F R Paton (2012), "The sympathetic nervous system and blood pressure in humans: implications for hypertension", Journal of Human Hypertension, 26, pp 463-475 49 [21] Gregory Y H Lip, Gareth Beevers, Eoin O'Brien (2001), "The pathophysiology of hypertension", The BMJ, 322(7291), pp 912-916 [22] L P N Hackl, G.Cuttle, et al (2002), "Inhibition of AngiotesinConverting Enzyme by Quercetin Alters the Vascular Response to Brandykinin and Angiotensin I", Pharmacology, 65, pp 182-186 [23] Yesmine Ben Henda, Anis Labidi, et al (2013), "Measuring Angiotensin-I Converting Enzyme Inhibitory Activity by Micro Plate Assays: Comparison Using Marine Cryptides and Tentative Threshold Determinations with Captopril and Losartan", J agric Food Chem, 61, pp 10685-10690 [24] Barton Holmquist, Peter Bünning, et al (1979), "A continuous spectrophotometric assay for angiotensin converting enzyme", Analytical Biochemistry, 95(2), pp 540-548 [25] Li Jin, Zhe Hao Piao, et al (2017), "Gallic Acid Reduces Blood Pressure and Attenuates Oxidative Stress and Cardiac Hypertrophy in Spontaneously Hypertensive Rats", Scientific reports, 15670, pp 1-14 [26] Sarinya Kadchumsang, Panee Sirisaard, et al (2014), "Antibacterial and Antioxidant Activities of Various Fraction of Leea rubra (Leeaceae)", Journal of Natural Sciences Research, 4(11), pp 1-4 [27] Guan-Hong Li, Huan Liu, et al (2005), "Direct spectrophotometric measurement of angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity for screening bioactive peptides", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 37, pp 219-224 [28] Giuseppe Mancia, Guido Grassi (2014), "The Autonomic Nervous System and Hypertension", Circulation Research, 114, pp 1804-1814 [29] Lana Meiqari, Dirl Essink, et al (2019), " Prevalence of Hypertension in Vietnam: A Systematic Review and Meta-Analysis", Asia Pac J Public Health, 31(2), pp 101-112 50 [30] Snehal S Patel, Ramesh K Goyal (2011), "Cardioprotective effects of gallic acid in diabetes-induced myocardial dysfunction in rats", Original Article, 3, pp 239-245 [31] Francisco Perez-Vizcaino, Juan Duarte, et al (2009), "Antihypertensive effects of the flavonoid quercetin", Pharmacological Reports, 61, pp 6775 [32] Nguyen Thi Phuong, Vu Van Tuan, et al (2014), "Triterpenes from the Leaves of Leea rubra Blume ex Spreng", Journal of Medicinal Materials, 19(5), pp 307-309 [33] Katarzyna Regulska, Beata Stanisz, et al (2014), "How to design a potent, specific, and stable angiotensin-converting enzyme inhibitor", Drug Discovery Today, 19(11), pp 1731-1743 [34] Khuraijam Dhanachandra Singh, Sadashiva S Karnik (2016), "Angiotensin Receptors: Structure, Function, Signaling and Clinical Applications", Journal of Cell Signaling, 1(2), pp 1-8 [35] Prapapan Temkitthawon, Jarupa Viyoch, et al (2008), "Screening for Phosphodiesterase Inhibitory Activity of Thai Medicinal Plants", Journal of Ethnopharmacology, 119(2), pp 214-217 [36] Kazushi Tsuda (2012), "Renin-Angiotensin System and Sympathetic Neurotransmitter Release in the Central Nervous System of Hypertension", Hindawi International Journal of Hypertension, 2012, pp 1-11 [37] Hajime Ueno, Syunji Horie, et al (1988), "Chemical and pharmaceutical studies on medicinal plants in paraguay geraniin, an angiotensin converting enzyme inhibitor from paraparaimi, Phyllanthus niruri", Journal of Natural Product, 51(2), pp 357-359 [38] Philippe Wiesel, Lucia Mazzolai, et al (1997), "Two-Kidney, One Clip and One-Kidney, One Clip Hypertension in Mice", Hypertension, 29(4), pp 1025-1030 51 [39] Jinsheng Zeng, Yiqin Zhang, et al (1998), "Two-Kidney, Two Clip Renovascular Hypertensive Rats Can Be Used as Stroke-prone Rats", Stroke, 29(8), pp 1708-1714 [40] Sylva L U Schwager, Hazel R Corradi, et al (2006), "Crystal Structure of the N Domain of Human Somatic Angiotensin I-converting Enzyme Provides a Structural Basis for Domain-specific Inhibitor Design", Journal of Molecular Biology, 357(3), pp 964-974 [41] E D Sturrock, R Natesh, et al (2004), "Structure of angiotensin Iconverting enzyme", Cellular and Molecular Life Sciences, 61(21), pp 2677-2686 [42] C J Umberger, F F Fiorese (1963) "Colorimetric method for hippuric acihd," Clinical chemistry, vol 9, pp 91-96 [43] Yusuke Sata, Geoffrey A Head, et al (2018), "Role of the Sympathetic Nervous System and its Modulation in Renal Hypertension", Frontier in Medicine, 5, pp 1-10 52 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Bảng thành phần hóa học Gối hạc Nhóm Cấu trúc hóa học/Đặc điểm Tên hợp chất Acid hữu Acid 3,4,5- có cấu trúc trihydroxybenzoic dẫn xuất (acid gallic) phenolic Acid 3,4- dihydroxybenzoic (aid protocatechuic) Acid 4- hydroxybenzoic 53 Triterpenoid Acid ursolic Acid oleanolic Acid maslinic 54 β-amyrin lup-20(29)-en-3β,6αdiol Nhóm sterol β-sitosterol 55 Daucosterol Stigmast-4-enzyme3,6-dion Hợp chất Myricitrin flavonoid 56 Rhamnetin-3-O-a-Lrhamnopyranosid Juglanin Europetin-3-O-α-Lrhamnopyranosid Kaempferol 57 Quercetin Artabotrysid B Kaempferol-3-O-α-L- Chưa phát loài khác rhamnopyranosyl(1 chi Leea 2)-α-Larabinofuranosid 58 Dẫn xuất Arctiin lignan Chưa phát loài khác thuộc chi Leea 59 ... Nghiên cứu tác dụng hạ huyết áp Gối hạc Leea rubra B tiến hành với mục tiêu sau: Đánh giá tác dụng ức chế ACE in vitro Gối hạc Leea rubra Đánh giá tác dụng hạ huyết áp Gối hạc Leea rubra mơ hình... tác dụng hạ huyết áp in vivo dược liệu Gối hạc 14 1.1.3.3 Một số nghiên cứu tác dụng hạ huyết áp loài chi Leea Cho đến nay, có nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế ACE số dược liệu Brazil có Gối. .. với Gối hạc nghiên cứu thường dùng điều trị thuốc hạ huyết áp [18] Từ sở đó, chúng tơi định thực nghiên cứu toàn diện đầy đủ tác dụng ức chế ACE Gối hạc in vitro tác dụng hạ huyết áp in vivo Nghiên