Ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ tứ cực/thời gian bay (UPLC-QTOF-MS) để giám sát tồn dư kháng sinh trong thịt, cá

Bài viết sử dụng hệ máy UPLC-ESIQTOF-MS để phân tích sàng lọc tồn dư kháng sinh trong các mẫu sản phẩm động vật, phương pháp đã được thẩm định và cho kết quả đáng tin cậy. Mời các bạn cùng tham khảo!

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ TỨ CỰC/THỜI GIAN BAY (UPLC-QTOF-MS) ĐỂ GIÁM SÁT TỒN DƯ KHÁNG SINH TRONG THỊT, CÁ Nguyễn Văn Chính*, Đặng Mai Tuyết Trang, Đồn Thị Trúc Kha, Cao Thị Quỳnh Mai, Lê Văn Thiện, Bùi Huy Hoàng, Lâm Văn Tú Chi Cục Thú y vùng VI (Ngày đến tòa soạn:1/7/2019; Ngày sửa sau phản biện: 26/8/2019; Ngày chấp nhận đăng: 5/9/2019) Tóm tắt Tồn dư kháng sinh thịt sản phẩm động vật vấn đề nhận quan tâm xã hội ảnh hưởng nguy mà gây cho sức khỏe người, đặc biệt tình trạng kháng kháng sinh Hiện có nhiều loại kháng sinh sử dụng thị trường với nhiều đặc tính sinh học hóa học khác Do đó, việc giám sát, theo dõi chất tồn dư thịt sản phẩm động vật thông qua kiểm nghiệm mẫu việc làm cần thiết Các phương pháp sắc ký lỏng, ELISA thời gian qua phương pháp nhiều phòng thử nghiệm sử dụng để thực phân tích mẫu tìm chất, nhóm chất tồn dư cụ thể Hiện nay, kỹ thuật Khối phổ thời gian bay (Time-Of-Flight - TOF) phương pháp mới, đại có độ xác khối cao số phòng xét nghiệm ứng dụng để thực kiểm nghiệm sàng lọc, phát chất, nhóm chất tồn dư thực phẩm Trong nghiên cứu này, sử dụng hệ thống sắc ký lỏng ghép nối tứ cực thời gian bay (UPLC-QTOF-MS) để kiểm nghiệm sàng lọc, phân tích tồn dư kháng sinh, chất cấm khác thuộc nhóm Sulfonamid, Quinolone, Tetracycline, BetaAgonist… số loại độc tố khác mẫu thịt heo, thịt gà, thịt bò, cá Kết bước đầu thực kiểm nghiệm sàng lọc 93 mẫu khảo sát thu thập ngẫu nhiên phát tồn dư số loại kháng sinh Amoxicillin, Cefalexin Ampicillin Từ khóa: Giám sát, tồn dư, kháng sinh, thịt, cá, QTOF-MS ĐẶT VẤN ĐỀ Từ năm 1928, kháng sinh đóng vai trò quan trọng phát triển người, việc điều trị nhiều loại bệnh mà trước gây tử vong Ngày kháng sinh sử dụng rộng rãi, không trị bệnh cho người mà dùng nhiều chăn ni thủy sản, với mục đích phịng, trị bệnh kích thích tăng trưởng Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc kháng sinh, điều trị chăn nuôi gây nhiều hệ lụy xấu, xuất vi khuẩn kháng kháng sinh, tồn dư chất chất chuyển hóa có khả gây bệnh, gây ung thư với người Việc tầm soát, kiểm soát tồn dư kháng sinh sản phẩm động vật dùng làm thực phẩm quan tâm quan ban ngành Bộ Y tế, Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn qua hàng loạt Chỉ thị, Quyết định Thơng tư [1,2] Do có hàng trăm loại kháng sinh khác nhà khoa học nghiên cứu đưa vào sử dụng phương pháp phân tích thơng dụng (ELISA, HPLC, LC-MS) phân tích nhóm chất định nên có khả bỏ qua mẫu nhiễm kháng sinh Phương pháp sử * Điện thoại: 093 345 9823 24 Email: nvchinh.blue@gmail.com Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TOÀN THỰC PHẨM (Số 3-2019) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC dụng thiết bị sắc ký lỏng siêu hiệu ghép nối detector khối phổ tứ cực thời gian bay (UPLCQTOF-MS), kết hợp với sở liệu nhiều loại kháng sinh khác nhau, giải điều Dữ liệu thu có độ phân giải cao, lên đến 45000 FWHM (Full Width at Half Maximum - Độ rộng ½ chiều cao peak) độ chệch khối nhỏ, đến ppm [3] giúp phát xác chất chưa biết Những thiết bị sử dụng kỹ thuật năm gần sử dụng nhiều hoạt động nghiên cứu, xác định cấu trúc, tìm chất thực phẩm [4,5] hay loại thảo dược [6,7] Trong nghiên cứu này, sử dụng hệ máy UPLC-ESIQTOF-MS để phân tích sàng lọc tồn dư kháng sinh mẫu sản phẩm động vật Phương pháp thẩm định cho kết đáng tin cậy NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nội dung nghiên cứu Thu thập mẫu sản phẩm động vật, thủy sản (thịt heo, gà, trâu, bò, cá) từ chợ địa phương Mẫu phân tích UPLC-QTOF-MS Dữ liệu thu được so sánh với Cơ sở liệu thuốc thú y (Vet Drugs Personal Compound Database and Library - Vet Drugs PCDL) để tìm chất kháng sinh có mẫu 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thu thập mẫu Mẫu lấy ngẫu nhiên từ chợ địa phương sau mẫu xay nhuyễn đồng bảo quản điều kiện -20oC Trước thực phân tích, mẫu đưa đến nhiệt độ phịng 2.2.2 Quy trình phân tích UPLC-QTOF-MS Mẫu phân tích sau: [8] Hai (2) gam mẫu tách chiết mL acetonitrile Dịch chiết làm bột C18, sau lọc màng lọc 0,22 µm tiêm vào máy Thiết bị sử dụng bao gồm: - Máy sắc ký lỏng siêu hiệu (UPLC) - Detector khối phổ: Tứ cực (Triplequad) - Thời gian bay (Time-of-flight) - Máy tính với hệ thống liệu khối phổ chất kháng sinh Điều kiện phân tích: Cột sắc ký sử dụng cột Eclipse Plus C18 RRHD 1,8 µm, 3,0 x 150 mm Pha động gồm H2O/0,1% acid formic acetonitrile, phân tích theo chế độ gradient, với acetonitrile 5% phút, tăng lên 50% phút thứ 5, lên 95% phút thứ giữ phút Thời gian phân tích mẫu 20 phút Tốc độ dòng 0,3 ml/phút cột sắc ký giữ 40oC Thể tích mẫu tiêm vào µl Mẫu phân tích chế độ ion hóa phun điện tử dương (+ESI – positive Electrospray Ionization), với nhiệt độ khí 200oC, tốc độ 10 l/phút Khoảng khối phổ từ 50 đến 1000 m/z, mức lượng bắn phá 0, 10 40 eV Trước lần phân tích mẫu, máy hiệu chuẩn khối (tune) dung dịch chuẩn chuẩn bị sẵn với chất có m/z từ 118 đến 1521,97 Trong q trình phân tích, dung dịch hiệu chuẩn liên tục phun vào ion hóa với mẫu Các phổ lựa chọn 121,0508 922,009 m/z Dữ liệu thu xử lý, so sánh với liệu phổ chuẩn Cơ sở liệu Từ xác định chất tồn dư có mẫu Q trình dựa vào yếu tố: - Độ xác khối phổ (Mass accuracy - Mass error): Là sai lệch khối phổ số khối lý thuyết số khối đo từ thiết bị Độ chệch khối = ௌዎ௄௛ዎ௜¯௢¯ዛዘ௖ିௌዎ௞௛ዎ௜௟ý௧௛௨௬ዅ௧ ௌዎ௞௛ዎ௜௟ý௧௛௨௬ዅ௧ × 106 (ppm) - Khối phổ đồng vị tỷ lệ đồng vị - Các mảnh ion Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TỒN THỰC PHẨM (Số 3-2019) 25 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết phân tích mẫu Tổng cộng 93 mẫu thu thập ngẫu nhiên phân tích, gồm có thịt trâu, bị, gà, lợn cá Chi tiết mẫu thể bảng đây: Bảng Kết phân tích mẫu S͙ m̳u T͝ng s͙ m̳u M̳u Th͓t trâu Th͓t bò Th͓t gà Th͓t lͫn Cá Sӕ mүu 17 22 36 12 93 Mүu phát hiӋn có kháng sinh 0 1 Loҥi kháng sinh - - Cefalexin Amoxicillin Ampicillin Dữ liệu phân tích xử lý phần mềm, so sánh với thư viện phổ (Vetdrugs PCDL) chứa 2153 chất kháng sinh Kết thu sau: 90 mẫu không phát tồn dư kháng sinh mẫu phát tồn dư kháng sinh nhóm β-Lactam Cefalexin, Amoxicillin Ampicillin 3.2 Phân tích kết 3.2.1 Độ chệch khối Các khối phổ thu có độ chệch nhỏ so với lý thuyết tính tin cậy, xác cao Từ liệu tính tốn cho thấy chất nghi ngờ có mẫu có độ chệch khối nhỏ, cụ thể thể bảng Bảng Độ chệch khối chất tồn dư mẫu Phân t͵ l˱ͫng (mass) S͙ kh͙i lý thuy͇t (m/z) S͙ kh͙i ÿo ÿ˱ͫc (m/z) Ĉ͡ ch͏ch kh͙i (ppm) M̳u Tên ch̭t Công thͱc phân t͵ Thӏt gà Cefalexin C16H17N3O4S 347,0951 348,1013 348,1023 - 2,9 Thӏt lӧn Amoxicillin C16H19N3O5S 365,1044 366,1118 366,1117 0,27 Cá Ampicillin C16H19N3O4S 349,1094 350,1169 350,1168 0,29 3.2.2 Đồng vị Yếu tố thứ để định danh chất dựa vào đồng vị tỷ lệ đồng vị chất Đồng vị nguyên tố nguyên tử có số proton khác số notron, nên có số khối khác Hầu hết nguyên tố tự nhiên hỗn hợp nhiều đồng vị Ví dụ: tự nhiên, Carbon (C) có đồng vị 12C, 13C 14C; 14C đồng vị phóng xạ (thời gian bán rã 5730 năm) đồng vị 12C 13C đồng vị bền Tỷ lệ số nguyên tử đồng vị ổn định, ví dụ: 12C chiếm 98,90% 13C chiếm 1,10%, 14N chiếm 99,63% 15N chiếm 0,37% Các chất kháng sinh, ngồi số khối ln có số khối đồng vị với tỷ lệ khác nhau, thông thường đơn vị khối (Da-Dalton) [9] Với cơng thức phân tử định, phân tích phổ phân giải cao, thấy peak đồng vị, với tỷ lệ thành phần dự đốn trước thơng qua cơng cụ ứng dụng, Isotope Distribution Calculator Ampicillin theo tính tốn lý thuyết, điện tích +1 (M-H+) có peak đồng vị lớn 350,1169, 351,1198 352,1162, với tỷ lệ 78,15%, 15,3% 5,56%, ampicillin tìm thấy 26 Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TOÀN THỰC PHẨM (Số 3-2019) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC mẫu có đồng vị nói trên, tỷ lệ tín hiệu chúng tương đồng so với lý thuyết (hình 1) Từ khẳng định thêm có mặt chất mẫu Sự so sánh áp dụng cho tất chất khác, giúp nâng cao độ xác kết định danh chất tồn dư có mẫu Hình Các đồng vị tỷ lệ đồng vị Ampicillin mẫu theo lý thuyết 3.2.3 Các mảnh ion Yếu tố cuối dựa vào mảnh sau qua buồng va chạm (collision cell) với lượng va chạm (collision energy - CE) khác (0, 10 40 eV) Với chất có cơng thức cấu tạo khác nhau, lượng liên kết nguyên tử khác có mảnh ion khác tỷ lệ khác Trong sở liệu sẵn có phổ chất lượng điều kiện ion hóa khác (ESI negative positive) Việc so sánh phổ thực tự động xem thủ cơng Hình thể phổ amoxicillin mẫu, so sánh với hình phổ từ sở liệu Do chất có cấu trúc lượng liên kết khác nên có nhiều mức lượng bắn phá khác Đồng thời hầu hết kháng sinh chất có phân tử nhỏ, dễ bị phân mảnh nên tổng quát, phân tích mẫu áp dụng mức lượng, thấp cao (0, 10 40 eV) Kết từ mẫu cho thấy chất tồn dư có mảnh phổ giống với liệu chuẩn, với nhiều mảnh phổ khác mức lượng khác Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TỒN THỰC PHẨM (Số 3-2019) 27 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Hình Phổ Amoxicillin mẫu thịt lợn CE = 0, 10 40 eV g Hình Phổ Amoxicillin (10 eV 40 eV) Cơ sở liệu KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu, chúng tơi có số kết luận sau: Việc sử dụng phương pháp phân tích sàng lọc UPLC-QTOF-MS giúp phát nhanh yếu tố nguy vi phạm tồn dư kháng sinh thực phẩm từ sản phẩm động vật so với phương pháp thông thường khác (ELISA, LC-MS/MS,…), cần nhiều thời gian chi phí để xác định Với 93 mẫu phân tích, việc xác định nhanh chóng có mẫu tồn dư kháng sinh nhóm β-Lactam giúp cho việc sử dụng phương pháp khác để định lượng dễ dàng Trong năm qua, quan quản lý liên tục phát vi phạm vệ sinh anh toàn thực phẩm: chất tạo nạc nhóm β-Agonist thịt lợn, chất Vàng O, chất gây mê,… cho thấy việc sử dụng chất 28 Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TỒN THỰC PHẨM (Số 3-2019) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC độc hại, chất cấm dẫn đến tồn dư thực phẩm vô phức tạp Phương pháp phân tích sàng lọc chất chưa biết (Unknowns) UPLC-QTOF-MS giúp quan nhanh chóng biết hóa chất tồn dư thực phẩm, để từ có biện pháp giám sát phù hợp Ngoài kháng sinh ban đầu, chất chuyển hóa từ kháng sinh tìm thấy liệu Từ việc sử dụng UPLC-QTOF-MS giúp cho việc nghiên cứu, theo dõi trình biến đổi kháng sinh dễ dàng hơn, giúp ích cho việc nghiên cứu ảnh hưởng loại hóa chất lên thể sống Ngoài ra, với việc thu nhận liệu cách tổng quát với toàn phổ đến detector giúp cho việc kiểm tra liệu, phát chất lạ, chưa biết lúc Ngoài sở liệu thuốc thú y, phương pháp cịn có sở liệu khác thuốc trừ sâu (Pesticides PCDL) độc chất (Toxins PCDL) với hàng ngàn chất cập nhật bổ sung TÀI LIỆU THAM KHẢO Chỉ thị số 1865/CT-BNN-BYT ngày 04/03/2015 Bộ Y tế Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn việc tăng cường quản lý sản xuất kinh doanh, sử dụng thuốc kháng sinh chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản đảm bảo an toàn thực phẩm Quyết định 127/QĐ-BYT ngày 15/01/2019 Bộ Y tế việc ban hành “Hướng dẫn thực giám sát quốc gia kháng kháng sinh” Data sheet 5991-5500EN, Agilent 6545 Q-TOF Specification Qiang Lv, Fenglei Luo, Xiaoyong Zhao, Yu Liu, Guibing Hu, Chongde Sun, Xian Li, Kunsong Chen (2015),“Identification of Proanthocyanidins from Litchi (Litchi chinensis Sonn.) Pulp by LC-ESI-QTOF-MS and Their Antioxidant Activity”, PLoS ONE, 10(3) Annalaura Restivo, Ilaria Degano, Erika Ribechini, Maria Perla Colombini (2014), “Devel opment and Optimisation of an HPLC-DAD-ESI-Q-ToF Method for the Determination of Phenolic Acids and Derivatives”, PLoS ONE 9(2) Hui Li, Weifeng Yao, Qinan Liu, Jia Xu, Beihua Bao, Mingqiu Shan, Yudan Cao, Fangfang Cheng, Anwei Ding, Li Zhang (2017), “Application of UHPLC-ESI-Q-TOF-MS to Identify Multiple Constituents in Processed Products of the Herbal Medicine Ligustri Lucidi Fructus”, Molecules, 22, 689 Hailin Zhu, Hongqiang Lin, Jing Tan, Cuizhu Wang, Han Wang, Fulin Wu, Qinghai Dong, Yunhe Liu, Pingya Li, Jinping Liu (2018), “UPLC-QTOF/MS-Based Nontargeted Metabolomic Analysis of Mountain- and Garden-Cultivated Ginseng of Different Ages in Northeast China”, Molecules, 24, 33 Application Note 5991-6651EN, Analysis of 122 Veterinary Drugs in Meat Using All Ions MS/MS with an Agilent 1290/6545 UHPLC-Q-TOF System Piotr Dittwald, Dirk Valkenborg, Jürgen Claesen, Alan L Rockwood, Anna Gambin (2015), “On the Fine Isotopic Distribution and Limits to Resolution in Mass Spectrometry”, Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 26(10), 1732-1745 Summary APPLICATION OF ULTRA PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY- TRIPLE QUADRUPOLE TIME-OF-FLIGHT MASS SPECTROMETRY (UPLC-QTOF-MS) FOR THE DETERMINATION OF ANTIBIOTIC RESIDUES IN MEAT AND FISH Nguyen Van Chinh, Dang Mai Tuyet Trang, Doan Thi Truc Kha, Cao Thi Quynh Mai Le Van Thien, Bui Huy Hoang, Lam Van Tu Regional Animal Health Office No.6 Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TOÀN THỰC PHẨM (Số 3-2019) 29 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC The residue of antibiotics in meat and meat products is one of the social problems for its effects and risks to human health, especially in the antibiotic resistance crisis Nowadays, there are hundreds of drugs commercially available, with difference biochemical characteristics Therefore, it is necessary to determine and monitor these residues in meat and meat products The methods using liquid chromatography (LC) and ELISA are widely applied in numbers of laboratories to determine specified substances In several laboratories, the state-of-the-art highresolution analytical technique, using Ultra Performance Liquid chromatography-triple quadrupole Time-of-flight mass spectrometry (UPLC-QTOF-MS), is applied to analyse the knowns and unknowns residues in food In this study, we used this technique for screening the residue of antibiotics, banned substances (Sulfonamids, Quinolones, Tetracyclines, β-Agonists…) and other toxins in pork, chicken, beef and fish samples Ninety-three randomly collected samples have been screened and residues of Amoxicillin, Cefalexin and Ampicillin have been detected in three of them Keywords: Residues, antibiotics, meat, fish, QTOF 30 Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TOÀN THỰC PHẨM (Số 3-2019) ... Thiết bị sử dụng bao gồm: - Máy sắc ký lỏng siêu hiệu (UPLC) - Detector khối phổ: Tứ cực (Triplequad) - Thời gian bay (Time-of-flight) - Máy tính với hệ thống liệu khối phổ chất kháng sinh Điều...NGHIÊN CỨU KHOA HỌC dụng thiết bị sắc ký lỏng siêu hiệu ghép nối detector khối phổ tứ cực thời gian bay (UPLCQTOF-MS), kết hợp với sở liệu nhiều loại kháng sinh khác nhau, giải điều Dữ... Trong nghiên cứu này, sử dụng hệ máy UPLC-ESIQTOF-MS để phân tích sàng lọc tồn dư kháng sinh mẫu sản phẩm động vật Phương pháp thẩm định cho kết đáng tin cậy NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP