Thí nghiệm được tiến hành nhằm xác định tính kháng khuẩn của dịch chiết bạch hoa xà (BHX) với hai loài vi khuẩn Aeromonas hydrophila và Edwardsiella ictaluri ở các mật độ 103 , 106 , 109 (CFU/mL). Bạch hoa xà được chiết xuất bằng các phương pháp (i) đun trong nước cất ở 98 oC, (ii) ngâm trong cồn 70% trong 3 ngày và (iii) ngâm trong cồn 70% trong 6 ngày.
AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol 25 (2), 60 – 67 XÁC ĐỊNH TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT BẠCH HOA XÀ (Plumbago zeylanica L.) ĐỐI VỚI VI KHUẨN Aeromonas hydrophila Nguyễn Lê Hoàng Yến1 Trường Đại học Tây Đô Thông tin chung: Ngày nhận bài: 11/01/2019 Ngày nhận kết bình duyệt: 13/05/2019 Ngày chấp nhận đăng: 04/2020 Title: Determine the antibacterial ability of Plumbago zaylanica L extract against Aeromonas hydrophila and Edwardsiella ictaluri Keywords: Aeromonas hydrophila, antibacteria, Edwardsiella ictaluri, Plumbago extract Từ khóa: Aeromonas hydrophila, dịch chiết Bạch hoa xà, Edwardsiella ictaluri, kháng khuẩn ABSTRACT This experiment was conducted to determine the antibacterial ability of Plumbago zeylanica extract against Aeromona hydrophila and Edwardsiella ictaluri at density of 103 , 106 , 109 CFU/ ml Plumbago zeylanica was extracted by the methods: (i) boiled in distilled water at 98 oC; (ii) soaked in ethanol 70 % for days; (iii) soaked in ethanol 70 % for days The results shows that, Plumbago zeylanica extracts of three methods of extracting were high resistance (the width of the antibacterial ring from 10 to 22,7 mm) However, the antibacterial ability of Plumbago extract by heating method in distilled water is the lowest, the ability of Plumbago extract by soaking in 70 % for days with ratio 3:1 exposed the best results in against E.ictaluri at the density of 109 CFU/ml (X = 22,7 mm) This result also shows that there are positive relationship between the antibacterial ability of Plumbago extract and the bacterial density TĨM TẮT Thí nghiệm tiến hành nhằm xác định tính kháng khuẩn dịch chiết bạch hoa xà (BHX) với hai loài vi khuẩn Aeromonas hydrophila Edwardsiella ictaluri mật độ 103, 106, 109 (CFU/mL) Bạch hoa xà chiết xuất phương pháp (i) đun nước cất 98 oC, (ii) ngâm cồn 70% ngày (iii) ngâm cồn 70% ngày Kết cho thấy, dịch chiết BHX từ ba phương pháp chiết xuất có tính kháng mạnh (vịng kháng khuẩn từ 10 – 22 mm) A hyrophila E.ictaluri, nhiên tính kháng dịch chiết BHX chiết xuất phương pháp gia nhiệt 98 oC, nước cất thấp Tính kháng khuẩn dịch chiết BHX chiết xuất phương pháp ngâm ngày cồn 70% với tỉ lệ BHX: dung môi (cồn) 3:1 cho kết vòng kháng khuẩn E ictaluri cao (X = 22,7 mm) mật độ vi khuẩn 109 CFU/ml kết cho thấy tính kháng khuẩn dịch chiết BHX mật độ vi khuẩn có tương quan theo hướng tích cực giai đoạn giao mùa, điều kiện thời tiết, nhiệt độ thay đổi đột ngột vào mùa mưa, mùa nước đổ Bệnh gan thận mủ vi khuẩn GIỚI THIỆU Trong nuôi trồng thủy sản, dịch bệnh nghề nuôi cá xảy quanh năm cao nặng 60 AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol 25 (2), 60 – 67 Edwardsiella ictaluri gây phổ biến, ảnh hưởng lớn đến giai đoạn cá hương, cá giống, cá ni thương phẩm với tỷ lệ chết cao, đến 90%, gây thiệt hại lớn cho người nuôi (Từ Thanh Dung ctv, 2004) Bên cạnh đó, bệnh nhiễm trùng máu (bệnh đốm đỏ, xuất huyết…) nhóm vi khuẩn Aeromonas sp gây thiệt hại nghiêm trọng không kém, thường gặp động vật thuỷ sản nước như: trắm cỏ, basa, chép, tai tượng, Mặt khác, chúng cịn gây bệnh ba ba, cá sấu, bệnh đỏ chân ếch, đốm nâu tôm xanh; tỉ lệ tử vong thường từ 30 - 70% (Bùi Quang Tề et al., (2004); Dung et al., (2008)) Kháng sinh sử dụng để phòng trị bệnh đưa đến tượng kháng thuốc Nghiêm trọng dư lượng kháng sinh gây bệnh cho người rào cản cho doanh nghiệp lĩnh vực xuất sản phẩm thủy sản Trước tình hình đó, khuynh hướng chung ngành thủy sản Việt Nam giới khuyến khích dùng chế phẩm sinh học, vi sinh thuốc phòng trị bệnh thảo dược thay dần kháng sinh q trình ni trồng Chế phẩm sinh học ứng dụng ương nuôi số đối tượng thủy sản đạt thành công, triển vọng việc cải thiện môi trường nước, hạn chế vi khuẩn gây bệnh, giúp nâng cao tỉ lệ sống đối tượng ni Bên cạnh đó, với biên độ an tồn lớn, ảnh hưởng tới mơi trường sinh thái môi trường nuôi; đồng thời không ảnh hưởng tới sức khỏe người Xu hướng sử dụng thảo dược việc xử lý bệnh động vật thủy sản người nuôi ứng dụng rộng rãi số hoạt chất nhiều loại thảo dược hoạt động chất kháng sinh, chất chống oxy hóa sử dụng rộng rãi sống nói chung thủy sản nói riêng Đã có nhiều loại cỏ có hoạt tính kháng sinh nghiên cứu sử dụng phòng trị số bệnh động vật thủy sản cỏ mực, bàng, chó đẻ, xoan, Tuy nhiên bạch hoa xà loài mới, chưa nghiên cứu ứng dụng nhiều thủy sản Plumbagin (2-Methoxy-5hydroxy-1-4-Napthoquinone), napthoquinone tự nhiên có nhiều hoạt tính dược lý khác kháng sinh (Didry et al., 1994) chứa bạch hoa xà Nó có tính sát trùng, kích thích tiêu hóa Vì vậy, việc xác định tính kháng khuẩn thảo dược thủy sản phương pháp an toàn PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu thí nghiệm Chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập từ bệnh phẩm cá tra Bạch hoa xà (Plumbago zaylanica) xác định thơng qua hình dạng bên ngồi dựa miêu tả Đỗ Tất Lợi (2004) Lá phận BHX sử dụng thí nghiệm thu hái vườn thảo dược, Khoa Dược Điều dưỡng – Trường Đại học Tây Đơ Hóa chất chính: Cồn 70 %, BHIA (Brain Heart Infusion Agar), NA (Nutrien Agar), NB (Nutrien Broth) 2.2 Phương pháp chiết xuất thảo dược Lá BHX thu hái vào buổi sáng, rửa sạch, để sử dụng chiết xuất dịch chiết dung môi chiết xuất nước cất, cồn 70% với tỉ lệ BHX: Dung môi 1:1, 2:1, 3:1 BHX chiết xuất phương pháp sau: Phương pháp 1: Gia nhiệt bạch hoa xà với nước cất (DW - Distilled Water) Lá BHX xay nhuyễn nước cất (ml) với thể tích tương ứng tỉ lệ Hỗn hợp gia nhiệt máy khuấy từ nhiệt độ 98 oC giờ, để nguội Hỗn hợp sau lọc qua giấy lọc dịch chiết với tỉ lệ lá: DW 1:1, 2:1, 3:1 (Trương Thị Đẹp, 2005) Phương pháp 2: Bạch hoa xà ngâm ngày cồn 70% Lá BHX xay nhuyễn cho vào bình thủy tinh chứa cồn 70% với thể tích tương ứng tỉ lệ Bịt kín miệng bình để nhiệt độ phòng thời gian ngày Thêm nước cất cho đạt thể tích ban đầu lọc qua giấy lọc thu dịch chiết với 61 AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol 25 (2), 60 – 67 tỷ lệ thảo dược:cồn 1:1, 2:1, 3:1 Dịch chiết đuổi cồn cách khuấy nhiệt độ 40oC (Bộ Y tế, 2008) chứa cồn 70% với thể tích tương ứng tỉ lệ Bịt kín miệng bình để nhiệt độ phịng thời gian ngày Thêm nước cất cho đạt thể tích ban đầu lọc qua giấy lọc thu dịch chiết với tỷ lệ thảo dược:cồn 1:1, 2:1, 3:1 Dịch chiết đuổi cồn cách khuấy nhiệt độ 40 oC (Bộ Y tế, 2008) Phương pháp 3: Bạch hoa xà ngâm ngày cồn 70% Lá BHX xay nhuyễn cho vào bình thủy tinh Lá Bạch hoa xà Xay nhuyễn nước cất (DW) Tỉ lệ 1:1, 2:1, 3:1 (BHX) Giã nhuyễn Hỗn hợp Lá BHX – cồn Tỉ lệ 1:1, 2:1, 3:1 Hỗn hợp Lá BHX - DW Hãm nhiệt độ 98oC , Vắt kiệt hỗn hợp Ngâm thời gian quy định Vắt kiệt hỗn hợp Dịch chiết Dịch chiết ban đầu Đuổi cồn Dịch chiết Hình Sơ đồ tổng quát phương pháp chiết xuất dịch chiết từ Bạch hoa xà 2.3 Phương pháp xác định tính kháng khuẩn dịch chiết Bạch hoa xà pháp đục giếng Bốn giếng có đường kính 6mm đục mặt thạch đĩa petri tán vi khuẩn, giếng để chứa dịch chiết thảo dược với thể tích cho vào giếng 50 l; giếng để chứa dung môi đối chứng nước cất hay cồn 70% (đã đuổi hết cồn) Đường kính vịng kháng khuẩn xác định thước ô li sau ủ đĩa nhiệt độ 32 oC thời gian 24 (Jan Hudzicki, 2009) Phương pháp khuếch tán thạch (dựa vào vịng kháng khuẩn) sử dụng xác định tính kháng khuẩn dịch chiết BHX vi khuẩn Aeromonas hydrophila Edwardsiella ictaluri (Trương Công Quyền ctv, 1986) Vi khuẩn Aeromonas hydrophila Edwardsiella ictaluri phục hồi, tách rịng ni tăng sinh đạt mật độ 103,106 ,109 (cfu/ml) tiến hành thực thí nghiệm Mỗi mật độ vi khuẩn thực lần lặp lại tương ứng với phương pháp chiết xuất dịch chiết 2.4 Xác định vòng kháng khuẩn Khả kháng khuẩn dịch chiết ghi nhận qua vòng kháng khuẩn xuất xung quanh giếng đĩa thạch Vòng kháng khuẩn (X) đo thước kẻ li đánh giá tính kháng theo Jan Hudzicki, (2009) sau: Tính kháng khuẩn dịch chiết Bạch hoa xà vi khuẩn xác định phương 62 AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol 25 (2), 60 – 67 3.1.1 Khả kháng khuẩn dịch chiết chiết xuất phương pháp gia nhiệt X= 0: Không kháng X < 5: Kháng yếu Vòng kháng khuẩn dịch chiết Bạch hoa xà đạt (10,3 - 12,3 mm) vi khuẩn Aeromonas sp mật độ vi khuẩn 106 tốt so với mật độ vi khuẩn 103 109 CFU/ml tương ứng tỷ lệ dịch chiết, nhiên khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) Với tỷ lệ 3:1, mật độ vi khuẩn 109 CFU/ml, kết vòng kháng khuẩn A.hydrophila dịch chiết 12,3 mm khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05) so với kết vòng kháng khuẩn mật độ 103 106 CFU/mL 50,05) dịch chiết Bạch hoa xà vi khuẩn E.ictaluri thể tốt phương pháp ngâm BHX với cồn 70% ngày cho vòng kháng khuẩn cao Vòng kháng khuẩn dịch chiết Bạch hoa xà vi khuẩn E.ictaluri mật độ vi khuẩn 103, 106, 109 CFU/mL cho kết thấp tỷ lệ 1:1 (14,6 - 18,7 mm) cao tỷ lệ 3:1 (17,5 22,7 mm) Mật độ vi khuẩn tăng vịng kháng khuẩn lớn Cụ thể kết vòng kháng khuẩn đạt cao 22,7 mm với tỷ lệ dịch chiết 3:1 mật độ vi khuẩn 109 CFU/mL, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với vòng kháng khuẩn thấp mật độ vi khuẩn 103 CFU/mL (14,6 ± 0,4 mm) So với kết vòng kháng khuẩn A hydrophila, tác dụng kháng khuẩn 3.1.4 Ảnh hưởng phương pháp chiết xuất lên tính kháng khuẩn dịch chiết Đối với vi khuẩn Aeromonas hydrophila Vòng kháng khuẩn dịch chiết BHX dao động từ 10 – 19,8 mm, lớn 10 mm, tính kháng mạnh vi khuẩn Aeromonas (Theo Jan Hudzicki, 2009) Bạch hoa xà chiết xuất với tỉ 64 AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol 25 (2), 60 – 67 lệ 3:1 ln cho vịng kháng khuẩn từ 13,3 – 19,8 mm, lớn khác biệt có ý nghĩa thống kê (P0,05) Đối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Vòng kháng khuẩn dịch chiết BHX vi khuẩn E.ictaluri lớn so với vòng kháng vi khuẩn A.hydrophila, thấp đạt 9,9 mm dịch chiết chiết xuất phương pháp gia nhiệt với nước cất cao 22,7 mm BHX chiết xuất với tỉ lệ 3:1 cồn 70% ngày, tương ứng mật độ vi khuẩn 109 CFU/ml Dịch chiết chiết xuất phương pháp gia nhiệt nước cất ln cho kết vịng kháng khuẩn thấp khác biệt có ý nghĩa thống kê (P 0,05) Như vậy, BHX chiết xuất phương pháp ngâm cồn 70% từ – ngày cho kết kháng khuẩn A.hydrophila E ictaluri mạnh Mật độ vi khuẩn cao dịch chiết chiết xuất với tỉ lệ 3:1 cho vòng kháng lớn 65 AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol 25 (2), 60 – 67 A B C Hình 2a: Vịng kháng khuẩn E ictaluri, mật độ 109 CFU/mL A.BHX chiết xuất cồn 70% , ngâm ngày B.BHX chiết xuất cồn 70% , ngâm ngày D Hình 2b: Vịng kháng khuẩn A.hydrophila, mật độ 109 CFU/mL C.BHX chiết xuất cồn 70% , ngâm ngày D.BHX chiết xuất cồn 70% , ngâm ngày 3.2 Thảo luận Chủng vi khuẩn E ictaluri nhạy với thuốc kháng sinh Erythromycin thiocyanate với vòng kháng khuẩn dao động từ 20-25 mm cá bị bệnh gan thận mủ E ictaluri gây có cải thiện tình trạng, tỉ lệ chết thấp không sử dụng Erythromycin thiocyanate Aeromonas hydrophila Edwardsiella ictaluri vi khuẩn gây bệnh phổ biến cá, gây thiệt hại đáng kể kháng nhiều loại kháng sinh A.hydrophila gây bệnh đốm đỏ cá, tỉ lệ tử vong từ 30 – 70%, cá tra, cá basa giai đoạn giống lên đến 100% (Bùi Quang Tề, 2004) kháng mạnh nhiều kháng sinh mạnh Ampicillin, Tetracycline, Novobiocin, (Orozoval et al., 2008), kháng hoàn toàn với Cefalexin, Trimethoprim/Sunfamethoxazol (Quách Văn Cao Thi ctv., 2014) Vi khuẩn E ictaluri gây bệnh gan thận mũ cá da trơn, tỉ lệ tử vong thường 60 – 70%, kháng nhiều kháng sinh Streptomycin (83%), Oxytetracycline (81%), Trimethoprim (73%) (Tu Thanh Dung et al., 2008) Kết thăm dị tính kháng khuẩn thảo dược lĩnh vực nuôi trồng thủy sản chưa công bố nhiều báo khoa học Theo Huỳnh Kim Diệu, (2010), có số thuốc nam có hoạt phổ kháng mạnh vi khuẩn E ictaluri bàng, ổi, trầu không, cỏ sữa lá, rau dừa nước, cỏ mực Kết vòng kháng khuẩn dịch chiết BHX thí nghiệm A.hydrophila E ictaluri tương đương với kết thăm dị hoạt tính kháng khuẩn số thuốc nam bàng (18 -19 mm), cỏ mực (11 – 24 mm), ổi (17 – 21 mm), diệp hạ châu xanh (16 – 21 mm) Đa số dịch chiết thảo dược có tính kháng khuẩn E ictaluri mạnh vi khuẩn A.hydrophila (Huỳnh Kim Diệu, 2010) Như vậy, kết nghiên cứu thử hoạt tính kháng khuẩn thuốc nam vạch hướng mới, nghiên cứu sử dụng thuốc nam điều trị bệnh Aeromonas hydrophila Edwardsiella ictaluri gây cá, nhằm thay kháng sinh, tránh tồn dư kháng sinh sản phẩm, tốt cho sức khỏe người tiêu dùng Theo Quách Văn Cao Thi ctv., (2014), có 30 dịng vi khuẩn A.hydrophila 30 dịng vi khuẩn E ictaluri kháng thuốc kháng sinh Vi khuẩn E ictaluri cịn nhạy với kháng sinh nhóm penicillin ampicillin, amoxicillin loại kháng sinh Quách Văn Cao Thi ctv., (2014) đề xuất sử dụng điều trị bệnh gan thận mủ gây cá tra Thuốc kháng sinh Erythromycin thiocyanate Đặng Thị Hoàng Oanh Nguyễn Thanh Phương (2012) thử nghiệm điều trị bệnh E.ictaluri cá tra 66 AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol 25 (2), 60 – 67 KẾT LUẬN N.Didry, L.Dubrevil and M.Pinkas,1994 Activity of anthroquinone and napthoquinone compounds on oral bacteria Diepharmazie: Vol.49 (9) 681-683 Dịch chiết Bạch hoa xà chiết xuất phương pháp gia nhiệt hay ngâm cồn 70% có tính kháng mạnh vi khuẩn Aeromonas hydrophila Edwardsiella ictaluri Orozoval P., Chikova V., Kolarova V., Nenova R., and Najdenskil H., 2008 Antibiotic resistance of potentially pathogenic Aeromonas strains, Trakia journal of sciences, 6:71-77 Dịch chiết BHX chiết xuất cồn 70% thời gian ngâm ngày cho kết kháng khuẩn Aeromonas hydrophila Edwardsiella ictaluri cao Tuy nhiên, tác dụng kháng khuẩn dịch chiết Bạch hoa xà vi khuẩn E ictaluri cao so với vi khuẩn A.hydrophila Quách Văn Cao Thi, Từ Thanh Dung, Đặng Phạm Hòa Hiệp, 2014 Hiện trạng kháng thuốc kháng sinh hai loài vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila gây bệnh cá tra Đồng sông Cửu Long Tạp chí KH Trường ĐHCT Số chuyên đề thủy sản năm 2014: -14 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Quang Tề, Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, 2000 Giáo trình bệnh học thủy sản Hồ Chí Minh: Nhà xuất Nông Nghiệp Trương Thị Đẹp, Nguyễn Thị Thu Hằng, Nguyễn Thị Thu Ngân Liêu Hồ Mỹ Trang, 2005 Thực vật dược Hà Nội: Nhà xuất Giáo dục Bộ y tế, 2008 Kỹ thuật bào chế sinh dược học dạng thuốc, tập II Hà Nội: Nhà xuất Y học Trương Công Quyền, Vũ Công Thuyết (1986), Thực hành dược khoa, Hà Nội: NXB Y học, trang 505-507 Đặng Thị Hoàng Oanh Nguyễn Thanh Phương, 2012 Thử nghiệm điều trị bệnh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cá Tra (Pangasius hypophthamus) thuốc kháng sinh Erythromycin thiocyanate Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 2012:22c 146-154 Từ Thanh Dung, M.Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh Đặng Thụy Mai Thy, 2004 Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan cá tra (Pangasius hypophthalmus) Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ Chuyên ngành thủy sản, 137-142 Đỗ Tất Lợi, 2004 Những thuốc vị thuốc Việt Nam Hà Nội: Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Tu Thanh Dung, Freddy H., Nguyen A.T., Patric S., Margo B and Annemie D., 2008 Antimicrobial susceptibility pattern of Edwardsiella ictaluri isolates from natural outbreaks of bacillary necrosis of Pangasianodon hypophthalmus in Vietnam, Microbial drug resistance, 14 (4): 311-316 Huỳnh Kim Diệu, 2010 Hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh cá số thuốc nam Đồng sơng Cửu Long Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 2010:15b 222-229 Jan Hudzicki, 2009 Kirby - Bauer Disk Diffusion Susceptibility Test Protocol 67 ... quy định Vắt kiệt hỗn hợp Dịch chiết Dịch chiết ban đầu Đuổi cồn Dịch chiết Hình Sơ đồ tổng quát phương pháp chiết xuất dịch chiết từ Bạch hoa xà 2.3 Phương pháp xác định tính kháng khuẩn dịch chiết. .. Khả kháng khuẩn dịch chiết chiết xuất phương pháp gia nhiệt X= 0: Không kháng X < 5: Kháng yếu Vòng kháng khuẩn dịch chiết Bạch hoa xà đạt (10,3 - 12,3 mm) vi khuẩn Aeromonas sp mật độ vi khuẩn. .. so với vòng kháng khuẩn tỉ lệ 1:1 2: (12,7 – 17,8 mm) 3.1.2 Khả kháng khuẩn dịch chiết chiết xuất phương pháp ngâm với cồn 70% ngày Đối với vi khuẩn A .hydrophila, vòng kháng khuẩn dịch chiết Bạch