Xây dựng và đánh giá hệ thống chủng giống cho nghiên cứu phát triển vắc xin sốt xuất huyết dengue

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hoàng Anh Đức XÂY DỰNG VÀ ĐÁNH GIÁ HỆ THỐNG CHỦNG GIỐNG CHO NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VẮCXIN SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đỗ Tuấn Đạt Hà Nội - 2014 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Tuấn Đạt, người tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tơi cơng việc suốt q trình học tập, thực nghiên cứu luận văn thạc sĩ Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy giáo, cô giáo Khoa Sinh học, đặc biệt thầy cô giáo môn Vi sinh vật học thuộc trường ĐH Khoa học Tự nhiên, tận tình giảng dạy, hướng dẫn tơi suốt thời gian học tập Trường Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới anh chị bạn đồng nghiệp giúp đỡ tôi, chia sẻ kinh nghiệm kiến thức suốt thời gian tơi thực nghiên cứu phịng Cơng nghệ Cao, Công ty TNHH MTV Vắcxin Sinh phẩm số Cuối cùng, tơi muốn cảm ơn gia đình, bạn bè ln bên khích lệ, động viên tơi suốt thời gian vừa qua Học Viên Hồng Anh Đức MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC BẢNG BIỂU BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 11 1.1 Đặc điểm dịch tễ học bệnh sốt xuất huyết dengue 11 1.1.1 Tình hình mắc sốt xuất huyết dengue giới 11 1.1.2 Tình hình mắc sốt xuất huyết dengue Việt Nam 14 1.2 Virút dengue – tác nhân gây bệnh 16 1.2.1 Đặc điểm phân loại 16 1.2.2 Cấu trúc phân tử thành phần chức 17 1.2.3 Quá trình lắp ráp trưởng thành virút 18 1.2.4 Sự chép ARN virút 21 1.3 Nguồn bệnh đường lây truyền bệnh sốt dengue 22 1.3.1 Nguồn bệnh 22 1.3.2 Vector truyền bệnh 22 1.3.3 Sự lây truyền virút dengue 23 1.3.4 Các biện pháp phòng ngừa dịch bệnh 24 1.4 Cơ chế bệnh sinh 1.4.1 Cơ ch 1.4.2 Lâm 1.4.2 Các y 1.4.3 Miễn 1.5 Vắcxin phòng chống dengue 1.5.1 Vắcx 1.5.2 Vắcx 1.5.3 Vắcx 1.5.4 Vắcx 1.5.5 Tình 1.5.6 Nghi 1.5.7 Các t 1.6 Đặc điểm chủng dengue viện sức triển 37 1.6.1 Đặc đ 1.6.2 Đặc đ 1.6.3 Đặc đ 1.6.4 Đặc đ 1.7 Xây dựng ngân hàng chủng gốc giốn CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 2.1.1 Tế bà 2.1.2 Các chủng virút dengue tái tổ hợp 46 2.1.3 Môi trường nuôi cấy dung dịch nghiên cứu 46 2.1.4 Các hóa chất sinh phẩm 47 2.1.5 Dụng cụ trang thiết bị 47 2.2 Phương pháp 48 2.2.1 Phương pháp cấy chuyển tế bào Vero từ điều kiện bảo quản nhân số lượng tế bào Vero chai nuôi lớp 48 2.2.2 Phương pháp gây nhiễm nuôi cấy virút dengue tế bào 50 2.2.3 Phương pháp thu hoạch virút dengue sau gây nhiễm .51 2.2.4 Phương pháp chuẩn độ virút dengue tạo đám hoại tử .52 2.2.5 Phương pháp nhuộm miễn dịch đám hoại tử 53 2.2.6 Phương pháp thử vô khuẩn 54 2.2.7 Phương pháp xác định trình tự genome virút dengue 55 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 59 3.1 Xây dựng quy trình gây nhiễm ni cấy chủng dengue chai nuôi cấy lớp 59 3.1.1 Liều gây nhiễm virút dengue tế bào Vero 59 3.1.2 Nhiệt độ môi trường nuôi cấy virút 63 3.1.3 Quy trình sản xuất chủng virút dengue gốc giống .65 3.2 Sản xuất chủng virút gốc giống 67 3.2.1 Gây nhiễm chủng virút dengue tế bào Vero 67 3.2.2 Thu hoạch chủng virút dengue tế bào Vero 68 3.3 Đánh giá chất lượng chủng gốc giống 68 3.3.1 Đánh giá hiệu giá virút 68 3.3.2 Đánh giá gen chủng gốc giống virút dengue 71 3.3.3 Đánh giá tính ổn định hiệu giá virút qua đời ni cấy .73 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 PHỤ LỤC 83 So sánh trình tự chủng rDEN1∆30 83 So sánh trình tự chủng rDEN2/4∆30(ME) 85 So sánh trình tự chủng rDEN3∆30/31 87 So sánh trình tự chủng rDEN3-3’D4∆30 89 So sánh trình tự chủng rDEN4∆30 91 So sánh trình tự chủng rDEN4∆30-200,201 93 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình Các nước/khu vực có nguy lây nhiễm virút dengue năm 2008 [46] 11 Hình Số ca nhiễm sốt dengue sốt xuất huyết dengue trung bình năm Tổ chức y tế giới báo cáo, số nước có ca bệnh báo cáo, 1955-2007 [46] 13 Hình Tình hình dịch sốt dengue Việt Nam 2002 – 2011 [3] 15 Hình Cấu trúc hạt virút dengue dạng khác protein E [36]: 20 Hình Cấu trúc genome virút dengue [36]: 21 Hình Sự lây truyền virút dengue [43] 23 Hình Mơ hình miễn dịch tăng cường nhiễm trùng bệnh dengue [43] 27 Hình Sơ đồ gen chủng dengue tái tổ hợp lựa chọn để làm vắcxin sống giảm độc lực [12] 42 Hình Tế bào Vero sau nuôi cấy 50 Hình 10 Hiệu giá virút dengue thu liều gây nhiễm khác 60 Hình 12 Hình ảnh đám hoại tử tế bào Vero sau nhuộm miễn dịch 70 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Các mức độ lâm sàng bệnh virút dengue gây 28 Bảng Tóm tắt vắcxin dengue dự tuyển phát triển giới 35 Bảng Hiệu giá virút dengue nuôi cấy nhiệt độ khác 64 Bảng Hiệu giá virút rDEN3 nuôi môi trường khác 65 Bảng Kết thu hoạch chủng gốc giống 70 Bảng Tóm tắt kết giải mã trình tự gen chủng gốc giống .72 Bảng Kết chuẩn độ hiệu giá virút dengue qua đời ni cấy 75 BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Kí hiệu viết tắt ADN ARN cDNA DEN HCSD HVĐT KN KT MOI 10 NIAID 11 NIH 12 PCR 13 PFU 14 SD 15 SXH 16 SXHD 17 TCYTTG 18 UTR 19 VABIOTECH MỞ ĐẦU Sốt xuất huyết dengue bệnh virút lây truyền qua muỗi phổ biến người, gây ảnh hưởng chủ yếu vùng nhiệt đới cận nhiệt đới giới Phạm vi phân bố địa lý bệnh tăng nhanh chóng vịng 50 năm qua tổ chức Y tế giới (TCYTTG) ước tính virút dengue nguyên nhân gây khoảng 50-100 triệu ca năm toàn giới với khoảng phần dân số tồn giới có nguy mắc bệnh Sốt xuất huyết dengue (SXHD) hội chứng sốc dengue (HCSD) nguyên nhân chủ yếu khiến trẻ em nhập viện tử vong nước Đông Nam Á [10] Đây hậu việc phơi nhiễm với muỗi tăng lên trình thị hóa, du lịch, thay đổi khí hậu thiếu kiểm soát vector truyền bệnh [10] Trước năm 1970, có nước Đơng Nam Á báo cáo sốt xuất huyết dengue Tuy nhiên, có 60 nước đưa tài liệu bệnh Và virút dengue loài đặc hữu 100 nước, bao gồm hầu Đông Nam Á, Nam Trung Mỹ, Caribe vùng Nam Thái Bình Dương Sự lan truyền nhanh chóng dịch sốt dengue đòi hỏi tổ chức, quốc gia tăng cường nỗ lực kiểm sốt, phịng điều trị bệnh [46] Nằm vùng Đông Nam Á, Việt Nam nước lưu hành dịch lớn giới, với hàng triệu người có nguy mắc bệnh Hằng năm Việt Nam phải đầu từ nhiều chi phí cho việc nghiên cứu, kiểm sốt phịng chống dịch virút dengue gây Bên cạnh việc tăng cường ý thức giáo dục cộng đồng, khống chế vector truyền bệnh muỗi biện pháp phun hóa chất, diệt ổ bọ gậy sử dụng phổ biến nhiều hạn chế Kiểm soát dịch bệnh qua vector gây tốn khơng triệt để Hiện nay, tiêm vắcxin phịng bệnh dengue coi biện pháp triệt để giúp cho việc phòng chống dịch bệnh người cách chủ động khống chế bùng phát dịch bệnh toàn cộng đồng 30 Malavige, Fernando, et al (2004), “Review: Dengue viral infections”, Postgraduate Medical Journal, 80, pp 588–601 31 McArthur J., Durbin A.P., Marron J.A., et al (2008), “Phase I clinical evaluation of rDEN4∆30-200-201: a live attenuated dengue vaccine candidate designed for decreased hepatotoxicity”, American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 79(5), pp 678-684 32 Messer WB (2003), “Emergence and global spread of a dengue serotype 3, subtype III virus”, Emerging Infectious Diseases, 9(7), pp 800-809 33 NIH (2010), NIH news: Human clinical trial of NIH-developed dengue vaccine begins Bethesda MD, USA 34 Peiris JSM., Porterfield JS (1982), “Antibody-dependent enhancement: its antigenic specificity in relation to Togaviridae”, Journal of General Virology, 58, pp 291-296 35 Phillpotts RJ, Stephenson JR, Porterfield JS (1985), “Antibody-dependent enhancement of tick-borne encephalitis virus infectivity”, Journal of General Virology, 66 (8), pp 1831-1837 36 Rushika Perera and Richard J Kuhn (2008), “Structural Proteomics of Dengue Virus”, Current Opinion in Microbiology, 11(4), pp 369–377 37 Sabin, A.B (1952), “Research on dengue during World War II”, American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 1, pp 30-50 38 Senior K (2009) “Dengue vaccine efficacy trials in progress”, Lancet, 9, pp 662-663 39 Siler JF., Hall MW., and Hitchens AP (1926), “Dengue: its history, epidemiology, mechanism of transmission, etiology, clinical manifestations, immunity, and prevention”, Philippine Journal of Science, 29, pp 1-302 81 40 Suman M Paranjape and Eva Harris (2010), “Control of Dengue Virus Translation and Replication”, Current Topics in Microbiology and Immunology, 338, pp 15-34 41 Webster D.P., Farrar J., Rowland-Janes S (2009), “Progress towards a dengue vaccine”, Lancet (2009), 9, pp 678-687 42 Whitehead SS, Falgout B, Hanley KA, Blaney Jr JE, Markoff L, Murphy BR (2003), “A live, attenuated dengue virus type vaccine candidate with a 30nucleotide deletion in the 3’untranslated region is highly attenuated and immunogenic in monkeys”, Journal of Virology, 77, pp.1653–1657 43 Whitehead S.S., Blaney J.E., Durbin A.P., Murphy B.R (2007), “Prospect for dengue virus vaccine”, Nature Reviews Microbiology, 5, pp 518-528 44 WHO (1997), Dengue haemorrhagic fever: diagnosis, treatment prevention and control, Geneva 45 WHO (2006), Guidelines for the production and quality control of candidate tetravalent dengue virus vaccines (live) WHO technical report series, 932, pp 43-72 46 WHO (2009), Dengue guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control, Geneva 82 PHỤ LỤC So sánh trình tự chủng rDEN1∆30 Kết so sánh trình tự chủng gốc giống rRDEN1∆30 với chủng nhận từ NIH Độ tương đồng trình tự 100% Score 19684 bits(10659) Query Sbjct 20 20 CCGACAAG Query Sbjct 80 80 GAGAGCAG Query Sbjct 140 140 CTGAAACG Query Sbjct 200 200 GGATTGCT Query Sbjct 260 260 TTTCTAGC Query Sbjct 320 320 GGAGCGAT Query Sbjct 380 380 AACAGGAG Query Sbjct 440 440 CATCTGAC Query Sbjct 500 500 TCACTTTT Query Sbjct 560 560 GGAGAGTT Query Sbjct 620 620 GATGACGT Query Sbjct 680 680 CAAACTGG Query Sbjct 740 740 GGTCTAGA Query Sbjct 800 800 AAAGTGGA Query Sbjct 860 860 CATGCCAT Query Sbjct 920 920 ACTCCATC 83 Cây phân loại chủng rDEN1∆30 84 So sánh trình tự chủng rDEN2/4∆30(ME) Kết so sánh trình tự chủng gốc giống rRDEN2/4∆30(ME) với chủng nhận từ NIH Độ tương đồng trình tự 99% Vị trí sai khác 1835, C thay T Score 19488 bits(10553) Query Sbjct 182 182 Query Sbjct 188 188 Query Sbjct 194 194 Query Sbjct 200 200 Query Sbjct 206 206 Query Sbjct 212 212 Query Sbjct 218 218 Query Sbjct 224 224 Query Sbjct 230 230 Query Sbjct 236 236 Query Sbjct 242 242 Query Sbjct 248 248 85 Cây phân loại chủng rDEN2/4∆30(ME) 86 So sánh trình tự chủng rDEN3∆30/31 Kết so sánh trình tự chủng gốc giống rRDEN3∆30/31 với chủng nhận từ NIH Độ tương đồng trình tự 100% Score 19307 bits(10455) Query Sbjct 127 127 Query Sbjct 187 187 Query Sbjct 247 247 Query Sbjct 307 307 Query Sbjct 367 367 Query Sbjct 427 427 Query Sbjct 487 487 Query Sbjct 547 547 Query Sbjct 607 607 Query Sbjct 667 667 Query Sbjct 727 727 Query Sbjct 787 787 Query Sbjct 847 847 Query Sbjct 907 907 Query Sbjct 967 967 Query Sbjct 1027 1027 Query Sbjct 1087 1087 87 Cây phân loại chủng rDEN3∆30/31 88 So sánh trình tự chủng rDEN3-3’D4∆30 Kết so sánh trình tự chủng gốc giống rRDEN3-3’D4∆30 với chủng nhận từ NIH Độ tương đồng trình tự 100% Score 19612 bits(10620) Query Sbjct 16 16 Query Sbjct 76 76 Query Sbjct 136 136 Query Sbjct 196 196 Query Sbjct 256 256 Query Sbjct 316 316 Query Sbjct 376 376 Query Sbjct 436 436 Query Sbjct 496 496 Query Sbjct 556 556 Query Sbjct 616 616 Query Sbjct 676 676 Query Sbjct 736 736 Query Sbjct 796 796 Query Sbjct 856 856 Query Sbjct 916 916 Query Sbjct 976 976 89 Cây phân loại chủng rDEN3-3’D4∆30 90 So sánh trình tự chủng rDEN4∆30 Kết so sánh trình tự chủng gốc giống rRDEN4∆30 với chủng nhận từ NIH Độ tương đồng trình tự 100% Score 19505 bits(10562) Query Sbjct 18 17 Query Sbjct 78 77 Query Sbjct 138 137 Query Sbjct 198 197 Query Sbjct 258 257 Query Sbjct 318 317 Query Sbjct 378 377 Query Sbjct 438 437 Query Sbjct 498 497 Query Sbjct 558 557 Query Sbjct 618 617 Query Sbjct 678 677 Query Sbjct 738 737 Query Sbjct 798 797 Query Sbjct 858 857 Query Sbjct 918 917 Query Sbjct 978 977 Query Sbjct 1038 1037 91 Cây phân loại chủng rDEN4∆30 92 So sánh trình tự chủng rDEN4∆30-200,201 Kết so sánh trình tự chủng gốc giống rRDEN4∆30-200,201 với chủng nhận từ NIH Độ tương đồng trình tự 99% Vị trí sai khác 7141, C thay T Score Expect Identities Gaps Strand 19501 bits(10560) Query Sbjct 7037 7037 CGTCC Query 7097 GTTAG 7097 Sbjct Query Sbjct 7157 7157 GCTTT Query Sbjct 7217 7217 CCAGA Query Sbjct 7277 7277 AGATC Query Sbjct 7337 7337 ACTAG Query Sbjct 7397 7397 CTTGA Query Sbjct 7457 7457 GAACA Query Sbjct 7517 7517 TGGAC Query Sbjct 7577 7577 AGGAG Query Sbjct 7637 7637 TGAAG Query Sbjct 7697 7697 GAAAG Query Sbjct 7757 7757 TGTTG Query Sbjct 7817 7817 AGGAT Query Sbjct 7877 7877 AGGAG 93 Cây phân loại chủng rDEN4∆30-200,201 94 ... triển để sớm có vắcxin phục vụ cộng đồng Xây dựng hệ thống chủng giống virút dự tuyển vắcxin khâu quan trọng trình nghiên cứu phát triển vắcxin Các chủng tiếp nhận tạo công nghệ di truyền ngược... lực phát triển vắcxin dengue tập trung chủ yếu vào loại vắcxin sống giảm độc lực, vắcxin bất hoạt vắcxin tiểu đơn vị Các phương pháp tiếp cận vắcxin dengue khác vắcxin vector ADN, phát triển từ... nghệ sản xuất vắcxin Cho đến nay, Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu cơng bố liên quan đến việc nghiên cứu vắcxin dengue Là công ty hàng đầu lĩnh vực sản xuất vắcxin, Công ty TNHH MTV Vắcxin