Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh enzyme phytase

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN *************** Phan Thị Thu Mai PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT SINH ENZYME PHYTASE LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN *************** Phan Thị Thu Mai PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT SINH ENZYME PHYTASE Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS ĐÀO THỊ LƯƠNG Hà Nội – Năm 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN 14 1.1 AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE 14 1.1.1 Cấu trúc axit phytic 14 1.1.2 Sự phân bố phytate tự nhiên chức phytate 15 1.1.3 Đặc tính kháng dinh dưỡng axit phytic 17 1.1.4 Ảnh hưởng phytic tới môi trường 21 1.2 PHYTASE 21 1.2.1 Chức phytase 21 1.2.2 Các đặc tính sinh lý, sinh hóa phytase 22 1.2.3 Nguồn phytase tự nhiên 23 1.2.4 Phân loại phytase 24 1.2.4.1 Histidine axit phosphatase (HAP) 25 1.2.4.2 ß-propeller phytase (BPPhys) 26 1.2.4.3 Purple axit phosphatase (PAP) phytases 27 1.2.5 Gen mã hóa phytase 27 1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sản xuất phytase từ vi sinh vật 29 1.2.6.1 Các yêu tố vật lý 29 1.2.6.2 Các yếu tố dinh dưỡng 30 1.2.7 Điều khiển sinh tổng hợp phytase 31 1.2.8 Các ứng dụng phytase 33 1.2.8.1 Ứng dụng phytase phụ gia thức ăn chăn nuôi nuôi trồng thủy sản… 33 1.3 1.2.8.2 Ứng dụng phytase công nghiệp thực phẩm .35 1.2.8.3 Ứng dụng phytase cải tạo đất 36 1.2.8.4 Ứng dụng phytase dược phẩm 36 1.2.8.5 Bán tổng hợp peroxydase 37 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU PHYTASE 37 1.3.1 Nghiên cứu làm tăng tính bền nhiệt phytase 37 1.3.2 Nghiên cứu thay đổi pH hoạt động tối ưu phytase 38 1.3.3 Nghiên cứu khả bền axit enzyme protease phytase .39 1.3.4 Nghiên cứu 1.3.5 Nghiên cứu 1.3.6 Những nghiên 1.4 LÊN MEN XỐP 1.4.1 Khái niệm 1.4.2 Những ưu điể 1.4.3 Các ứng dụng 1.4.3.1Sản xuất axit hữu 1.4.3.2Sản xuất hợp chất tạo hương tạo vị 1.4.3.3 1.4.3.4 1.4.3.5Sản xuất hợp chất hoạt tính sinh học 1.4.3.6Sản xuất thuốc trừ sâu sinh học 1.4.3.7Sản xuất cồn sinh học 1.5 CHI BACILLUS VÀ PHÂN LOẠI TRONG CHI BACILLUS 1.6 THU HỒI ENZYME 1.6.1 Chiết rút enzy 1.6.2 Cô đặc enzym 1.6.2.1Tủa enzyme muối ammonium sulfate 1.6.2.2Tủa dung môi hữu CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 CHỦNG VI SINH VẬT, MƠI TRƯỜNG, THIẾT BỊ VÀ HĨA CHẤT NGHIÊN CỨU 2.1.1 Chủng vi sinh 2.1.2 Môi trường ng 2.1.2.1Môi trường sàng lọc chủng ưa nhiệt môi trư 2.1.2.2Môi trường sàng lọc chủng sinh phytase (PSM media)…………… 2.1.2.3Môi trường dịch thể kích thích sinh phytase 2.1.2.4Mơi trường ni xốp 2.1.3 Thiết bị 2.1.4 Hóa chất 2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp 2.2.2 Tuyển chọn ch 2.2.3 Phương pháp 2.2.4 Phương pháp 2.2.4.1Phương pháp phân loại vi khuẩn dựa vào đọc 2.2.4.2Quan sát hình thái 2.2.5 Nghiên cứu đ chủng vi sinh vật nghiên cứu 2.2.5.1Nghiên cứu điều kiện ni cấy giống thích hợ trưởng chủng nghiên cứu 2.2.5.2Nghiên cứu điều kiện ni cấy xốp thích h tổng hợp phytase chủng nghiên cứu 2.2.6 Thu hồi enzym 2.2.6.1Chiết xuất enzyme 2.2.6.2Thu hồi enzyme dung môi hữu 2.2.7 Nghiên cứu en 2.2.7.1Gen mã hóa phytase 2.2.7.2Các đặc tính enzyme CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN 3.1.1 Lựa chọn chủ 3.1.2 Lựa chọn chủ 3.1.3 Lựa chọn chủ 3.2PHÂN LOẠI 3.2.1 Xác định trình 3.2.2 Đặc điểm hình 3.3 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY 3.3.1 Nghiên cứu đ 3.3.2 Nghiên cứu đ 3.4THU HỒI ENZYME 3.4.1 Thu hồi enzym 3.4.2 Tủa enzyme b 3.5 NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE CỦA CHỦNG SP1901 90 3.5.1 Phân tích trình tự gen phytase so sánh với lồi có quan hệ gần gũi……… 90 3.5.2 Đặc tính enzyme phytase thơ……… 90 DANH MỤC TÀI LIÊU THAM KHẢO 93 DANH MỤC BẢNG, HÌNH Tên bảng Trang Bảng Hàm lượng phosphor phytate số loại thức ăn gia cầm phổ biến Bảng Các loại môi trường dùng cho lên men xốp……………………………… 47 Bảng Trình tự mồi dùng cho phản ứng khuếch đại gen gyrA, rpoB, purH, polC, groEL………………………………………………………………………… 53 Bảng Trình tự mồi dùng cho phản ứng đọc trình tự ADNr 16S………………… 54 Bảng Hoạt tính phytase chủng SP1901 D15 lên men xốp lên men dịch thể 63 o Bảng Độ bền nhiệt chủng SP1901 D15 60 C………………………… 64 Tên hình Hình Cấu trúc axit phytic đề xuất Neuberg, 1908 (A) Anderson, 1914 (B)…………………………………………………………………… Hình Sự tương tác ion kim loại với IP6……………………………………… Hình Sự liên kết IP6 với protein tinh bột trực tiếp Hình Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân phytate…… Hình Cấu trúc khơng gian phyA từ A niger NRRL 3135……………………… Hình Mơ hình cấu trúc phytase β-propeller………………………………………… Hình Lên men xốp túi nilon……………………………………………… Hình Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng Pvc……………… Hình Sinh trưởng vòng phân giải phytase chủng S PSM……………………………………………………………………… ……… Hình 10 Cây phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn SP1901 lồi Bacillus có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự AND r16S……………………………………… Hình 11 Cây phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn SP1901 lồi thuộc nhóm Bacillus subtilis dựa vào trình tự kết nối gen gyrA, rpoB, purH, polC, groEL 16S rRNA…………………………………………………………………………………… Hình 12 Hình thái tế bào (trái) khuẩn lạc (phải) chủng SP1901……………… Hình 13 Mơi trường nhân giống thích hợp chủng SP1901…………………………… Hình 14 pH thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901………………………………… Hình 15 Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901…………………………… Hình 16 Thời gian thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901………………………… Hình 17 Chế độ thơng khí thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901………………… Hình 18 Cơ chất thích hợp cho lên men xốp chủng SP1901……………………… Hình 19 Độ ẩm thích hợp cho lên men xốp chủng SP1901……………………… Hình 20 Ảnh hưởng tỷ lệ cấy giống cho lên men xốp chủng SP1901………… Hình 21 Ảnh hưởng thời gian ni cấy lên sinh khối hoạt tính phytase chủng SP1901…………………………………………………………………………… Hình 22 Nguồn bon thích hợp cho lên men xốp chủng SP1901 (Đối chứng âm: khơng bổ sung nguồn bon)…………………………………………………… Hình 23 Nguồn nitơ thích hợp cho lên men xốp chủng SP1901 (Đối chứng âm: khơng bổ sung nguồn nitơ)……………………………………………………………… Hình 24 Ảnh hưởng ion kim loại đến khả sinh tổng hợp phytase chủng SP1901…………………………………………………………………………… 2+ Hình 25 Ảnh hưởng hàm lượng Ca đến khả sinh tổng hợp phytase chủng SP1901…………………………………………………………………………… Hình 26 Chiết xuất enzyme dung mơi khác nhau…………………………… Hình 27 Tủa enzyme cồn aceton……………………………………………… Hình 28 Cây phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn SP1901 loài Bacillus có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự gen phytase…………………………………… Hình 29 Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền phytase chủng SP1901…………… Hình 30 pH hoạt động thích hợp phytase chủng SP1901………………………… Hình 31 Nhiệt độ hoạt động thích hợp phytase chủng SP1901…………………… Hình 32 Ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính phytase chủng SP1901… Hình 33 Ảnh hưởng Ca 2+ đến độ bền nhiệt phytase chủng SP1901 xử lý o 60 C (trái), xử lý 70 o Hình 34 Khả bền nhiệt phytase chất sấy khô 50 C 24h Hình 35 Ảnh hưởng enzyme tiêu hóa đến hoạt động phytase chủng SP1901… DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT ANFs Anti-nutritional factors BPP ß-propeller phytase DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene diamine tetracetic acid GRAS Generally regarded as safe GIT Gastro intestinal tract- ống dày ruột HAP Histidine acid phosphatase phytase IP1, IP2, IP3,IP4,IP5 Inositol mono-, bis-, tris-, tetrakis-, pentakis-phosphate IP6 Phytic acid/ myo-inositol hexakisphosphate IUB International Union of Biochemistry IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry NCBI National Center for Biomedical Informatics PAP Purple acid phosphatase phytase PDB Protein database bank Pi Phosphate vơ Tm Nhiệt độ biến tính ppm Một phần triệu MỞ ĐẦU Phospho (P) nguyên tố thiết yếu cho sinh trưởng phát triển sinh vật, phospho chủ yếu tìm thấy loại đá phốtphat vô 3- thể sống Ở thể sống, phospho vô dạng phốtphat PO tham gia vào cấu trúc đại phân tử sinh học ADN ARN (hình thành liên kết phosphoeste gốc 3’OH 5’phosphate nu kế tiếp, tham gia cấu thành “đồng tiền lượng” thể sống ATP (adenosin triphosphate), thành phần chủ yếu màng tế bào (phospholipid), muối canxi phốtphat làm cứng xương động vật… Do độ hoạt động hóa học cao, khơng người ta tìm thấy dạng đơn chất tự nhiên thể sống khơng thể hấp thụ P dạng hợp chất Axit phytic (myo-inositol hexakisphosphate) dạng dự trữ chủ yếu phospho tự nhiên, có mặt nhiều loại ngũ cốc, hạt họ đậu hạt lấy dầu (Axit phytic chiếm 80% lượng P thực vật này) nguồn dinh dưỡng quan trọng cho người động vật Axit phytic có khả tạo phức chặt chẽ với ion kim loại tạo nên muối (phytate: muối axit phytic + 2+ 2+ với Na , phytin: muối axit phytic với Ca , Mg ) hợp chất khác axit amin, protein, làm ức chế enzyme tiêu hóa, ngăn cản hấp thu chất thể sống Vì axit phytic coi yếu tố kháng dinh dưỡng (an anti-nutrient compound) thức ăn thực phẩm Phytase enzyme đóng vai trị quan trọng cơng nghiệp chế biến thực phẩm thức ăn chăn nuôi Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân muối axit phytic (phytate, phytin) giải phóng orthophosphate myo-inositol-6phosphate cấp độ thấp phản ứng phosphoyl hóa Việc sử dụng phytase không làm tăng khả hấp thu phospho vơ mà cịn tăng khả hấp thu ngun tố khống khả tiêu hóa hợp chất khác Do dùng phytase để thủy phân, loại bỏ axit phytic thành phần thức ăn cần thiết Smith AK, Rackis JJ (1957), Phytin elimination in soybean protein isolation Journal of the American Chemical Society 79: 633-637 131 Steinke FH, Hopkins DT (1978), Biological availability to the rat of intrinsic and extrinsic iron with soybean protein isolates Journal of Nutrition 108(3): 481-489 132 Susana Rod ríguez Couto, M Ángeles Sanromán (2006), Application of solid-state fermentation to food industry—A review Journal of Food Engineering 76(3): 291–302 133 Tambe SM, Kaklij GS, Kelkar SM, Parekh LJ (1994), Two distinct molecular forms of phytase from Klebsiella aerogenes: Evidence for unusually small active enzyme peptide Ferment Bioeng 77(1): 23-27 134 Tanaka K, Yoshida T, Kasai Z (1974), Radio autographic demonstration of the accumulation site of phytic acid in rice and wheat grains Plant Cell Physiol 15(1): 147-151 135 Tanaka K, Kasai Z (1981), Phytic acid in rice grain In: Ory RLD, editor Antinutrients and natural toxycants in food Westport, CT: Food and Nutrition press: 239-260 136 Thompson DB, Erdman JW (1982), Phytic acid determination in soybeans Journal of Food Sciences 47(2): 513-517 137 Thompson LU (1986), Phytic acid: a factor influencing starch digestibility and blood glucose response In: Graf E, editor Phytic Acid: Chemistry and Applications Minneapolis, MN: Pilatus Press: 173-194 138 Thompson LU (1993), Potential health benefits and problems associated with antinutrients in foods Food Research International 26(2): 131-149 139 Thuy T T (2010), Thermostable alkaline phytase from Bacillus sp MD2: effect of divalent metals on activity and stability Journal Inorganic biochemistry 105(7): 1000-1007 140 Thuy T T (2010), Thermostable phytase from a Bacillus sp Heterologous production, mutation, characterization and assay development, Doctoral Thesis, Department of Biotechnology, Lund university, Sweden 141 Thuy Thi Tran (2010), A thermostable phytase from Bacillus sp MD2: cloning, expression and high-level production in Escherichia coli Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 37(3): 279–287 142 Tuyet T.T , Nguyen Duy Long, Hoang Quoc Khanh (2004), “Production of phytase by Aspergillus niger NRRL 363” J Agri Sci Technol Nong Lam University 4: 28-32 130 Ullah AHJ, Sethumadhavan K, Lei XG, Mullaney EJ (2000), Biochemical characterization of cloned Aspergillus fumigatus phytase (phyA) Biochemical and Biophysical Research Communications 275(2): 279-285 143 Ullah AHJ, Sethumadhavan K, Mullaney E J, Ziegelhoffer T, Austin-Phillips S (2002), Cloned and expressed fungal phyA gene in alfalfa produces a stable phytase Biochemical and Biophysical Research Communications 290(4): 1343–1348 145 Ullah AHJ, Sethumadhavan K (2003), PhyA gene product of Aspergillus ficuum and Peniophora lycii produces dissimilar phytases Biochemical and Biophysical Research Communications 303(2): 463-468 146 Vaintraub IA, Bulmaga VP (1991), Effect of phytate on the in vitro activity of digestive proteinases Journal of Agricultural and Food Chemistry 39: 859-861 147 Vallee BL, Galdes A (1984), The metallobiochemistry of zinc enzymes Adv Enzymol 56: 283-340 148 Vats P, Banerjee UC (2004), Production studies and catalytic properties of phytases (myoinositolhexakisphosphate phosphohydrolase): an overview Enzyme Micob Technol 35: 3-4 149 Vohra A, Satyanarayana T (2003), Phytases: microbial sources, production, purification, and potential biotechnological applications Critical Reviews in Biotechnology 23(1): 29-60 150 Vohra P, Gray GA, Kratzer FH (1965), Phytic acid-metal complexes Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 120(2): 447-449 151 Walker ARP (1951), Cereals, phytic acid, and calcification Lancet 2(6676): 244-248 152 Wang LT, Lee FL, Tai CJ & Kasai H (2007), Comparison of gyrB gene sequences, 16S rRNA gene sequences and DNA-DNA hybridization in the Bacillus subtilis group International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 57(8): 1846-1850 153 Wang xueying (2003), Phytase studies: producer screening, enzyme purification and characterization and gene cloning PhD thesis, Faculty of graduate studies Mahidol University 154 Wills MR, Day RC, Phillips JB, Bateman FC (1972), Phytic acid and nutritional rickets in immigrants Lancet 1(7754): 771-773 155 Wodzinski RJ, Ullah AHJ (1996), Phytase Advances in Applied Microbiology 42: 263-302 156 Wyss M., Brugger R., Kronenberger A., Roland R., Fimbel R., Oesterhelt G., Lehmann M., Adolphus P G M Van Loon (1999), Biochemical Characterization of Fungal Phytases (myo-Inositol hexakisphosphate Phosphohydrolases): Catalytic Properties Applied and environmental microbiology 65(2): 367–373 144 157 Yetti M., Rina D., Neni G Gita C (2010), Identification Characterization and Production of Phytase from Endophytic Fungi World Academy of Science, Engineering and Technology 65(2010): 1044 158 Yi Z, Kornegay ET, Ravindran V, Denbow DM (1996), Improving phytate phosphous availability in corn and soybean meal for broilers using microbial phytase and calculation of phosphous equivalency values for phytase Poultry Sciences 75(2): 240-249 159 Yoon JH, Thompson LU, Jenkins DJ (1983), The effect of phytic acid on in vitro rate of starch digestibility and blood glucose response The American Journal of Clinical Nutrition 38(6): 835-842 160 Yoon SJ, Choi YJ, Ki MH, Kwang CK, Wook KJ, Cheol LC, Hoo JY (1996), Isolation and identification of phytase producing bacterium, Enterobacterium sp 4, and enzymatic properties of phytase enzyme Enzyme Microbial Technology 18(6): 449-454 WEBSITE 161 162 163 164 165 www.nature.com www.ncbi.nml.nhi.com www.elsevier.com www.sciencedirect.com/science www.scribd.com/doc/19835831/Enzyme-Hoc PHỤ LỤC o Danh sách chủng có khả sinh trưởng 40 C sinh phytase o +: có khả sinh trưởng 40 C có khả sinh phytase o : khơng có khả sinh trưởng 40 C khơng có khả sinh phytase Bộ giống phân lập từ Sa Pa Số thứ Chủng tự 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 SP11 SP12 SP13 SP14 SP15 SP16 SP17 SP18 SP19 SP110 SP111 SP112 SP113 SP114 SP115 SP116 SP117 SP118 SP119 SP120 SP121 SP122 SP123 SP124 SP125 SP126 SP21 SP22 Bộ giống phân lập từ Sa Pa Số thứ Chủng tự 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 SP38 SP39 SP41 SP42 SP43 SP44 SP45 SP46 SP47 SP48 SP49 SP51 SP52 SP53 SP54 SP55 SP56 SP57 SP58 SP59 SP510 SP511 SP512 SP513 SP514 SP515 SP62 SP63 SP64 SP65 Bộ giống phân lập từ Sa Pa Số thứ Chủng tự 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 SP85 SP86 SP87 SP812 SP91 SP92 SP93 SP94 SP95 SP96 SP101 SP102 SP103 SP104 SP105 SP106 SP107 SP108 SP109 SP1010 SP1011 SP1012 SP1013 SP1014 SP1015 SP1016 SP111 SP112 SP113 SP114 Bộ giống phân lập từ Sa Pa Số thứ Chủng tự 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 SP915 SP121 SP122 SP123 SP124 SP125 SP126 SP127 SP128 SP1211 SP1212 SP1213 SP1214 SP1215 SP1216 SP1217 SP1218 SP1219 SP1220 SP1221 SP1222 SP1223 SP131 SP132 SP133 SP134 SP135 SP136 SP137 SP138 Bộ giống phân lập từ Sa Pa Số thứ Chủng tự 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 SP163 SP164 SP165 SP166 SP167 SP168 SP169 SP1610 SP1611 SP1612 SP1613 SP1614 SP171 SP172 SP173 SP174 SP175 SP176 SP177 Bộ giống phân lập từ Ba Vì Số thứ tự 10 11 12 13 14 15 16 17 92 D15 D12 4524 BS9 D13 BiO2 B2610 B56 BS6 B71 B55 5-4 B315 B6633 B52 Bộ giống phân lập từ Phú Quốc Số thứ tự 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Trình tự gen chủng SP1901: ADNr 16S, groEL, gyrA, polC, purH, rpoB >16S rDNA GGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGC ATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCC GCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATG CGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGG CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACG AAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGT AAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCAC CTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCC GCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAG GGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACC GGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGT GGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACC AGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAA GCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAA CGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTA ACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCA AAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTC GAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCT AGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTT GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGC AACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTG CCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCC CCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCA GCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCG >groEL TTACATGGTGACTGATTCTGATAAGATGGAAGCGGTTCTTGACAATCCTT ACATCTTAATCACAGACAAAAAAATCACAAACATTCAAGAAATCCTTCC TGTGCTTGAGCAAGTTGTACAGCAAGGCAAACCGTTGCTTCTGATCGCT GAAGATGTTGAAGGGGAAGCTCTTGCTACACTCGTTGTCAACAAACTTC GCGGCACATTCAACGCTGTTGCCGTTAAAGCTCCTGGCTTCGGTGACCG CCGTAAAGCAATGCTTGAAGACATCTCTGTTCTTACAGGCGGAGAAGTG ATCACAGAAGACTTAGGCCTTGACCTGAAATCTACTGAAATCGGACAAT TGGGACGCGCTTCTAAAGTTGTGGTAACGAAAGAAAACACAACAATCGT AGAAGGCGCAGGCGACACTGAAAAAATCGCTGCACGCGTCAACCAAAT CCGCGCTCAAGTGGAAGAAACAACTTCTGAATTCGACAGAGAAAAATT ACAAGAGCGTCTTGCGAAACTTGCCGGCGGCGTAGCTGTCATCAAAGTC GGCGCTGCGACTGAAACTGAGCTGAAAGAGCGTAAACTTCGCATCGAA GACGCCCTCAACTCAACTCGCGCAGCTGTTGAAGAAGGTATCGTATCCG GCGGTGGTACAGCGCTTGTCAACGTATACAACAAAGTCGCTGCAGTTGA AGCTGAAGGCGATGCGCAAACAGGTATCAACATCGTGCTTCGCGCGCTT GAAGAGCCGATCCGTCAAATCGCGCACAATGCAGGTCTTGAAGGATCTG TCATCGTTGAGCGCCTGAAAAACGAAAAAATCGGCGTAGGCTTCAACGC TGCA >gyrA GCGTTATCGTATCCCGGGCGCTTCCGGACGTGCGTGACGGTCTGAAGCC GGTTCACAGGCGGATTTTGTACGCAATGAATGATTTAGGCATGACCAGT GACAAACCATATAAAAAATCTGCCCGTATCGTCGGTGAAGTTATCGGTA AGTACCACCCGCACGGTGACTCAGCAGTTTACGAATCAATGGTCAGAAT GGCGCAGGATTTTAACTACCGCTACATGCTTGTTGACGGACACGGCAAC TTCGGTTCGGTTGACGGCGACTCAGCGGCCGCGATGCGTTACACAGAAG CGAGAATGTCAAAAATCGCGATGGAAATCCTCCGGGACATTACGAAAG ATACGATTGATTATCAAGATAACTATGACGGCGCAGAAAGAGAACCTGT CGTCATGCCTTCGAGATTTCCGAATCTGCTCGTAAACGGAGCTGCCGGT ATTGCGGTCGGAATGGCGACCAATATTCCTCCGCATCAGCTTGGGGAAG TCATTGAAGGCGTGCTTGCCGTAAGTGAGAATCCTGAGATTACAAACCA GGAGCTGATGGAATACATCCCGGGCCCGGATTTTCCGACTGCAGGTCAG ATTTTGGGCCGGAGCGGCATCCGCAAGGCATATGAATCCGGACGGGGAT CCATTACGATCCGGGCTAAGGCTGAAATCGAAGAGACATCATCGGGAA AAGAAAGAATTATTGTCACAGAACTTCCTTATCAGGTGAACAAAGCGAG ATTAATTGAAAAAATCGCAGATCTTGTCCGGGATAAAAAAATCGAAGG AATTACCGATCTGCGTGACGAATCCGACCGTAACGGAATGAGAATCGTC ATTGAGATCCGCCGTGACGCCAATGCTCACGTCATTTTGAATAACCTGT ACAAACAAACAGCCCTGCAGACGTCTTTCGGAATCAACCTGCTGGCGCT > polC GATATGGGATTTTTAAATGTGGCGTACAAGCGTCTTTTGAAAACGGAAA AAGCGAAAAATCCGGTCATTGATACACTGGAACTCGCGCGTTTCCTGTA TCCTGAGTTTAAAAATCACCGCTTAAATACGCTATGTAAGAAGTTTGAT ATCGAATTAACCCAGCATCACCGAGCGGTTTTTGACGCTGAAGCAACGG GCTACCTGCTGTTGAAAATGCTCAAAGATGCCGCTGAAAAAGACATTTT TTATCATGATCAGCTGAATGAGAATATGGGACAATCCAATGCTTATCAA AGATCAAGGCCTTATCACGCTACATTGCTTGCCGTGAATGAGACCGGCC TTAAAAATCTGTTTAAGCTCGTGTCCATTTCTCATATTCAATATTTCTAC AGAGTGCCGCGCATTCCGAGGTCGCAGCTTAATAAATACAGAGAAGGTC TGTTAATCGGCTCTGCCTGTGACAGGGGAGAGGTCTTTGAAGGCATGAT GCAAAAATCTCCTGAAGAGGTTGAAGATATCGCATCCTTCTATGATTAT CTTGAAGTGCAGCCGCCGGAAGTATACAGACACCTTCTGCAGCTTGAGC TCGTCCGGGATGAAAAAGCGCTGAAAGAAATCATCGCCAACATTACGA AGCTCGGAGAAAAATTGAATAAGCCGGTCGTGGCTACGGGAAATGTCC ACTATTTAAACGATGAGGATAAAATTTACCGGAAGATCTTAATATCTTC CCAAGGCGGCGCCAACCCGTTTAACAGACACGAACTGCCTAAA >purH AAAACTTCTTCAGGAAAACGGTGTGGATGTCATCGGCATTTCAGAAGTG ACCGGATTTCCTGAAATTATGGACGGACGGTTAAAAACCCTCCATCCTA ATATTCACGGCGGCCTGCTTGCCGTAAGAGACAATGAAGAGCATATGGC GCAGATCAATGAGCACGGCATTGCACCGATTGACCTTGTGGTTGTCAAC CTTTATCCGTTTAAAGAAACGATTTCAAAAGAAGACGTAACATACGATG AAGCGATAGAAAACATTGATATCGGCGGTCCCGGCATGCTGCGCGCCGC CTCGAAAAACCATCAGGATGTGACGGTCATCACAGATCCGGCCGATTAC AGCTCCGTGCTCAATGAGATTAAAGAACACGGCGGCGTTTCTCTTAAAA GAAAACGCGAGCTTGCGGCCAAAGTATTCCGCCATACCGCGGCATACGA CGCATTAATCGCTGATTACTTAACACGCGAGGCCGGTGAGAAAGACCCT GAGCAATTCACCGTTACATTTGAGAAAAAACAATCGCTCCGCTACGGTG AAAACCCTCACCAAGAGGCGGTTTTCTACCAAAGCGCACTTCCCGTCTC CGGTTCCATCGCGGCGGCAAAACAGCTTCACGGCAAAGAGCTTTCTTAC AACAACATTAAGGACGCAGATGCGGCTGTTCAAATCGTCCGGGAATTTA CAGAACCCGCAGCTGTCGCCGTTAAACATATGAACCCGTGCGGAGTCGG TACGGGAGCTTCAATTGAGGAAGCATTCAATAAAGCGTATGAAGCTGAT AAAACCTCCATTTTCGGCGGCATCATCGCGCTGAACCGTGAAGTTGATC AGGCAACGGCTGAAGCCCTTCACGGCATTCTTTTAGAAATCA > rpoB AAAGATGATGTATACACATCTATTCACATTGAAGAATATGAATCAGAAG CACGTGATACAAAGCTTGGGCCTGAAGAGATCACCCGCGATATTCCAAA CGTAGGGGAAGACGCGCTTCGCAATCTTGATGACCGCGGAATTATCCGT ATCGGTGCGGAAGTCAACGACGGAGACCTTCTCGTAGGTAAAGTAACGC CTAAAGGTGTAACTGAGCTTACGGCTGAAGAACGCCTTCTGCATGCGAT CTTTGGAGAAAAAGCGCGTGAAGTCCGTGATACTTCTCTCCGTGTGCCT CACGGCGGCGGCGGAATTATCCACGACGTAAAAGTCTTCAACCGTGAAG ACGGCGACGAACTTCCTCCGGGAGTGAACCAGCTTGTACGCGTATATAT CGTTCAGAAACGTAAGATTTCTGAAGGTGATAAAATGGCCGGACGTCAC GGAAACAAAGGGGTTATCTCGAAGATTCTTCCTGAAGAAGATATGCCTT ACCTTCCTGACGGCACGCCGATCGATATCATGCTTAACCCGCTGGGTGT ACCATCACGTATGAATATCGGTCAGGTATTAGAACTTCACATGGGTATG GCTGCCCGCTACCTCGGCATTCACATCGCGTCACCTGTATTTGACGGCGC GCGTGAAGAAGATGTGTGGGAAACACTTGAAGAAGCAGGCATGTCAAG AGACGCTAAAACAGTTCTTTATGACGGCCGTACGGGAGAACCGTTTGAC AACCGTGTATCAGTCGGAATCATGTACATGATCAAACTGGCGCACATGG TTGATGATAAACTTCATGCCCGTTCTACAGGTCCTTACTCACTTGTTACG CAGCAGCCTCTCGGCGGTAAAGCCCAATTCGGCGGACAGCGTTTCGGTG AGATGGAGGTTTGGGCGCTTGAAGCTTACGGCGCAGCTTACACGCTTCA AGAAATCCTGACTGTGAAGTCCGATGACGTGG Trình tự gen phytase chủng SP1901 GTTATACGCGGCAGCGGATTAGATGCTCACGTGCGGTGCGGTTTCTTCC CAGGCCAAGCATAAACTGTCTGATCCTTATCATTTTACAGTGAATGCGG CGGCGGAAACGGAGCCGGTTGATACAGCCGGTGATGCAGCTGATGATC CTGCGATTTGGCTGGACCCCAAGAATCCTCAGAACAGCAAATTGATCAC AACCAATAAAAAATCAGGCTTAGTCGTGTACAGCCTTGAGGGAAAGAT ACTTCATTCCTATCCTACCGGGAAGCTGAACAATGTTGATATCCGCTATG ATTTTCCGTTGAACGGAAAAAAAGTCGATATTGCGGCGGCATCCAATCG GTCTGAAGGAAAGAATACCATTGAGATTTACGCCATTGACGGGAAAAA CGGCACATTACAAAGCATTACGGACCCAGACCGCCCGATTGCGTCAGCA ATTGATGAAGTATACGGTTTCAGCTTGTACCACAGTCAAAAAACAGGAA AATATTACGCGATGGTGACAGGGAAAGAAGGCGAATTTGAACAATACG AATTAAATGCGGATAAAAATGGATACATATCCGGCAAAAAGGTAAGGG CGTTTAAAATGAATTCTCAGACAGAAGGGATGGCAGCAGATGACGAAT ACGGCAGTCTTTATATCGCAGAAGAAGATGAGGCCATCTGGAAGTTCAG CGCTGAGCCGGACGGCGGCAGTAACGGAACGGTGATCGATCGTGCCGA CGGCAGGCATTTAACCCCTGATATTGAAGGACTGACGATTTACTACGCT GCTGACGGGAAAGGTTATTTGCTTGCATCAAGCCAGGGTAACAGCAGCT ACGCGATTTATGAAAGACAGGGACAGAACAAATATGTTGCGGACTTTCA GATAACAGACGGACCTGAAACAGACGGCACAAGCGATACAGACGGGAA TTGACGTTCTTGGGTTTCGGGCTGGGGCCTGAATATCCGTTCGGGCCTTT TTGTCGCACAGGGACGGAGAAAATATTAGATCACGGGCCAAAAGGCCA ATCAAAATTTTTAAAATGGTGGCCATGGGGAAAGAATCCCCTGAAAAAA TCCGGCTTTCACCCGCAGGTCAATAAACAGGTTGACCCGGAAACTGCGC AAGGACCGAGAGGGGAGACTAATTATAATTATAATTATATATATAAAAA AAAAAA ... loài vi sinh vật, nhu cầu tầm quan trọng sản phẩm phytase thương mại, tiến hành đề tài nghiên cứu ? ?Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh enzyme phytase? ?? nhằm tìm kiếm lồi vi sinh vật có khả sinh enzyme. .. ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN *************** Phan Thị Thu Mai PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT SINH ENZYME PHYTASE Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG... phytase vi sinh vật bền với pH phytase từ thực vật, phytase thực vật giảm đáng kể hoạt tính khoảng 4-7,5 phytase vi sinh vật tương đối bền khoảng pH từ 3-8 [64, 65, 149] Ngoài khả chịu axit phytase