Với mục tiêu phân lập, tuyển chọn và khảo sát đặc điểm sinh học của các dòng thực khuẩn thể làm tiền đề cho những nghiên cứu ứng dụng để kiểm soát bệnh xuất huyết trên cá tra gây ra do A. hyrophila, 26 dòng thực khuẩn thể đã được phân lập bằng phương pháp Plaque Assay từ 100 mẫu nước ao nuôi cá ở tỉnh Tiền Giang.
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH XÂM NHIỄM VI KHUẨN AEROMONAS HYDROPHILA CỦA THỰC KHUẨN THỂ TỪ CÁC AO NUÔI CÁ TRA Ở TIỀN GIANG Lê Bửu Kỳ*, Bùi Thế Huy Trường Đại học Tiền Giang *Tác giả liên lạc: lebuuky1006@gmail.com TÓM TẮT Cá tra đối tượng thủy sản xuất chủ lực Việt Nam Tuy nhiên, dịch bệnh tình hình đề kháng kháng sinh vi khuẩn Aeromonas hydrophila thách thức với ngành công nghiệp nuôi cá tra xuất Với mục tiêu phân lập, tuyển chọn khảo sát đặc điểm sinh học dòng thực khuẩn thể làm tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng để kiểm soát bệnh xuất huyết cá tra gây A hyrophila, 26 dòng thực khuẩn thể phân lập phương pháp Plaque Assay từ 100 mẫu nước ao nuôi cá tỉnh Tiền Giang Ba thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG, pAh19.1TG tuyển chọn thông qua kết phần trăm thực khuẩn thể không xâm nhiễm 44,4%, 58,5% 52,9% chu kỳ xâm nhiễm xác định 15 phút Phổ xâm nhiễm 36 chủng vi khuẩn A hydrophila dòng thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG, pAh19.1TG dao động từ 77,2% đến 80,6% Cả dòng thực khuẩn thể thuộc họ Myoviridae có tính đặc hiệu cao khơng xâm nhiễm vi khuẩn gây bệnh thủy sản vi khuẩn Probiotics khảo sát Từ khóa: Aeromonas hydrophila, bacteriophages, kháng kháng sinh ISOLATION AND CHARACTERIZATIONS OF BACTERIOPHAGES INFECTED AEROMONAS HYDROPHILA FROM TIEN GIANG PROVINCE VIETNAM Le Buu Ky*, Bui The Huy Tien Giang University *Corresponding Author: lebuuky1006@gmail.com ABSTRACT Catfish (Pangasianodon hypophthalmus) is one of the most exported products of Vietnam Nonetheless, the epidemic and the antibiotic resistance status of Aeromonas hydrophila are a challenge for the catfish industry The aim of this study was isolation, selection and investigation of the biological characteristics of the bacteriophages as the basis for applied research to control hemorrhage disease caused by A hyrophila The results showed 26 strains of bacteriophage was isolated by Plaque Assay Methodology from 100 catfish ponds in Tien Giang Province Three phages including pAh17.5TG, pAh18.1TG, pAh19.1TG were selected via the un-absorption rate for 44.4%, 58.5% and 52.9% respectively The time of lytic cycle was determined to be 15 minutes Host range with 36 A hydrophila strains of pAh17.5TG, pAh18.1TG, pAh19.1TG ranged from 77.2% to 80.6% All three strains belong to the Myoviridae Family and have high specific due to not infect the other aquatic pathogens and probiotics bacteria Keywords: Aeromonas hydrophila, antibiotic resistance, bacteriophages 126 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 TỔNG QUAN Trong năm gần ngành công nghiệp nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) xuất phát triển mạnh đưa cá tra trở thành sản phẩm thủy sản xuất chủ lực nước ta Tuy nhiên, dịch bệnh cá tra nuôi xảy ngày nhiều khó kiểm sốt Theo khảo sát Từ Thanh Dung ctv (2012), bệnh gan thận mủ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, bệnh trắng đuôi Flavobacterium columnare bệnh xuất huyết A hydrophila gây thường xuất q trình ni cá tra thương phẩm Hiện nay, việc phòng điều trị bệnh cá tra chủ yếu phụ thuộc vào loại thuốc kháng sinh hóa chất Người sử dụng thuốc kháng sinh không cách không quy định nguyên nhân gây tượng vi khuẩn kháng kháng sinh dư lượng kháng sinh cá tra thành phẩm Trước thực trạng đó, địi hỏi phải nhanh chóng tìm giải pháp hạn chế thay việc sử dụng chất kháng sinh Liệu pháp thực khuẩn thể phòng trị bệnh cho cá xu hướng có nhiều triển vọng trung tâm khoa học giới tập trung nghiên cứu phát triển Để có hiểu biết cụ thể thực khuẩn thể có khả xâm nhiễm vi khuẩn gây bệnh xuất huyết cá tra ni cơng nghiệp đặc tính sinh học thực khuẩn thể này, nghiên cứu thực với mục tiêu đóng góp nghiên cứu tảng Việt Nam nhằm ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể để kiểm soát bệnh A hydrophila gây động vật thủy sản nói chung cá tra nói riêng VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Vi khuẩn A hydrophila M, Bacillus subtilis natto, cung cấp từ Đại học Kỷ yếu khoa học Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Chủng Lactobacillus fermentum VTCCB-1051, Lactobacillus plantarum VTCCB-890 cung cấp Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, Vibrio campellii, E ictaluri cung cấp bới Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản Vi khuẩn Lactobacillus acidilactici cung cấp Viện nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ TP.HCM Vi khuẩn Aeromonas veronii, Flavobacterium columnare cung cấp Trường Đại học Chulalongkorn, Thái Lan Mẫu nước dùng để phân lập thực khuẩn thể thu nhận ao nuôi cá tra thuộc Công ty Cổ phần Long An Huyện Cai Lậy Công ty TNHH Phước Hòa Huyện Tân Phước tỉnh Tiền Giang Phương pháp nghiên cứu Phương pháp thu mẫu: mẫu nước ao nuôi thu cách mặt nước 30 cm góc ao ni cá tra, góc cách bờ khoảng m, bảo quản thùng đá, phân tích 24 Phân lập thực khuẩn thể, khảo sát đặc điểm vịng sinh tan, hoạt tính xâm nhiễm dược thực kỹ thuật Plaque Assay (Jin Woo Jun et al., 2014) Phổ xâm nhiễm tính đặc hiệu thực phương pháp Plaque Drop Assay (Oda et al., 2004; Namura et al., 2008) Đặc điểm hình thái xác định thơng qua kính hiển vi điện tử truyền qua TEM, thực khuẩn thể phân loại theo Tổ chức phân loại Virus quốc tế ICTV Ackerman et al (2007) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết phân lập thực khuẩn thể có khả xâm nhiễm vi khuẩn A hydrophila phương pháp Plaque Assay Tại huyện Cai Lậy Tân Phước thu 100 mẫu nước ao nuôi Trong 30 127 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 mẫu nước thu từ ao cá thương phẩm nuôi thâm canh quy mô công nghiệp 70 mẫu thu ao sản xuất cá giống nuôi quy mô công nghiệp Kết từ 100 mẫu nước phân lập kỹ thuật Plaque Assay thu 26 dịng thực khuẩn thể có khả xâm nhiễm A hydrophila M tương đương với tỷ lệ 26% Các dòng thực khuẩn thể sau phân lập kỹ thuật Plaque Assay tiến hành sàng lọc dựa vào độ mờ, rõ vòng sinh tan đường kính vịng sinh tan Các dịng thực khuẩn thể cho vịng sinh tan rõ có kích thước đường kính vịng sinh tan lớn 1mm, ngược lại dịng thực khuẩn thể có vịng sinh tan mờ có kích thước nhỏ 1mm Các dịng thực khuẩn thể vị trí TG17.5, TG18.1 TG19.1 có kích thước vòng sinh tan lớn tương ứng với 1,28±0,02 mm, 1,26±0,06 mm, 1,28±0,08 mm, khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê với khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê với 23 dòng thực khuẩn thể cịn lại Từ thí nghiệm phần trăm thực khuẩn thể khơng xâm nhiễm cho kết dịng thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG pAh19.1TG có phần trăm không xâm nhiễm thời điểm 15 phút 44,2%, 58,5% 52,9%, khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê với Khi so sánh kết nghiên cứu với cơng trình cơng bố nhóm tác giả Taruna Anand et al (2015) cho thấy: phần trăm thực khuẩn thể không xâm nhiễm pAh17.5TG (44,2%) pAh19.1TG (52,9%) thấp Đồng thời phần trăm không xâm nhiễm dòng thực khuẩn thể pAh17.5TG thấp so với kết 51% nhóm tác giả El Araby et al (2016) Ở thời điểm 30 phút, nồng độ dòng thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG pAh19.1TG tăng đột biến với tỷ lệ phần trăm 123,7%, 79,8% 409,9% Từ thời điểm khảo sát số Kỷ yếu khoa học lượng thực khuẩn thể không xâm nhiễm, xác định chu kỳ xâm nhiễm dòng thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG pAh19.1TG 15 phút Chu kỳ xâm nhiễm dòng thực khuẩn thể phân lập Tiền Giang tương đương với chu kỳ nghiên cứu Jian-Bin Wang et al (2016) ngắn chu kỳ 30 phút Jin Woo Jun et al (2013) Kết thí nghiệm khảo sát phổ xâm nhiễm dòng thực khuẩn thể Các dòng thực khuẩn thể sau phân lập tuyển chọn Tiền Giang tiến hành thử phổ xâm nhiễm với 36 chủng vi khuẩn A hydrophila phân lập định danh vùng khác Tiền Giang Bến Tre từ sưu tập giống Đại học Tiền Giang Kết thí nghiệm cho thấy: phổ xâm nhiễm dòng thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG pAh19.1TG 36 chủng vi khuẩn A hydrophila phân lập dao động từ 72,2% đến 80,6% Trong dịng thực khuẩn thể pAh19.1TG có phổ xâm nhiễm rộng 80,6% Khi so sánh với kết phổ xâm nhiễm Jin Woo Jun et al kết dịng thực khuẩn thể phân lập Tiền Giang có kết hẹp Tuy nhiên, so sánh với kết nhóm tác giả Jian-Bin Wang et al vào năm 2016, phổ xâm nhiễm dòng thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG pAh19.1TG rộng Dựa vào kết phần trăm tỷ lệ xâm nhiễm thực khuẩn thể vi khuẩn A hydrophila thấy tiến hành tổ hợp dòng thực khuẩn thể với thành cặp sau pAh17.5TG pAh18.1TG, pAh17.5TG pAh19.1TG, pAh18.1TG pAh19.1TG cho kết phổ xâm nhiễm 77,8%, 80,6% 80,6% Khi tổ hợp dòng thực khuẩn thể với cho kết phổ xâm nhiễm 80,6% Từ kết trên, sử dụng riêng lẻ thực khuẩn thể pAh19.1TG, tổ hợp dùng 128 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 thực khuẩn thể với hai dòng thực khuẩn thể lại ba dòng thực khuẩn thể Tuy nhiên, để mở rộng nghiên cứu phổ xâm nhiễm vi khuẩn A hydrophila phân lập đối tượng thủy sản vùng nuôi thủy sản khác Đồng Sông Cửu Long, tổ hợp dòng thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG pAh19.1TG đề xuất lựa chọn làm nguyên liệu cho nghiên cứu Kết phân loại dòng thực khuẩn theo ICTV dựa vào kết chụp TEM Dựa vào kết ảnh chụp TEM dòng thực khuẩn thể phân lập từ ao nuôi cá tra Tiền Giang, tiến hành ghi nhận kích thước đầu, cổ Kết hợp với tiêu chuẩn phân loại theo họ thực khuẩn thể ICTV Từ kết ảnh chụp TEM dòng thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG pAh19.1TG cho thấy dịng thực khuẩn thể có loại cấu trúc thể bao gồm đầu, cổ Từ cấu trúc thể xếp dòng thực khuẩn thể thể pAh17.5TG, pAh18.1TG pAh19.1TG vào họ Myoviridae Kết phân loại dòng thực khuẩn thể phân lập tỉnh Tiền Giang nghiên cứu tương đồng với cơng bố nhóm tác giả Taruna Anand et al (2015) Kết thí nghiệm khảo sát tính đặc hiệu dòng thực khuẩn thể Tiến hành khảo sát tính đặc hiệu dịng thực khuẩn thể phân lập tuyển chọn trước chủng vi khuẩn gây bệnh động vật thủy sản A veronii, E ictaluri, F columnare, V parahaemolyticus, V campellii, chủng vi khuẩn có đặc tính probiotics ứng dụng nuôi trồng thủy sản bao gồm: L fermentum, L plantarum, L acidilactici, B subtilis natto Kết thí nghiệm khảo sát độ đặc hiệu dịng thực khuẩn thể thể pAh17.5TG, pAh18.1TG pAh19.1TG Kỷ yếu khoa học dòng vi khuẩn gây bệnh điển hình ni trồng thủy sản vi khuẩn có đặc tính probiotics cho thấy: tất dịng thực khuẩn thể không xâm nhiễm Kết khảo sát độ đặc hiệu dòng thực khuẩn thể phân lập Tiền Giang tương đồng với kết Jin Woo Jun et al vào năm 2013 Jian-Bin Wang et al vào năm 2017 Từ kết kết luận dịng thực khuẩn thể phân lập tuyển chọn bao gồm pAh17.5TG, pAh18.1TG pAh19.1TG có tính đặc hiệu cao vi khuẩn A hydrophia KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau q trình tuyển chọn 26 dịng thực khuẩn thể phân lập từ 100 mẫu nước 20 ao nuôi cá tra Tiền Giang cho kết ba dòng thực khuẩn thể đặt tên pAh17.5TG, pAh18.1TG pAh19.1TG có vịng sinh tan rõ, đường kính vòng sinh tan lớn 1,28±0,02 mm, 1,26±0,06 mm, 1,28±0,08 mm Chu kỳ xâm nhiễm dòng thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG pAh19.1TG 15 phút, phần trăm thực khuẩn thể không xâm nhiễm 44,2%, 58,5% 52,9%, phổ xâm nhiễm rộng dao động từ 72,2% đến 80,6% Trong đó, dịng thực khuẩn thể pAh19.1TG có phổ xâm nhiễm rộng Cả dòng pAh17.5TG, pAh18.1TG pAh19.1TG thuộc họ Myoviridae dựa kết ảnh chụp kính hiển vi điện tử truyền qua TEM có độ đặc hiệu cao với vi khuẩn A hydrophila không xâm nhiễm số chủng vi khuẩn gây bệnh thường gặp thủy sản chủng vi khuẩn Probiotics Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu xây dựng đường cong sinh trưởng khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến mật độ thực khuẩn thể theo thời gian Đồng thời, phân lập vi khuẩn A hydrophila vùng nuôi 129 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 khác ĐBSCL đối tượng thủy sản khác để mở rộng thí nghiệm khảo sát phổ xâm nhiễm nhằm làm tiền đề cho nghiên cứu nhằm Kỷ yếu khoa học ứng dụng thực khuẩn thể tác nhân kiểm soát sinh học bệnh A hydrophila gây TÀI LIỆU THAM KHẢO ACKERMANN, H.W 2007 5500 Phages examined in the electron microscope Archives of Virology Vol.152: 227-243 EL-ARABY DA, GAMAL EL-DIDAMONY AND MARIHAN MEGAHED TH 2016 New approach to use phage therapy against Aeromonas hydrophila induced motile Aeromonas Septicemia in Nile Tilapia Journal of Marine Science: Research & Development Vol.6 (3): 1-6 JIAN-BIN WANG, NIEN TSUNG LIN, YI HSIUNG TSENG, SHU FEN WEN 2016 Genomic Characterization of the Novel Aeromonas hydrophila Phage Ahp1 Suggests the Derivation of a New Subgroup from phiKMV-Like Family PLoS ONE Vol.11 (9): 1-20 TỪ THANH DUNG, M CRUMLISH, NGUYỄN THỊ NHƯ NGỌC, NGUYỄN QUỐC THỊNH VÀ ĐẶNG THỤY MAI THY 2004 Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan cá Tra (Pangasius hypophthalmus) Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Thủy Sản 137-142 130 ... thí nghiệm khảo sát phổ xâm nhiễm dòng thực khuẩn thể Các dòng thực khuẩn thể sau phân lập tuyển chọn Tiền Giang tiến hành thử phổ xâm nhiễm với 36 chủng vi khuẩn A hydrophila phân lập định danh... dòng vi khuẩn gây bệnh điển hình ni trồng thủy sản vi khuẩn có đặc tính probiotics cho thấy: tất dịng thực khuẩn thể khơng xâm nhiễm Kết khảo sát độ đặc hiệu dòng thực khuẩn thể phân lập Tiền Giang. .. cách mặt nước 30 cm góc ao ni cá tra, góc cách bờ khoảng m, bảo quản thùng đá, phân tích 24 Phân lập thực khuẩn thể, khảo sát đặc điểm vòng sinh tan, hoạt tính xâm nhiễm dược thực kỹ thuật Plaque