Tiếp tục nghiên cứu bào chế và đánh giá vi cầu leuprolid acetat

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HỒNG NHUNG TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ VI CẦU LEUPROLID ACETAT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HỒNG NHUNG MÃ SINH VIÊN: 1501377 TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ VI CẦU LEUPROLID ACETAT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Dương Thị Hồng Ánh HVCH Nguyễn Thế Phương Nơi thực hiện: Bộ môn Bào Chế HÀ NỘI – 2020 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: TS Dương Thị Hồng Ánh Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Thị Hải Yến, HVCH Nguyễn Thế Phương – người tận tâm dẫn, hết lòng giúp đỡ tạo điều kiện Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô, anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Bào chế quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện để em hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Ban Giám hiệu nhà trường, phòng ban cán nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, người tạo điều kiện cho em học tập tiếp thu kiến thức suốt năm qua Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, tập thể sinh viên đồng hành, giúp đỡ em suốt trình thực tập hồn thành khóa luận Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Sinh viên Trần Thị Hồng Nhung MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan leuprolid acetat 1.1.1 Cơng thức hóa học 1.1.2 Tính chất vật lý, hóa học .2 1.1.3 Độ ổn định .3 1.1.4 Ứng dụng điều trị 1.2 Tổng quan polyme PLGA .5 1.2.1 Cấu trúc 1.2.2 Tính chất lý hóa phân hủy PLGA 1.3 Tổng quan vi cầu PLGA-LA 1.3.1 Phương pháp bào chế vi cầu nhũ hóa kép kết hợp bốc dung môi 1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất nạp dược chất 1.3.2.1 Dược chất 1.3.2.2 PLGA .9 1.3.2.3 Dung môi hữu tốc độ loại dung môi hữu 12 1.3.2.4 Chất nhũ hóa thành phần khác pha nước ngoại 13 1.3.2.5 Tỷ lệ pha nước nội/pha nước ngoại 13 1.3.2.6 Độ bền kích thước nhũ tương 14 1.3.2.7 Tốc độ nhũ hóa 14 1.3.2.8 Yếu tố khác 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị sử dụng .15 2.1.1 Nguyên vật liệu 15 2.1.2 Thiết bị 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Thẩm định số tiêu phương pháp định lượng LA HPLC 16 2.3.2 Phương pháp nhiệt quét vi sai (DSC) 18 2.3.3 Phương pháp phổ hồng ngoại FTIR 18 2.3.4 Phương pháp đánh giá độ ổn định LA mơi trường nước có PLGA 18 2.3.4.1 Pha môi trường pH khác 18 2.3.4.2 Phương pháp đánh giá hàm lượng dược chất 19 2.3.5 Phương pháp đánh giá khả hấp phụ LA PLGA pH 7,4 19 2.3.6 Phương pháp bào chế đánh giá vi cầu 20 2.3.6.1 Phương pháp bào chế vi cầu 20 2.3.6.2 Đánh giá số đặc tính vi cầu chứa LA 22 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 24 3.1 Thẩm định phương pháp định lượng leuprolid acetat HPLC 25 3.1.1 Tính thích hợp hệ thống 25 3.1.2 Độ đặc hiệu 25 3.1.3 Độ tuyến tính 26 3.1.4 Hiệu suất chiết tương đối vi cầu 27 3.2 Kết đánh giá độ ổn định LA mơi trường nước có PLGA 28 3.3 Đánh giá khả hấp phụ LA PLGA 30 3.3.1 Phân tích nhiệt quét vi sai (DSC) 30 3.3.2 Phổ hồng ngoại FTIR 31 3.4 Ảnh hưởng thông số kĩ thuật đến đặc tính vi cầu 33 3.4.1 Phương pháp nhũ hóa lần 33 3.4.2 Phương pháp rắn hóa vi cầu 35 3.4.3 pH pha nước nội 36 3.4.4 Thời gian nhũ hóa lần .37 3.4.5 Thể tích pha lỗng 38 3.5 Ảnh hưởng cơng thức bào chế đến đặc tính vi cầu 39 3.5.1 Nồng độ polyme 39 3.5.2 Nồng độ dược chất 40 3.6 Đánh giá đặc tính vi cầu 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Tên viết tắt DCM Dicloromethan DĐVN Dược điển Việt Nam DMHC Dung môi hữu EE% Entrapment Efficiency % - Hiệu suất nạp dược chất EMA European Medicines Agency Cơ quan quản lý Dược phẩm Châu Âu FDA United State Food and Drug Administration Cơ quan quản lý thuốc thực phẩm Hoa Kỳ GTTB Giá trị trung bình KLPT Khối lượng phân tử KTTP Kích thước tiểu phân LA Leuprolid acetat LClt % Hàm lượng phần trăm dược chất vi cầu lý thuyết LCtt% Hàm lượng phần trăm dược chất vi cầu thực tế MT Môi trường N/D Nước/Dầu N/D/N Nước/Dầu/Nước NT1 Nhũ tương sơ cấp NT2 Nhũ tương thứ cấp PG Propylen glycol PLGA Poly acid lactic-co-glycolic PLGA-LA Vi cầu PLGA chứa dược chất leuprolid acetat DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Công thức dạng thuốc giải phóng kéo dài chứa leuprolid acetat Bảng 2.1 Nguyên liệu sử dụng nghiên cứu 15 Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 15 Bảng 3.1 Thẩm định tính thích hợp hệ thống HPLC 25 Bảng 3.2 Mối tương quan diện tích pic nồng độ dược chất leuprolid acetat môi trường pH 4,0 26 Bảng 3.3 Hiệu suất chiết tương đối vi cầu 27 Bảng 3.4 Dữ liệu thông số động học phân hủy LA mơi trường nước, đệm khác có mặt PLGA nhiệt độ 2-8oC 29 Bảng 3.5 Kết định lượng LA màng PLGA 30 Bảng 3.6 Thành phần bào chế vi cầu PLGA-LA phương pháp nhũ hóa kép kết hợp bốc dung môi 33 Bảng 3.7 Ảnh hưởng phương pháp tạo nhũ tương sơ cấp đến đặc tính vi cầu 35 Bảng 3.8 Ảnh hưởng phương pháp rắn hóa vi cầu đến hiệu đặc tính vi cầu 36 Bảng 3.9 Ảnh hưởng pH pha nước nội đến hiệu suất nạp dược chất 36 Bảng 3.10 Ảnh hưởng thời gian nhũ hóa lần đến đặc tính vi cầu 37 Bảng 3.11 Ảnh hưởng thể tích pha lỗng đến đặc tính vi cầu 38 Bảng 3.12 Thành phần bào chế vi cầu PLGA-LA với nồng độ polyme khác .39 Bảng 3.13 Ảnh hưởng nồng độ polyme đến đặc tính vi cầu 40 Bảng 3.14 Ảnh hưởng nồng độ dược chất pha nước nội đến đặc tính vi cầu 41 Bảng 3.15 Thành phần bào chế vi cầu thông số kĩ thuật 42 Bảng 3.16 KTTP, hiệu suất nạp dược chất vi cầu PLGA-LA 42 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Công thức phân tử leuprolid acetat Hình 1.2 Cấu trúc hóa học a) acid lactic, b) acid glycolic, c) PLGA Hình 1.3 Cơ chế phân hủy polyme a) ăn mịn tồn bộ, b) ăn mịn bè mặt Hình 1.4 Phương pháp nhũ hóa kép kết hợp bốc dung mơi .8 Hình 1.5 Các bước hình thành lớp vỏ vi cầu PLGA 11 Hình 1.6 Hình ảnh cấu trúc giọt nhũ tương 13 Hình 2.1 Quy trình bào chế vi cầu PLGA chứa leuprolid acetat 21 Hình 3.1 Sắc kí đồ mẫu trắng 25 Hình 3.2 Sắc kí đồ mẫu placebo 25 Hình 3.3 Sắc kí đồ mẫu chuẩn 26 Hình 3.4 Sắc kí đồ mẫu thử 26 Hình 3.5 Phổ UV mẫu chuẩn 26 Hình 3.6 Phổ UV mẫu thử 26 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích pic nồng độ dược chất môi trường đệm pH 4,0 27 Hình 3.8 Tỷ lệ LA cịn lại (%) mơi trường nước, đệm pH khác có mặt PLGA nhiệt độ 2-8oC 28 Hình 3.9 pH mơi trường nước, đệm khác 2-8oC 29 Hình 3.10 Phổ nhiệt quét vi sai màng PLGA-LA 31 Hình 3.11 Phổ nhiệt quét vi sai màng PLGA-LA (A), PLGA (B), LA (C), hỗn hợp vật lý PLGA, LA (D) .31 Hình 3.12 Phổ FTIR LA; PLGA; hỗn hợp vật lý LA,PLGA màng PLGA-LA 32 Hình 3.13 Hình ảnh nhũ tương N/D/N sử dụng thiết bị đồng hóa tốc độ cao (A), thiết bị siêu âm đầu dị (B) với độ phóng đại 400 lần 34 Hình 3.14 Ảnh hưởng thời gian sục khí đến KTTP, hiệu suất nạp dược chất .36 Hình 3.15 Ảnh hưởng pH pha nước nội đến hiệu suất nạp dược chất 36 Hình 3.16 Ảnh hưởng thời gian nhũ hóa lần đến KTTP, hiệu suất nạp dược chất .37 Hình 3.17 Ảnh hưởng thể tích pha lỗng đến KTTP, hiệu suất nạp dược chất .39 Hình 3.18 Ảnh hưởng nồng độ polyme đến KTTP, hiệu suất nạp dược chất 40 Hình 3.19 Ảnh hưởng nồng độ dược chất pha nước nội đến hiệu suất nạp dược chất .41 Hình 3.20 Đồ thị phân bố kích thước tiểu phẩn vi cầu PLGA-LA 42 Hình 3.21 Hình ảnh chụp FESEM vi cầu PLGA-LA: (A),(B) phóng đại 1.000 lần, (C) phóng đại 2.000 lần, (D) phóng đại 10.000 lần 43 Hình 3.22 Phổ nhiệt quét vi sai vi cầu PLGA-LA 43 Hình 3.23 Phổ nhiệt quét vi sai vi cầu PLGA-LA (A), PLGA (B), LA (C), Gelatin (D) 44 Hình 3.24 Phổ FTIR LA, gelatin, PLGA vi cầu 45 ĐẶT VẤN ĐỀ Leuprolid acetat (LA) nonapeptid tổng hợp có cấu tạo tương tự với hormon giải phóng gonadotropin (GnRH) có tự nhiên Leuprolid liên kết hoạt hóa thụ thể GnRH Khi sử dụng liên tục, LA kích thích tuyến yên tăng tiết hormon kích thích nang trứng (FSH) hormon kích thích thể vàng (LH), dẫn đến sụt giảm đáng kể lượng testosteron thể sản xuất Do vậy, LA dùng để điều trị bệnh liên quan đến hormon dậy sớm phụ thuộc gonadotropin, ung thư tuyến tiền liệt giai đoạn muộn, ung thư vú, u trơn tử cung Thuốc sử dụng chủ yếu qua đường tiêm (tiêm bắp, tiêm da) hạn chế sinh khả dụng đường uống đường đặt trực tràng Vì thời gian bán thải LA ngắn nên dạng thuốc tiêm giải phóng cần sử dụng hàng ngày Trong đó, thời gian điều trị bệnh liên quan đến hormon thường kéo dài từ vài tháng đến vài năm Điều dẫn đến bất tiện cho bệnh nhân làm giảm hiệu trình điều trị Vì vậy, thuốc tiêm giải phóng kéo dài chứa dược chất nạp vi cầu polyme phân hủy sinh học nghiên cứu, sản xuất để giúp bệnh nhân tuân thủ điều trị tốt Việc bào chế vi cầu sử dụng polyme phân hủy sinh học PLGA nạp dược chất LA cho thấy tiềm định Ở Việt Nam, số đề tài nghiên cứu Bộ môn Bào chế thực cho kết quả: bào chế vi cầu PLGA-LA với hiệu suất nạp dược chất khoảng 30%; ảnh hưởng thiết bị/tốc độ/thời gian nhũ hóa đến kích thước vi cầu ảnh hưởng dung môi, thiết bị số tá dược đến độ ổn định dược chất khảo sát [2],[3] Tuy nhiên, số thông số kỹ thuật khác ảnh hưởng đến hiệu suất nạp dược chất phương pháp rắn hóa vi cầu, thể tích pha lỗng…chưa khảo sát, đánh giá Vì vậy, tiến hành đề tài “Tiếp tục nghiên cứu bào chế đánh giá vi cầu chứa leuprolid acetat” với mục tiêu sau: Khảo sát số yếu tố kĩ thuật thành phần bào chế ảnh hưởng đến đặc tính vi cầu Đánh giá số đặc tính vi cầu leuprolid acetat bào chế Hình 3.21 Hình ảnh chụp FESEM vi cầu PLGA-LA: (A),(B) phóng đại 1.000 lần, (C) phóng đại 2.000 lần, (D) phóng đại 10.000 lần Tiểu phân vi cầu PLGA-LA màu trắng đục, tương đối đồng kích thước, Span nhỏ (1,24), 90% kích thước tiểu phân vi cầu 45 µm, kích thước trung bình khoảng 30 µm Hình 3.21 cho thấy tiểu phân vi cầu PLGA-LA có dạng hình cầu, bề mặt vi cầu trơn nhẵn (hình 3.21C) quan sát với độ phóng đại 10.000 nhận thấy bề mặt vi cầu tương đối xù xì (hình 2.31 D) Hiệu suất nạp dược chất khoảng 53% 3.6.2 Đặc tính nhiệt DSC Hình 3.22 Phổ nhiệt quét vi sai vi cầu PLGA-LA 43 Hình 3.23 Phổ nhiệt quét vi sai vi cầu PLGA-LA (A), PLGA (B), LA (C), gelatin (D) Nhận xét: Phổ nhiệt quét vi sai dược chất cho thấy leuprolid acetat tồn dạng kết tinh nóng chảy nhiệt độ khoảng 170oC (phụ lục 2.1) Tuy nhiên phổ nhiệt quét vi sai vi cầu PLGA-LA (hình 3.22 3.23 khơng xuất đỉnh thu nhiệt tương ứng vị trí này, vi cầu không tồn LA dạng kết tinh Điều LA tồn dạng vơ định hình phân tán mạng lưới phân tử PLGA (hàm lượng LA vi cầu: 5,65%) Ngoài ra, nhiệt độ khoảng 40oC có xuất điểm uốn liên quan đến nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh tá dược PLGA Nhưng Tg PLGA mẫu vi cầu nhỏ so với Tg PLGA (Tg PLGA khoảng 45-50oC) Nguyên nhân kết tương tác ion xảy LA PLGA, LA liên kết nằm xen lẫn mạng lưới phân tử polyme gây thay đổi đặc tính nhiệt PLGA 3.6.3 Phổ hồng ngoại FTIR Phổ FTIR LA (phụ lục 3.1) phổ FTIR PLGA (phụ lục 3.2) đánh giá mơ tả tín hiệu dao động đặc trưng nhóm chức cấu trúc phân tử mục 3.3.2 Phổ FTIR gelatin (phụ lục 3.3) cho thấy tín hiệu dao động khoảng số sóng 3500-2500 cm-1, 1600-1700 cm-1, 1500-1600 cm-1, 1300-600 cm-1 liên quan đến liên kết amid A (dao động hóa trị N-H), amid I (dao động hóa trị C=O, dao động biến dạng C-N N-H), amid II (dao động hóa trị C-N dao động biến dạng NH), amid III (dao động hóa trị C-N dao động biến dạng N-H) Các đỉnh đặc trưng phổ đo tuân thủ cấu trúc phân tử gelatin [9] 44 Phổ FTIR vi cầu (phụ lục 3.6) chồng phổ FTIR LA, Gelatin, PLGA; không thấy xuất peak đặc trưng không thấy xuất peak Điều chứng minh quy trình bào chế vi cầu khơng xảy tượng tương tác Độ truyền qua (%T) hóa học dược chất tá dược 4000 3400 2800 LA 2200 Gelatin 1600 Vi cầu 1000 PLGA Hình 3.24 Phổ FTIR LA, gelatin, PLGA, vi cầu 45 400 cm-1 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đề tài đạt số kết sau: Đã khảo sát thành phần công thức kĩ thuật bào chế ảnh hưởng đến đặc tính vi cầu  PLGA có khả hấp phụ LA pH 7,4 Chứng minh mơi trường pH 7,4 PLGA có khả hấp phụ LA tương tác tĩnh điện thông qua kết phân tích nhiệt quét vi sai DSC phổ hồng ngoại FTIR Nghiên cứu khảo sát cho thấy nhiệt độ 2-8oC, mơi trường nước có mặt PLGA: LA ổn định môi trường đệm pH 7,4  Các yếu tố ảnh hưởng đến KTTP, hiệu suất nạp dược chất Nghiên cứu khảo sát đưa số yếu tố thông số kĩ thuật, thành phần công thức bào chế vi cầu phương pháp nhũ hóa kép kết hợp bốc dung mơi quy mơ phịng thí nghiệm: Thành phần bào chế Pha Thành phần Pha nước 50 mg LA, 25mg gelatin/1,0 ml nước pH 7,4 Pha dầu 400mg PLGA/4 ml DCM Pha nước 10 ml PVA 1%, NaCl 1,5% Môi trường phân tán 40 ml PVA 1%, NaCl 1,5% Thông số kĩ thuật Giai đoạn Thông số Nhũ hóa lần Thiết bị siêu âm đầu dị – cơng suất 30% 60 giây Nhũ hóa lần Thiết bị đồng hóa – 4.000 vịng/phút 30 giây Rắn hóa vi cầu Sục khí nitơ tốc độ 20 ml/phút 25 phút kết hợp pha loãng từ từ 40 ml dung dịch PVA 1%, NaCl 1,5% Đã đánh giá số đặc tính vi cầu PLGA - LA Đã bào chế đánh giá đặc tính vi cầu PLGA – LA thu kết sau: 90% tiểu phân vi cầu có kích thước 45 µm, kích thước trung bình khoảng 30 µm; quan sát hình thái bề mặt vi cầu cho thấy vi cầu có bề mặt trơn nhẵn; nhiệt độ chuyển kính Tg khoảng 40oC; hiệu suất nạp dược chất đạt khoảng 53% 46 KIẾN NGHỊ Do hạn chế thời gian thiết bị hóa chất, kết nghiên cứu đánh giá số thơng số ảnh hưởng đến q trình bào chế vi cầu Nghiên cứu đưa số kiến nghị sau: Tiếp tục nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng giúp tăng hiệu suất nạp vi cầu PLGALA vi cầu có hình thái bề mặt mịn, cấu trúc đặc khít Tiến hành đánh giá giải phóng in-vitro dược chất vi cầu 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Bộ Y Tế (2017), Dược điển Việt Nam V Đào Thị Thu Hiền (2018), Bước đầu nghiên cứu bào chế tiểu phân polyme poly acid lactic-co-glycolic chứa leuprolid acetat, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội Thái Văn Thịnh (2019), Nghiên cứu tiền công thức leuprolid acetat để bào chế vi cầu, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh Adjei Akwete Lex, Hsu L (1993), "Leuprolide and other LH-RH analogues", Stability and Characterization of Protein and Peptide Drugs Case Histories, pp 159-199 Alex Rainer, et al (1990), "Encapsulation of water-soluble drugs by a modified solvent evaporation method I Effect of process and formulation variables on drug entrapment", Journal of microencapsulation, 7(3), pp 347-355 Amy G., Schwendeman S.P (2008), "Acidic microlimate pH distribution in PLGA microspheres monitored by confocal laser scanning microsopy", Pharmaceutiacl Research, 25, pp 2041-2052 Astaneh Reyhaneh, Nafissi‐Varcheh Nastaran et al (2007), "Zinc–leuprolide complex: preparation, physicochemical characterization and release behaviour from in situ forming implant", Journal of peptide science: an official publication of the European Peptide Society, 13(10), pp 649-654 Blasi P., et al (2019), "Poly (lactic acid)/Poly(lactic-co-glycolic)-based microparticles: an overview ", Journal of Pharmaceutical Investigation, 49(4), pp 337-346 Cebi Nur, Durak M Zeki, et al (2016), "An evalution of Fourier transforms infrared spectroscopy method for the classification and discrimination of bovine , porcine and fish gelatins", Food Chemistry, 190, pp 1109-1115 10 Cho S.W, et al (2000), "Effect of solvent selection and fabrication method on the characteristics of biodegradable poly (lactide-co-glycolic) micropheres containing ovalbumin", Archives of Pharmacal Research, 23(4), pp 385-390 11 Cohen-Sela E., et al (2009), "A new double emulsion solvent diffusion technique for encapsulating hydrohilic molecules in PLGA nanoparticales", Journal of Controlled Release, 133(2), pp 90-95 12 Freytag T., Dashevsky A., et al (2000), "Improvement of the encapsulation efficiency of oligonucleotide-containing biodegradable microspheres", Journal of Controlled Release, 69(1), pp 197–207 13 Friederike von Burkersrodam, Luise Shedl (2002) , "Why degradable polymers undergo surface erosion or bulk erosion", Biomaterials, 23(21), pp 4221–4231 14 Fuminori Ito, Hiroyuki Fujimori, et al (2007), "Incorporation of water-soluble drugs in PLGA microspheres", Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 54(2), pp 173–178 15 Harish B Ravivarapua, Kevin Burtonb, et al (2000), "Polymer and microsphere blending to alter the release of a peptide from PLGA microspheres", European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 50(2), pp 263-270 16 Hirenkuma Makadia, Steven J Siegel (2011), “Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as biodegradable controlled drug delivery carrier", Polymers (Basel), 3(3), pp 1377–1397 17 Hiroaki Okada (1997), "One - and three - month release injectable microspheres of the LH-RH superagonist leuprorelin acetate", Anvanced drug delivery reviews, 28, pp 43-70 18 Hiroaki Okada, et al (1994), "Drug delivery using biogradable microspheres", Advances in Drug Delivery System, 6, pp 121-129 19 Houchin M.L., Topp E.M (2008), "Chemical Degradation of Peptides and Proteins in PLGA: A Review of Reactions and Mechanisms", Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(7), pp 2395-2404 20 Ingrid J Castellanos, Karen G Carrasquillo, et al (2001), "Encapsulation of bovine serum albumin in poly(lactide-co-glycolic) microspheres by solid-in-oilin-water technique", Journal of Pharmacy and Pharmacology, 53(2), pp 167178 21 Jagdish Sign, Sumeet K Rastogi, et al (2000), "Quantition of leuprolide acetate by high performance liquid chromatography", Journal of Liquid Chromatography and Related Technology, 23(19), pp 3023-3031 22 Japanese Pharmacopeia Commission (2016), "Leuprorelin Acetat", The Japanese Pharmacopoeia 17th edition (English version), pp 1150-1152 23 J.X Zhang, K.J Zhu (2004), "An improvement of double emulsion technique for preparing bovine serum albumin-loaded PLGA microspheres", Journal of Microencapsulation, 21(7), pp 775–785 24 Kinam Park, et al (2019), "Injectable, long-acting PLGA formulations: Analyzing PLGA and understanding microparticle formation", Journal of Controlled Release, vol 304, pp 125–134 25 Laura C Herrera, M.V.D Tesoriero, et al (2012), "In vitro release testing of PLGA microspheres with Franz diffusion cells", Dissolution Technology, 19(2), pp 6–11 26 Lei Li, Steven P Schwendeman (2005), "Mapping neutral microclimate pH in PLGA microspheres", Journal of Controlled Release, 101(1-3), pp 163–173 27 Martín-Sabroso C., Fraguas-Sánchez A.I, et al (2015), "Critical attributes of formulation and of elaboration process of PLGA-protein microparticles", International Journal of Pharmaceutics, 480(1–2), pp 27–36 28 Mehdi Rahimi, et al (2016), "Aqueous stability of leuprolide acetate: Effect of temperature, dissolved oxygen, pH and complexation with β-cyclodextrin", Pharmaceutical Development and Technology, 21(1), pp 108–115 29 Meng ZX, Wang YS et al (2010), "Electrospinning of PLGA/gelatin randomlyoriented and aligned nanofibers as potential scaffold in tissue engineering", Materials Science and Engineering: C, 30(8), pp 1204-1210 30 Muhammad Iqbal, Nadiah Zafar, et al (2015), "Double emulsion solvent evaporation techniques used for drug encapsulation", International Journal of Pharmaceutics, 496(2), pp 173–190 31 Muhanad Ali, et al (2019), "Influence of formulation parameters on encapsulation of doxycyline in PLGA microspheres prepared by double emulsion technique for the treatment of periodontitis", Journal of Drug Delivery Science and Technology, 52, pp 263-271 32 Parker W Lee, Jonathan K Pokorski (2018), "Poly(lactic-co-glycolic acid) devices: Production and applications for sustained protein delivery", Wiley Interdisciplinary Reviews Nanomedicine Nanobiotechnology, 10(5), pp 1–22 33 Ramazani F., et al (2015), "Formlation and characterization of micropheres loaded with imatinib for sustained delivery", International Journal of Pharmaceutics, 482(1-2), pp 123-130 34 Rowe R.C., et al (2009), Handbook of pharmaceutical excipients 6th Edition, Libros Digitales Pharmaceutical Press 35 Sarah Skidmore, Justin Hadar, et al (2019), "Complex sameness: Separation of mixed poly(lactide-co-glycolide)s based on the lactide:glycolide ratio", Journal of Controlled Release, 300, pp 174–184 36 Sarita R Shah, et al (2014), "Effects of antibiotic physicochemical properties on their release kinetics from biodegradable polymer microparticles", Pharmaceutical Research, 31(12), pp 3379–3389 37 Sophocleous A.M , et al (2013), "The nature of peptide interactions with acid end-groups PLGAs and facile aqueous-based microencapsulation of therapeutic peptides", Journal of Controlled Release, 172(3), pp 662-670 38 Shail K., et al (2011), "Microsphere: A review", International Journal of Research in Pharmacy and Chemistry, 1(4), pp 1184-1198 39 Shirui Mao, Jing Xu (2007), "Effect of W/O/W process parameters on morphology and burst release of FITC-dextran loaded PLGA microspheres", International Journal of Pharmaceutics, 334(1–2), pp 137–148 40 Stevenson C.L., Leonard J.J., et al (1999), "Characterization and comparison of leuprolide degradation profiles in water and dimethyl sulfoxide", Journal of Peptide Research, 53(4), pp 432–441 41 Stevenson C.L., Leonard J.J., et al (1999), "Effect of peptide concentration and temperature on leuprolide stability in dimethyl sulfoxide", International Journal of Pharmaceutics, 191(2), pp 115–129 42 Wasana Chaisri, WimE Hennink, et al (2009), "Preparation and Characterization of Cephalexin Loaded PLGA Microspheres", Current Drug Delivẻy, 6(1), pp 69– 75 43 Wen I Li, Kimberly W Anderson, et al (1995), "Prediction of solvent removal profile and effect on properties for peptide-loaded PLGA microspheres prepared by solvent extraction/ evaporation method", Journal of Controlled Release, 37(3), pp 199–214 44 Xiaosong Luan, Marc Skupin, et al (2006), "Key parameters affecting the initial release (burst) and encapsulation efficiency of peptide-containing poly(lactide-coglycolide) microparticles", International Journal of Pharmacetics, 324(2), pp 168–175 45 Xue Shen Wu, Nuo Wang (2001), "Synthesis, characterization, biodegradation, and drug delivery application of biodegradable lactic/glycolic acid polymers Part II: Biodegradation", Journal of Biomaterials Science Polymer Edition, 12(1), pp 21–34 46 Yoo Yeo, Kinam Park (2004), "Control of Encapsulation Efficiency and Initial Burst in Polymeric Microparticle Systems", Archives Pharmacal Research, 27(1), pp 1–12 47 Yoon Yeo, Namjin Baek, Kinam Park (2001), "Microencapsulation Methods for Delivery of Protein Drugs", Biotechnology and Bioprocess Engineering, 6, pp 213–230 48 Yin-Yan Yang, Tai-Shung Chung, et al (2000), "Effect of preparation conditions on morphology and release profiles of biodegradable polymeric microspheres containing protein fabricated by double-emulsion method", Chemical Engineering Sicence, 55(12), pp 2223-2236 49 Selleckchem.com, "Leuprolide acetat", Retrieved 09/02/2020, from https://www.selleckchem.com/products/leuprolide-acetate.html.” 50 US National Library of Medicine, Drug Label Information, Last update: 12/04/2018, Access Date: 15/05/2018, available from: https://dailymed.nlm.nih.gov/ 51 US National Center for Biotechnology Information, Pubchem Compoud, Last Access Date: 27/08/2019, available from: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ PHỤ LỤC Thời điểm (ngày) 11 14 21 29 Nước 6,4 Tỷ lệ LA pH lại (%) 100,0 6,40 98,8 5,44 98,5 5,70 92,8 5,39 89,6 5,27 88,8 5,25 85,7 5,01 Đệm 6,4 Tỷ lệ LA pH lại (%) 100,0 6,40 97,5 6,38 100,0 6,37 94,5 6,35 91,9 6,31 88,7 6,28 87,3 6,25 Đệm 7,4 Tỷ lệ LA pH lại (%) 100,0 7,40 98,3 7,38 98,3 7,34 97,7 7,35 95,1 7,32 93,0 7,29 91,4 7,22 Nước 7,4 Tỷ lệ LA lại pH (%) 100,0 7,40 98,5 5,91 101,8 6,35 96,1 6,08 85,1 5,61 83,0 5,50 83,6 5,34 Phụ lục 1.1 pH, tỷ lệ leuprolide acetate lại môi trường nước, đệm pH khác có mặt PLGA nhiệt độ 2-8oC Phụ lục 2.1 Phổ nhiệt quét vi sai LA Phụ lục 2.2 Phổ nhiệt quét vi sai PLGA Phụ lục 2.3 Phổ quét nhiệt vi sai Gelatin Phụ lục 2.4 Phổ nhiệt quét vi sai hỗn hợp vật lý LA-PLGA Phụ lục 3.1 Phổ FTIR Leuprolid acetat Phụ lục 3.2 Phổ FTIR PLGA Phụ lục 3.3 Phổ FTIR Gelatin Phụ lục 3.4 Phổ FTIR hỗn hợp vật lý PLGA, LA Phụ lục 3.5 Phổ FTIR màng PLGA-LA Phụ lục 3.6 Phổ FTIR vi cầu Phụ lục 4.1 PLGA tích điện âm pH 7,4 Phụ lục 4.2 Vị trí tích điện dương phân tử LA pH 7,4 Leuprolid acetat có vị trí có khả tích điện dương là: nitơ thuộc vòng imidazol Histidin (pKa = 6,0) nitơ thuộc nhóm guanidin Arginin (pKa = 13,0) ... nhiệt quét vi sai DSC theo mục 2.3.2 phân tích phổ hồng ngoại FTIR theo mục 2.3.3 2.3.6 Phương pháp bào chế đánh giá vi cầu 2.3.6.1 Phương pháp bào chế vi cầu Bào chế vi cầu leuprolid acetat phương... khảo sát, đánh giá Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài ? ?Tiếp tục nghiên cứu bào chế đánh giá vi cầu chứa leuprolid acetat? ?? với mục tiêu sau: Khảo sát số yếu tố kĩ thuật thành phần bào chế ảnh hưởng... 19 2.3.6 Phương pháp bào chế đánh giá vi cầu 20 2.3.6.1 Phương pháp bào chế vi cầu 20 2.3.6.2 Đánh giá số đặc tính vi cầu chứa LA 22 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 24