Phân lập tuyển chọn và nghiên cứu một số đặc tính của chủng nấm đảm thu thập từ vườn quốc gia bidoup núi bà​

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT TRẦN THỊ THU HIỀN PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CHỦNG NẤM ĐẢM THU THẬP TỪ VƢỜN QUỐC GIA BIDOUP- NÚI BÀ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội tháng 12 năm 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền Lời Cảm Ơn Trước hết, xin bày tỏ biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà tận tình bảo, quan tâm hướng dẫn dìu dắt tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, giúp tơi có thêm nhiều kiến thức kinh nghiệm quý báu nghiên cứu khoa học Xin cám ơn Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hỗ trợ kinh phí từ đề tài: “Phân lập chọn lọc vi sinh vật sinh enzyme ngoại bào vườn Quốc gia Bidoup- Núi Bà để tạo nguồn nguyên liệu cho phát triển chế phẩm ứng dụng nông nghiệp, lâm nghiệp” để hồn thành cơng trình Tơi xin cám ơn chủ nhiệm đề tài thành viên tham gia tạo điều kiện giúp thu thập số liệu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Đinh Thị Thu Hằng, Th.S Đào Thị Ngọc Ánh, Th.S Nguyễn Thị Lan Anh, Th.S Phạm Quang Huy, Th.S Ngô Thị Huyền Trang, KS Nguyễn Hải Vân, KS Nguyễn Đăng Thắng, KS Hồng Thị Nhung, CN Nguyễn Văn Huynh phịng Cơng nghệ sinh học tái tạo môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi q trình làm khóa luận tốt nghiệp Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn thầy cô viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, viện Cơng nghệ sinh học tận tình dạy dỗ tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học thực luận văn Bên cạnh đó, xin cảm ơn bố mẹ, chồng người thân yêu tạo điều kiện động viên giúp đỡ vật chất tinh thần để tơi hồn thành khóa luận Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền Trần Thị Thu Hiền Lời cam đoan Tôi xin cam đoan trực tiếp thực nghiên cứu luận văn Mọi kết thu không chép từ nghiên cứu khác Các số liệu, sơ đồ kết luận văn chưa cơng bố Mọi liệu hình ảnh, biểu đồ trích dẫn tham khảo luận văn thu thập sử dụng từ nguồn liệu mở với đồng ý tác giả Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với lời cam đoan trên! Tác giả Trần Thị Thu Hiền Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm tự nhiên Vƣờn Quốc gia Bidoup – Núi Bà 1.2 Enzyme laccase 1.2.1 Giới thiệu laccase .4 1.2.2 Cấu trúc phân tử laccase 1.2.3 Cơ chế xúc tác laccase .7 1.2.4.Chất gắn kết .8 1.2.5 Tính chất laccase .8 1.2.5.1 pH tối ưu độ bền pH 1.2.5.2 Nhiệt độ tối ưu độ bền nhiệt 1.2.5.3 Hằng số động học phản ứng laccase 1.2.5.4 Chất ức chế laccase 1.2.6 Sự phân bố laccase vi sinh vật sinh enzyme laccase .10 1.2.7 Gene mã hóa enzyme laccase .12 1.2.8 Ứng dụng laccase 13 1.2.8.1 Xử lý rác thải loại màu thuốc nhuộm 13 1.2.8.2 Ứng dụng xử lý khí độc mơi trường nhiễm chuyển hóa polymer mạch dài 14 1.2.8.3 Ứng dụng công nghệ thực phẩm 15 1.2.8.4 Ứng dụng công nghệ dược phẩm công nghệ nano 15 1.2.8.5 Các ứng dụng khác laccase 16 1.2.9 Chi Polyporus đặc tính 17 1.3 Thuốc nhuộm đặc tính chúng .20 1.3.1 Khái quát phân loại thuốc nhuộm .20 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền 1.3.2 Khả phân hủy, loại màu thuốc nhuộm vi sinh vật sinh laccase 23 1.3.3 Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm tác hại 26 1.3.3.1 Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm thuốc nhuộm 26 1.3.3.2 Tác hại ô nhiễm thuốc nhuộm 26 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 28 2.1 Vật liệu phƣơng pháp .28 2.1.1 Vật liệu 28 2.1.2 Hóa chất 28 2.1.3 Thiết bị 28 2.1.4 Các môi trường nuôi cấy .28 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .29 2.2.1 Phân lập chủng nấm sinh enzyme ngoại bào .29 2.2.2 Sàng lọc chủng nấm sinh enzyme ngoại bào 29 2.2.3 Phương pháp thu dịch laccase môi trường lên men lỏng để xác định hoạt tính 29 2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính laccase 30 2.2.5 Phân loại chủng nấm 30 2.2.5.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống .30 2.2.5.2 Phân loại phương pháp xác định so sánh trình tự vùng ITS .31 2.2.5.3 Phương pháp xác định trình tự vùng ITS 31 2.2.6 Nghiên cứu ảnh hưởng số điều kiện nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp laccase 31 2.2.6.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy 32 2.2.6.2 Ảnh hưởng chất cảm ứng 32 2.2.6.3 Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy 32 2.2.6.4 Ảnh hưởng nguồn cacbon 32 2.2.6.5 Ảnh hưởng nguồn nitơ vô 32 2.2.6.6 Ảnh hưởng nguồn nitơ hữu 32 2.2.7 Đánh giá hiệu loại màu thuốc nhuộm hoạt tính laccase thơ từ chủng nấm FBD154 33 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………………… 34 3.1 Phân lập chủng nấm sinh enzyme ngoại bào .34 3.2 Sàng lọc chủng nấm sinh enzyme ngoại bào 35 3.3 Đặc điểm hình thái, phân loại định danh chủng nấm FBD154 38 3.3.1 Đặc điểm hình thái 38 3.3.2 Phân loại chủng FBD154 39 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền 3.3.2.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống .39 3.3.2.2 Phân loại phương pháp xác định so sánh trình tự vùng ITS (ITS1 - 5,8 S - ITS2) .39 3.4 Chọn lọc môi trƣờng điều kiện nuôi cấy .41 3.4.1 Ảnh hưởng số điều kiện nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp laccase chủng Polyporus sp FBD154 41 3.4.2 Ảnh hưởng pH môi trường lên khả sinh tổng hợp laccase chủng Polyporus sp FBD154 43 3.4.3 Ảnh hưởng chất cảm ứng lên khả sinh tổng hợp laccase chủng Polyporus sp FBD154 44 3.4.4 Ảnh hưởng nồng độ CuSO4 môi trường lên khả sinh laccase chủng Polyporus sp FBD154 46 3.4.5 Ảnh hưởng nguồn cacbon lên khả sinh tổng hợp laccase chủng Polyporus sp FBD154 47 3.4.6 Ảnh hưởng nguồn nitơ lên khả sinh tổng hợp laccase chủng Polyporus sp FBD154 48 3.4.6.1 Ảnh hưởng nguồn nitơ vô 48 3.4.6.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ hữu 50 3.5 Khả loại màu thuốc nhuộm enzyme thô sinh tổng hợp từ chủng nấm Polyporussp FBD154 51 3.5.1 Khả loại màu nhóm anthraquinone (RBBR, NY5) laccase thô từ chủng Polyporus sp FBD154 52 3.5.2 Khả loại màu azo (NY1, NY7) laccase thô từ chủng Polyporus sp FBD154 54 3.5.3 Khả loại màu thương mại (CLS LF-2B) laccase thô chủng Polyporus sp FBD154 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 Kết luận 60 Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 Tiếng Việt 62 Tiếng Anh 62 PHỤ LỤC 74 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid Ace Acetosyringone bp Base pair CLS Dimaren Black CLS CGK Chất gắn kết DDT Dichloro - Trichloroethane Diphenyl DNA Deoxyribonucleic acid Đtg Đồng tác giả HCH Hexachlorocyclohexane HBT Hydroxybenzotriazole ITS Internal transcribed spacer Lac Laccase LF-2B Everzol Red LiP Lignin peroxidase MnP Manganese peroxidase NY1 Acid red 299 NY5 Acid blue 281 NY7 Acid red 266 PCR Polymerase Chain Reaction RBBR Remazol brilliant blue R Si Sinapic acid Sy Syringaldehyde VIO Violuric acid VSV Vi sinh vật Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số vi sinh vật có khả sinh laccase 11 Bảng 1.2 Một số loại thuốc nhuộm hoạt tính 23 Bảng 3.1 Các chủng nấm sinh enzym ngoại bào 35 Bảng 3.2 Hoạt tính laccase hình ảnh khuẩn lạc chủng nấm môi trường PDA ………………………………………………………………………………… 36 Bảng 3.3 Hiệu suất loại màu thuốc nhuộm hoạt tính laccase FBD154 có mặt chất gắn kết khác 58 Bảng 3.4 So sánh hiệu suất loại màu laccase chủng nấm FBD154 so với laccase thu chủng nấm khác 59 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh khơng gian ba chiều laccase từ M albomyces Hình 1.2 Trung tâm hoạt động laccase Hình 1.3 Cơ chế xúc tác laccase [40] Hình 3.1 Hoạt tính tự nhiên mẫu nấm từ Bidoup 34 Hình 3.2 Hoạt tính laccase chủng nấm phân lập từ Bidoup – Núi Bà 38 Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc chủng nấm FBD154 38 Hình 3.4 Hệ sợi nấm kính hiển vi quang học 39 Hình 3.5 Cây phát sinh chủng loài chủng FBD154 40 Hình 3.6 Ảnh hưởng mơi trường nuôi cấy đến khả sinh laccase chủng Polyporus sp FBD154 42 Hình 3.7 Ảnh hưởng pH môi trường lên khả sinh laccase chủng Polyporus sp.FBD154 43 Hình 3.8 Ảnh hưởng chất cảm ứng lên khả sinh laccase chủng Polyporus sp FBD154 45 Hình 3.9 Ảnh hưởng nồng độ CuSO4 mơi trường lên khả sinh laccase chủng Polyporus sp FBD154 46 Hình 3.10 Ảnh hưởng nguồn cacbon lên khả sinh laccase chủng 47 Hình 3.11 Ảnh hưởng nguồn nitơ vô lên khả sinh laccase chủng Polyporus sp.FBD154 49 Hình 3.12 Ảnh hưởng nguồn nitơ hữu lên khả sinh laccase chủng Polyporus sp.FBD154 50 Hình 3.13 Khả loại màu thuốc nhuộm RBBR (A); NY5 (B) dịch enzyme thô chủng Polyporus sp FBD154 có khơng cómặt chất gắn kết .52 Hình 3.14 Sự thay đổi màu RBBR laccase thơ từ chủng Polyporus sp.FBD154 có khơng có mặt chất gắn kết 52 Hình 3.15 Sự thay đổi màu NY5 laccase thô từ chủng Polyporus sp.FBD154 có khơng có mặt chất gắn kết 52 Hình 3.16 Khả loại màu thuốc nhuộm NY1 (A); NY7 (B) enzyme thô chủng Polyporus sp FBD154 có khơng có mặt chất gắn kết 54 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền Hình 3.17 Sự thay đổi màu NY1 laccase thô từ chủng Polyporus sp FBD154 có khơng có mặt chất gắn kết 54 Hình 3.18 Sự thay đổi màu NY7 laccase thơ từ chủng Polyporus sp FBD154 có khơng có mặt chất gắn kết 54 Hình 3.19 Khả loại màu thuốc nhuộm CLS (A); LF-2B (B) dịch enzyme thơ chủng Polyporus sp FBD154 có khơng có mặt chất gắn kết 55 Hình 3.20 Sự thay đổi màu CLS laccase thô từ chủng Polyporus sp FBD154 có khơng có mặt chất gắn kết 56 Hình 3.21 Sự thay đổi màu LF-2B laccase thơ từ chủng Polyporus sp FBD154 có khơng có mặt chất gắn kết 56 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 66 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền production of several laccase isoenzymes by Trametes versicolor and on their ability to decolourise dyes Chemosphere63(6):912-7 49 Machczynski M.C., Vijgenboom E., Samyn B., Canters G.W (2004) Characterization of SLAC: A small laccase from Streptomyces coelicolor with unprecedented activity Protein Sci 13(9): 2388–2397 50 Mahmoud M.G., Rifaat H.M., El Sayed, O.H., El Beih, F.M.,Selim, M.S (2013) Effect of inducers and process parameters on laccase production by locally isolated marine Streptomyces lydicus from Red Sea, Egypt’’ International Journal of ChemTech Research 5(1): 15-23 51 Martínez S.M.S., Gutiérrez-Soto G, Garza C.F.R., Galván T.J.V., Cordero J.F.C., Luna C.E.H (2013) Purification and partial characterization of a thermostable laccase from Pycnoporus sanguineus CS-2 with ability to oxidize high redox potential substrates and recalcitrant dyes Agricultural and Biological Sciences 52 Martins M.A.M., Cardoso M.H., Queiroz M.J., Ramalho M.T., Campos A.M.O (1999) Biodegradation of azo dyes by the yeast Candida zeylanoides in batch aerated cultures Chemosphere 38: 2455–2460 53 Michniewicz A., Ullrich R., Ledakowicz S., Hofrichter M (2005) The white-rot fungus Cerrena unicolor strain 137 produces two laccase isoforms with different physico-chemical and catalytic properties Appl Microb Biotech 69(6):1-7 54 Moldes D., Fernández-Fernández M., Sanromán M.A (2012) Role of laccase and low molecular weight metabolites from Trametes versicolor in dye decolorization Sci World J 2012: pages 55 Mohorčič M., Friedrich J., Pavko A (2004) Decoloration of the diazo dye reactive black by immobilised Bjerkandera adusta in a stirred tank bioreactor Acta Chim Slov 51: 619-628 56 Niladevi K.N, Sukumaran Rajeev K., Jacob Nicemol Anisha G.S., Prema P (2009) Optimization of laccase production from a novel strainStreptomyces 67 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền psammoticususingresponse surface methodology Microbiological Research164: 105113 57 Otterbein L, Record E, Longhi S, Asther M, Moukha S (2000)Molecular cloning of the cDNA encoding laccase from Pycnoporus cinnabarinus I-937 and expression in Pichia pastoris.Eur J Biochem 267:1619–1625 58 Palmieri G., Cennamo G., Faraco V., Amoresano A., Sannia G., Giardina P (2000) A typical laccase isoenzymes from copper supplemented Pleurotus ostreatus cultures 59 Parshetti G.K., Kalme S.D., Gomare S.S., Govindwar S.P (2007) Biodegradation of Reactive Blue 25 by Aspergillus ochraceus NCIM–1146 Bioresour Technol 98: 36383642 60 Patnaik P (1999) “A comprehensive guide to the properties of hazardous chemical substances”, 2nd ed., John Wiley & Sons Publishers 61 Paweena Thongkreda, Pongtharin Lotrakul, Sehanat Prasongsuka, Tsuyoshi Imai, Hunsa Punnapayaka (2011)Oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons by a tropical isolate of Pycnoporus coccineus and its laccase.ScienceAsia 37: 225–233 62 Peralta-Zamora P., De Moraes S G., Esposito E., Antunes R., Reyes J., and Duran N (1998) Decolorization of pulp mill effluents with immobilized lignin and manganese peroxidase from Phanerochaete chrysosporium Environ Technol 19(5): 521–528 63 Piontek, K., Antorini, M., Crystal, T.C (2002) Structure of a Laccase from the fungus Trametes versicolor at 1.9 – A Resolution Containing a Full Complement of 64 Pilz R., Hammer E., Schauer F., Krag U (2003) Laccase-catalyzed synthesis of coupling products of phenolic substrates in different reactors Appl Microbiol Biotechnol60: 708-712 65 Pointing S.B (2001) Feasibility of bioremediation by white-rot fungi Appl Microbiol Biotechnol57: 20-33 68 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền 66 Pointing S.B., Pelling A.L., Smith G.J., Hyde K.D., Reddy C.A (2005) Screening of basidiomycetes and xylariaceous fungi for lignin peroxidase and laccase genespecific sequences Mycol Res 109(1): 115-124 67 Pointing S.B., Jones E.B.G., Vrijmoed L.L.P (2000) Optimization oflaccase production by Pycnoporus sanguineus in submergedliquid cultures.Mycologia 92:139– 144 68 Prolonged Laccase Production by a Cold and pH Tolerant Strain ofPenicillium pinophilum(MCC 1049) Isolated from a Low Temperature Environment 69 Ramalho P.A., Cardoso M.H., Cavaco-Paulo A., Ramalho M.T (2004) Characterization of azo reduction activity in a novel ascomycete yeast strain Appl Microbiol Biotechnol70: 2279–2288 70 Rani C., Jana A.K., Bansal A (2011) Studies on the biodegradation of azo dyes by white rot fungi Daedalea flavida in the absence of external carbon source 2011 2nd International Conference on Environmental Science and Technology 6: 147-150 71 Ratanapongleka K., Phetsom J (2014) Decolorization of synthetic dyes by crude laccase from Lentinus polychrous Lev International Journal of Chemical Engineering and Applications 5(1): 26-30 72 Riva S (2006) Laccase: Blue enzyms for green chemistry.Trends in Biotechnology 24(5): 219–226 73 Rodriguez C S., Sanromán M., Gübitz G M (2005) Influence of redox mediators and metalions on synthetic acid dye decolourization by crude laccase from 74 Record E, Punt PJ, Chamkha M, Labat M, van den Hondel CAMJJ, Asther M (2002) Expression of the Pycnoporus cinnabarinus laccase gene in Aspergillus niger and characterization of the recombinant enzyme Eur J Biochem 269:602–609 75 Reid I.D (1989) Solid state fermentation for biological delignification Enz Microb Technol 11: 786-803 69 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền 76 Robles A., Lucas R., Cienfueges A.D., Galvez A (2000) Phenol oxidase activity in strains of the hyphomycete Chalara paradoxa isolated from Olivemill wastewater disposal ponds Enzyme Microbial Technol 26: 484-490 77 Riva S (2006) Laccase Blue enzyms for green chemistry.Trends in Biotechnology 24(5): 219–226 78 Ruijssenaars H.J., Hartmans S (2004) A cloned Bacillus halodurans multicopper oxidase exhibiting alkaline laccase activity Appl Microbiol Biotechnol 65: 177-182 79 Ryu W (1992) Decolorization of azo dyes by Aspergillus sojae B10 J Microb Biotechnol 2: 215–219 80 Sadhasivam S., Savitha S., Swaminathan, Feng-Huei Lin (2008) Production, purification and characterization of mid-redox potential laccase from a newly isolated Trichoderma harzianum WL1 Process Biochemistry 43: 736 – 742 81 Sathishkumar P., Murugesan K., Palvannan T (2010)Production of laccase from Pleurotus florida using agro-wastes and efficient decolorization of Reactive blue 198 82 Saratale, G.D., Kalme, S.D., Govindwar, S.P (2006) Decolorization of textile dyes by Aspergillus ochraceus (NCIM-1146) Ind J Biotechnol5(3): 407–410 83 Saratale R.G., Saratale G.D., Chang J.S., Govindwar SP (2011)Bacterial decolorization and degradation of azo dyes: a review" J Taiwan Inst Chem Eng 42:138-57 84 Schneider P., Michael B.C., Kristine M., Torben, Lars K.S., Peter R.O., Kiberly M.B., Stephen HB, Feng X(1999)Characterization of a Coprinus cinereus laccase 85 Selvam K., Shanmuga P.M (2012) Biological treatment of azo dyes and textile industry effluent by newly isolated white rot fungi Schizophyllum commune and 86 Shiroya A.J.Recent advances of laccase enzyme in industrial biotechnology 70 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền Bhagwan Mahavir College Of Biotechnology, Surat 87 Singh H (2006) Mycoremediation-Fungal Bioremediation Wiley Interscience Hoboken 421-471 88 Soares, G.M., Amorim, M.T.P and Costa-Ferreira, M (2001) Use of laccase together with redox mediators to decolourize Remazol Brilliant Blue R J Biotech89:123-129 89 Songserm Pajareeya, Sangvanich Prakitsin Sihanonth Polkit, Karnchanatat Aphichart (2012) Decolorization of textile dyes by Polyporus pseudobetulinus and extracellular laccase African Journal of Microbiology Research 6(4): 779-792 90 Song Z., Zhou J., Wang J., Yan B., Du C(2003) Decolorization of azo dyes by 91 Sullivan G., Henry E.D (1971)Occurrence and distribution ofphenoxazinone pigments in the genus Pycnoporus.J Pharmaceu-tical Sci 60:1097–1098 92 Sulistyaningdyah W.T., Ogawa J., Tanaka H., Maeda C., Shimizu S (2003) Characterization of alkaliphilic laccase activity in the culture supernatant of Myrothecium verrucaria 24G-4 in comparison with bilirubin oxidase FEMS Microbiol Lett 230: 209-214 93 Suzuki Takashi, Endo Kohki, Ito Masaaki, Tsujibo Hiroshi, Miyamoto Katsushiro, Jnamori Yoshihiko (2003) A Thermostable laccase from Streptomyces lavendulae REN-7: Purification, characterization, nucleotide sequence and expression Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 67: 2167-2175 94 Téllez-JuradoA., Arana-Cuenca A., González Becerra A.E., G Viniegra-González G., Loera O (2006)Expression of a heterologous laccase by Aspergillus nigercultured by solid-state and submerged fermentations” Enzyme and Microbial Technology38(50): 665-669 95 Uzan E., Portet B., Lubrano C., Milesi S., Favel A., Lesage-Meessen L, Lomascolo A (2011) Pycnoporus laccase-mediated bioconversion of rutin to oligomers suitable for 71 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền biotechnology applications Appl Microbiol Biotechnol 90:97–105 96 Viswanath, B., Chandra, M.S., Kumar, K.P and Rajasekhar-Reddy, B (2008) Production and purification of laccase from Stereum ostrea and its ability to decolorize textile dyes Dyn Biochem Pro Biotech Mol Biol 2: 19-25 97 Wang H.X., Ng T.B (2004) Purification of a novel low-molecular-mass laccase with HIV-1 reverse transcriptase inhibitory activity from the mushroom Tricholoma giganteum Biochem Biophys Res Commun315(2): 450-454 98 Wang, J.W., Wu, J.H., Huang, W.Y and Tan R.X (2006) Laccase production by Monotospora sp., and endophytic fungus in Cynodon dactylon”, Bioresource Technology 97(5): 786-789 99 Wang CL , Zhao M., Lu L.,Wei XD, Li TL(2011) Characterization of spore laccase from Bacillus subtilis WD23 and its use in dye decolorization.African Journal of Biotechnology 10(11): 2186-2192 100 Xu L., Wang H., Ng T (2012) A Laccase with HIV-1 Reverse Transcriptase Inhibitory Activity from the Broth of Mycelial Culture of the Mushroom Lentinus tigrinus J Biomed Biotech2012: 1-7 101 Xiao Y Z., Chen Q., Hang J., Shi1 Y., Wu J., Hong Y Z., Wang Y P(2004) Selective induction, purification and characterization of a laccase isozyme genes from Trametes sp AH28-2 and analyses of their differential expression Applied Microbiology and Biotechnology 71: 493-501 102 Yadav J.S., Tripathi J.P (1991) Optimization of cultivation and nutrition conditions and substrate pre-treatment for solid substrate fermentations of wheat straw by Coriolus versicolor Folia Microbiologica36: 249-301 103 Yo Johannes C and Majcherczyk A (2000) Natural Mediators in the Oxidation of PolycyclicAromatic Hydrocarbons by Laccase Mediator Systems Appl Environ Microbiol 66: 524–528 104 Yeşİlada Ö., Bİrhanli E., Ercan S., Özmen N., (2014) Reactive dye decolorization 72 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền activity of crude laccase enzyme from repeated-batch culture of Funalia trogii Turk J Biol 38: 103-110 105 Zadrazil F., Brunnert H., (1981) Investigation of physical parameters important for the solid state fermentation of straw by white rot fungi Appl Microbiol Biotechnol 11: 183-188 106 Zeng, G.M., Yu, H.Y., Huang, H.L., Huang, D.L., Chen, Y.N, Huang, G.H and Li, G.B (2006) Laccase activities of a soil fungus Penicillium simplicissimum in relation to lignin degradation.W J Microb Biotech 22(4): 317-324 107 Zhang G.Q., Wang Y.F., Zhang X.Q., Ng T.B., Wang H.X (2010) Purification and characterization of a novel laccase from the edible mushroom Clitocybe maxima Pro Biochem 45(5): 627-633 108 A., T., Zouari-Mechichi H., Mechichi T., Dhouib A., Sayadi S., Martίnez Martίnez M J (2006) Laccase purification and characterization from Trametes trogii isolated in Tunisia decolorization of textile dyes by the purified enzyme.Enz Microb Technol 39: 141-148 73 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Phụ lục Thành phần môi trƣờng nuôi cấy Thành phần môi trƣờng PDA Khoai tây (lấy dịch chiết) Glucose Agar H2 O pH 6,5 GYMP MgSO4.7H2O KH2PO4 K2HPO4 Glucose Peptone Cao men NH4Cl Cao malt H2 O pH Czapek Saccharose MgSO4 KH2PO4 NaCl 74 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Thành phần môi trƣờng NaNO3 KCl FeSO4 H2O pH Mechichi Cao malt Cao men Glucose H2O pH 5,5 Phụ lục Thành phần chất phản ứng loại màu Đối chứng Không có chất gắn kết Có chất gắn kết Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền Phụ lục Tách DNA tổng số từ nấm  ngày Bước 1: Nuôi cấy thu sinh khối nấm khoảng đến  Bước 2: Thu sinh khối cách ly tâm 6000 vòng/phút 10 phút 4oC  Bước 3: Rửa đến lần sinh khối mơi trường ni cấy, ly tâm 6000 vịng/phút 10 phút 4oC  Bước 4: Lấy sinh khối cho vào cối sứ khử trùng nghiền nitrogen lỏng thành bột mịn  Bước 5: Dùng thìa xúc mẫu cho vào ống eppendorf, bổ sung 600 μl đệm lyzozyme, lắc nhẹ  Bước 6: Bổ sung tiếp 65 μl lyzozyme, ủ 37oC 30-45  Bước 7: Cho μl protease K ủ 56oC phút  Bước 8: Bổ sung tiếp chloroform: isoamyl alcohol(tỷ lệ 24:1) với tỷ lệ 1:1 thể tích, trộn sau ly tâm 12.000 vòng/phút 15 phút 4oC  Bước 9: Thu phần dịch bên cho vào ống eppendorf  Bước 10 : Bổ sung isopropanol với tỷ lệ 1:1 thể tích, ủ 4oC qua đêm  Bước 11: Ly tâm 12000 vòng/phút 15 phút ở 4oC,  Bước 12: Hòa tan kết tủa 500 μl TE  Bước 13: Loại RNA cách thêm RNAse, ủ 37oC qua đêm  Bước 14: Bổ sung chloroform : isoamyl alcohol(tỷ lệ 24:1) với tỷ lệ thu tủa 1:1 thể tích sau đảo nhẹ ly tâm 12000 vịng/phút, 15 phút 4oC  Bước 15: Thu phần dịch phía 76 Luận văn Thạc sĩ Sinh học  Trần Thị Thu Hiền Bước 16: Bổ sung ethanol 100% (giữ lạnh) tỷ lệ 1:1 thể tích  Bước 17: Ly tâm 12000 vòng/phút 15 phút C, thu kết tủa sau rửa ethanol 80% Làm khơ DNA  Bước 18: Hịa 100 μl TE bảo quản C o o Phụ lục Thành phần phản ứng Thành Đệm T dNTPs MgSO Mồi IT Mồ Taq P DNA k ddH2O Tổng t Phụ lục Chu trình nhiệt Bước Biến tí Biến tí Gắn m Kéo dà Kéo dà 77 ... tài ? ?Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu số đặc tính chủng nấm đảm thu thập từ vƣờn quốc gia Bidoup - Núi Bà” tiến hành Luận văn bao gồm nội dung chủ yếu sau: - Phân lập sàng lọc chủng nấm đảm có... trưởng khác nấm Tuy nhiên số liệu thu giúp nhà nghiên cứu định hướng cho nghiên cứu sâu chủng Hình 3.1 Hoạt tính tự nhiên mẫu nấm từ Bidoup Trong 60 mẫu nấm thu thập từ vườn Quốc gia Bidoup- Núi Bà... CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập chủng nấm sinh enzyme ngoại bào Từ 60 mẫu nấm thu thập từ vườn quốc gia Bidoup – Núi Bà thu? ??c tỉnh Lâm Đồng phân lập 38 mẫu Hầu hết nấm thu đo laccase,