Khảo sát quy trình chuỗi Polymerase (PCR) phát hiện một số loài Lactobacillus trong thực phẩm chức năng

Khảo sát và lựa chọn quy trình phát hiện 9 loài Lactobacillus trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp PCR có thể áp dụng tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật – Trung tâm Kiểm nghiệm An toàn Thực phẩm Khu vực phía Nam, Viện Y tế công cộng TP. Hồ Chí Minh.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHUỖI POLYMERASE (PCR) PHÁT HIỆN MỘT SỐ LOÀI LACTOBACILLUS TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG Lê Thị Hiên*, Trần Nguyễn Minh Đoan* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Probiotic vi sinh vật có lợi, bổ sung nhiều sản phẩm thực phẩm chức – Lactobacillus nhóm chủ yếu số vi khuẩn probiotic Các nhà sản xuất thường công bố tên lồi vi khuẩn Lactobacillus bao bì nhằm tăng giá trị sản phẩm Hiện nay, phương pháp truyền thống để xác định lồi Lactobacillus cịn hạn chế phương pháp dựa sinh học phân tử xem giải pháp tiềm Để có phương pháp hiệu nhằm thực chức giám sát sản phẩm thực phẩm chức Bộ Y tế giao phó, đồng thời đáp ứng nhu cầu kiểm nghiệm khách hàng, thực đề tài nhằm xây dựng phương pháp định danh số loài Lactobacillus thường gặp thực phẩm chức kỹ thuật PCR Mục tiêu: Khảo sát lựa chọn quy trình phát lồi Lactobacillus thực phẩm chức phương pháp PCR áp dụng phịng thí nghiệm Vi sinh vật – Trung tâm Kiểm nghiệm An tồn Thực phẩm Khu vực phía Nam, Viện Y tế cơng cộng TP Hồ Chí Minh Phương pháp nghiên cứu: Lựa chọn quy trình tách chiết DNA; khảo sát độ đặc hiệu mồi; tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR; khảo sát mức phát LOD50 phương pháp; ứng dụng quy trình phân tích số mẫu thực tế Kết quả: Chúng lựa chọn cặp mồi đặc hiệu cho loài vi khuẩn Lactobacillus, bao gồm: L acidophilus, L rhamnosus, L casei, L plantarum, L bulgaricus, L reuteri, L pentosus, L fermentum L sakei Mức phát LOD50 phương pháp mức thấp (dưới CFU/g): thấp 0,7 CFU L acidophilus /g cao 2,5 CFU L sakei /g mẫu thực phẩm chức dạng lỏng; thấp 0,8 CFU L reuteri /g đến cao 2,7 CFU L sakei /g mẫu thực phẩm chức dạng bột Phương pháp có độ chọn lọc tốt, phát đặc hiệu chủng mục tiêu Kết luận: Quy trình bước đầu đưa vào áp dụng để phát loài vi khuẩn Lactobacillus thực phẩm chức Từ khóa: phản ứng PCR, probiotic ABSTRACT SURVEYING POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) METHOD TO DETECT SOME LACTOBACILLUS SPECIES IN FUNCTIONAL FOOD Le Thi Hien, Tran Nguyen Minh Doan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 – No - 2019: 429 – 437 Background: Probiotics are live microorganisms that benefit the host's health Most of the probiotics in many functional food products are lactobacilli These bacteria are labeled to increase the value of the product Currently, traditional methods to identify Lactobacillus species are limited and methods based on molecular biology are considered potential solutions In order to have an effective method to perform the monitoring functional food products follow requirements of the Ministry of Health and at the same time to meet the testing needs of customers, we implemented this study to develop the rapid method for identification some common *Viện Y Tế Công Cộng TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Lê Thị Hiên ĐT: 0938640803 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Email: lethihien@iph.org.vn 429 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Lactobacillus species used in functional foods by PCR technique Objectives: Assess and select PCR method to detect Lactobacillus species in functional foods that can be applied in microbiology laboratory of The Southern Regional Centre of Food Safety, Institute of Public Health, Ho Chi Minh City Methods: Select the DNA extraction procedures; assess the primers’ specificity; optimize PCR conditions; survey the detection level 50 (LOD50) of the method; apply PCR method to analyse samples Results: specific primer pairs were selected for Lactobacillus species, including: L acidophilus, L rhamnosus, L casei, L plantarum, L bulgaricus, L reuteri, L pentosus, L fermentum and L sakei The detection level (LOD50) of these methods was low (below CFU / g): range from 0.7 CFU L acidophilus / g to 2.5 CFU L sakei / g in the background of liquid functional food and from 0.8 CFU L reuteri/g to 2.7 CFU L sakei/g for powdered functional food The PCR methods had good selectivity, and could be applied on actual samples Conclusions: The methods can be applied to detect these Lactobacillus species in functional foods in our microbiological laboratory Keywords: polymerase chain reaction, probiotics ĐẶT VẤN ĐỀ Probiotic vi sinh vật sống đưa vào thể lượng vừa đủ mang lại lợi ích cho sức khỏe vật chủ(6) Vì lợi ích mà probiotic mang lại tự lựa chọn sử dụng người tiêu dùng nên tình hình sản xuất tiêu thụ sản phẩm probiotic gia tăng không ngừng Doanh số bán sản phẩm probiotic có xu hướng gia tăng phạm vi tồn cầu với tỷ lệ 35%: từ 23,1 tỷ đô la Mỹ (năm 2010) lên 31,3 tỷ đô la Mỹ (năm 2014)(12) Lactobacillus nhóm chủ yếu số vi khuẩn probiotic, bổ sung vào sản phẩm thực phẩm chức Tuy nhiên, trước cho phép bổ sung vào thực phẩm probiotic, chủng vi khuẩn Lactobacillus cần phải nghiên cứu chứng minh khả mang lại lợi ích cho sức khỏe an tồn cho người(7) Vì thế, có số lồi Lactobacillus xem vi khuẩn probiotic phép đưa vào sử dụng cho người Hiện nay, thị trường Việt Nam, có 15 sản phẩm thực phẩm chức dán nhãn bổ sung lồi Lactobacillus Tuy nhiên, thơng tin cần giám sát kiểm tra quan chức – đó, Viện Y tế cơng cộng Thành phố Hồ Chí Minh đóng vai trị khơng nhỏ 430 Hiện nay, có nhóm kỹ thuật để xác định lồi Lactobacillus Các phương pháp vi sinh truyền thống dù xem tiêu chuẩn vàng, số lượng lồi vi khuẩn Lactobacillus xác định hạn chế Các phương pháp dựa proteomics lại phát triển thiết bị, máy móc kỹ thuật cao đắt tiền Vì thế, phương pháp định danh cấp độ loài dựa kiểu gen khuyến cáo đưa vào ứng dụng nhiều chúng cho kết nhanh xác - số đó, phương pháp PCR phương pháp tương đối đơn giản phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm vi sinh vật Để có phương pháp hữu hiệu nhằm thực chức giám sát sản phẩm thực phẩm chức đáp ứng nhu cầu kiểm nghiệm khách hàng, thực đề tài nhằm xây dựng phương pháp định danh số loài Lactobacillus thường gặp thực phẩm chức kỹ thuật PCR Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát quy trình xác định lồi vi khuẩn Lactobacillus thường gặp thực phẩm chức năng: L acidophilus, L rhamnosus, L casei, L plantarum, L bulgaricus, L reuteri, L pentosus, L fermentum L sakei thông qua việc lựa chọn mồi đặc hiệu, quy trình tách chiết DNA tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Khảo sát mức phát LOD50 độ chọn lọc quy trình Ứng dụng quy trình để kiểm tra số mẫu thực phẩm chức thị trường ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành chủng vi khuẩn Lactobacillus mục tiêu chủng không mục tiêu liệt kê bảng Chủng vi khuẩn L reuteri L pentosus phân lập từ thực phẩm chức tiến hành định danh theo phương pháp PCR - giải trình tự Bảng 1: Các chủng vi sinh vật sử dụng nghiên cứu Chủng vi sinh vật không mục tiêu Lactobacillus fermentum Lactobacillus brevis ATCC 14869 ATCC 9338 Lactobacillus casei ATCC Lactobacillus paracasei subsp paracasei ATCC BAA-52 334 Lactobacillus plantarum Lactococcus lactis ATCC ATCC 8014 19435 Lactobacillus rhamnosus Bifidobacterium bifidum ATCC ATCC 53103 29521 Lactobacillus acidophilus Bifidobacterium animalis subsp lactis ATCC 25527 ATCC 4356 Lactobacillus delbrueckii ssp Bifidobacterium breve ATCC bulgaricus ATCC 11842 15700 Lactobacillus sakei ssp sakei Bacillus cereus ATCC 10876 ATCC 15521 Lactobacillus reuteri Bacillus subtilis ATCC 6633 Lactobacillus pentosus Escherichia coli ATCC 11775 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Listeria monocytogenes ATCC 19115 Salmonella Typhimurium ATCC 13311 Shigella sonnei ATCC 9290 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Vibrio parahaemolyticus ATCC 1780 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Cronobacter sakazakii BCRC 13988 Chủng vi sinh vật mục tiêu Nghiên cứu Y học Phương pháp nghiên cứu Tách chiết DNA vi khuẩn Thực quy trình: Phương pháp tách chiết nhiệt Ly tâm 1ml dịch nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn 10.000g/ phút/ 20- 250C Sau ly tâm, đổ bỏ dịch rửa sinh khối 1mL NaCl 0,85% Vortex hỗn dịch ly tâm 10.000g/10 phút 20 – 250C Loại bỏ dịch huyền phù sinh khối 0,5ml TE 1X Đun sơi 95oC/15 phút, sau đặt ống đá phút Ly tâm 10.000g/5 phút/200C - 250C Chuyển 400µl dịch chứa DNA vi khuẩn sang tube 1,5 ml DNA vi khuẩn bảo quản -200C Phương pháp tách chiết A Phương pháp điều chỉnh lại quy trình tác giả Alimolaei M cộng sự(1) Trong đó, chúng tơi loại bỏ bước bổ sung RNase A để xây dựng quy trình tách chiết A cho phịng thí nghiệm Phương pháp tách chiết kit Wizard® Genomic DNA Purification (Promega, nước sản xuất) Huyền dịch sau tách chiết đo độ hấp thụ ánh sáng với máy đo OD (Quawell Q5000, Mỹ) bước sóng 230, 260, 280 nm, thu giá trị A230, A260, A280 DNA đánh giá tinh có tỷ số A260/A280 thuộc khoảng 1,8 – 2,0 tỷ số A260/A230 tốt lớn 1,5 Lựa chọn mồi Tham khảo số nghiên cứu cơng bố trước quy trình PCR phát số vi khuẩn Lactobacillus thực phẩm (liệt kê Bảng 2) Các trình tự mồi kiểm tra mơ hình chương trình BLAST NCBI Các mồi phù hợp chọn đưa vào nghiên cứu Bảng 2: Trình tự mồi kích thước sản phẩm PCR sử dụng nghiên cứu Mục tiêu Mồi Trình tự mồi (5’ – 3’) Chu trình nhiệt Sản phẩm (bp) Lactobacillus LacF AGCAGTAGGGAATCTTCCA 94°C/2p, 25 x (94°C/15s, 345 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Tham khảo (8) 431 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Mục tiêu spp L casei L pentosus L delbrueckii sp bulgaricus L acidophilus L reuteri L plantarum L rhamnosus L fermentum L sakei Mồi Trình tự mồi (5’ – 3’) Sản phẩm (bp) 51°C/15s, 72°C/30s), 72°C/5p LacR ATTTCACCGCTACACATG o o casei-F TTATCATGTGGCCGAACAAA 98 C/30s, 35x (98 C/30s, o o o 60 C/30s, 72 C/30s); 72 C/5p casei-R GTTTGCGTCAAAGTCTGCAA o o pentF CAGTGGCGCGGTTGATATC 94 C/1p, 30 x (94 C/1p, o o o 55 C/30s, 72 C/1p); 72 C/5p pREV TCAGGGTTTCCAAACATCAC o o 16SbulF AACATGAATCGCATGATTCAAGTTTG 95 C/5p, 25 x (95 C/20s, o o o 62 C/30s, 72 C/1p); 72 C/5p 16SbulR ACCGGAAAGTCCCCAACACCTA o o Laci-F TGCAAAGTGGTAGCGTAAGC 95 C/4p; 35 x (95 C/20s; o o o 62 C/30s; 72 C/30s); 72 C/5p Laci-R CCTTTCCCTCACGGTACTG o o Lreu-F CAGACAATCTTTGATTGTTTAG 95 C/4p; 35 x (95 C/20s; o o o 60 C/30s; 72 C/30s); 72 C/5p Lreu-R GCTTGTTGGTTTGGGCTCTTC o o Lpla-F ATTCATAGTCTAGTTGGAGGT 95 C/4p; 35 x (95 C/20s; o o o 60 C/30s; 72 C/30s); 72 C/5p Lpla-R CCTGAACTGAGAGAATTTGA o o Lrha-F CTAGCGGGTGCGACTTTGTT 95 C/4p; 35 x (95 C/ 20s; o o o 62 C/30s; 72 C/30s); 72 C/5p Lrha-R GCGATGCGAATTTCTATTATT o o Lfer-F ACTAACTTGACTGATCTACGA 95 C/4p; 35 x (95 C/20s; o o o 60 C/30s; 72 C/30s); 72 C/5p Lfer-R TTCACTGCTCAAGTAATCATC o o 94 C/5p; 35 x (95 C/ 20s; sakeiF GAGCTTGCTCCTCATTGATAA o o o 58 C/30s; 72 C/ 30s); 72 C/ 5p sakeiR TTGGATACCGTCACTACCTG Kiểm tra độ đặc hiệu mồi Nuôi cấy tăng sinh chủng vi khuẩn Các chủng vi khuẩn Lactobacillus Bifidobacterium sp nuôi môi trường canh thang De Man Rogosa Sharpe (MRS, Merck - Đức) 37oC 48 điều kiện kỵ khí Chủng vi khuẩn khác nuôi cấy môi trường thạch dinh dưỡng nuôi cấy môi trường Tryptic Soy Broth (TSB, Merck Đức) 37oC 24 Phản ứng PCR diễn giải kết Mỗi chủng tiến hành phân tích lần theo quy trình nhiệt trình bày bảng Thành phần phản ứng PCR bao gồm: 1X G2 Green GoTaq buffer, 0,5 µM mồi, 10 – 50ng DNA khuôn PCR tiến hành máy luân nhiệt Eppendorf Nexus Sau đó, sản phẩm PCR điện di gel agarose 2%, chạy điện 100V 35 phút; cuối cùng, gel nhuộm với thuốc nhuộm Diamond Nucleic Acid Dye (Promega) quan sát đèn UV Các phản ứng PCR cho kết vạch điện di khơng rõ ràng, có sản phẩm phụ không đặc hiệu tiến hành tối ưu hóa cách thay đổi thơng số sau với Hot-start Taq polymerase 432 Chu trình nhiệt Tham khảo 858 (5) 219 (14) 675 (10) 207 (11) 305 (11) 248 (11) 113 (11) 191 (11) 433 (3) (Takara, Nhật) với thành phần bao gồm 1X Takara PCR buffer, 0,2 mM dNTP loại, 0,4U Hot Start Taq Polymerase, 0,5 µM mồi, 10 - 50ng DNA khn, nồng độ MgCl2 thay đổi từ 1,5 - 5,5 mM; nhiệt độ bắt cặp thay đổi khoảng ± 5oC Khảo sát số thơng số quy trình Xác định mức phát LOD50 Với mẫu này, lựa chọn loại mẫu khác nhau: thực phẩm chức dạng bột dạng lỏng Các mẫu thực phẩm chức kiểm tra trước cho thấy bổ sung vi khuẩn Lactobacillus Chuẩn bị 50 mẫu trắng Mỗi mẫu tiến hành cân 1g (hoặc 1mL) mẫu vào ống nghiệm chứa mL dung dịch canh thang MRS Chuẩn bị huyền dịch chủng vi khuẩn mức bậc 2: 20, 2-1, 2-2, 2-3 Tiến hành nhiễm mL từ ống chủng vào huyền dịch mẫu (1g mẫu + 9ml canh thang MRS) Mức nhiễm CFU 101 CFU: mức tiến hành mẫu; mức nhiễm lại: mức tiến hành 10 mẫu Lượng vi khuẩn bổ sung đồng thời trải 1ml đĩa thạch MRS Các mẫu phân Chuyên Đề Y Tế Cơng Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 tích theo quy trình LOD50 tính theo phương pháp Spearman-Karber(9) Xác định độ chọn lọc Độ chọn lọc phương pháp thể qua tính chọn lọc bao hàm chọn lọc loại trừ Các chủng vi khuẩn mục tiêu chuẩn bị với lượng gấp 10 lần mức phát ml huyền dịch mẫu Chọn chủng vi khuẩn không mục tiêu thường bổ sung thực phẩm chức có khả gây phản ứng chéo với chủng mục tiêu Các chủng chuẩn bị với lượng gấp 100 lần mức phát ml huyền dịch Bổ sung ml huyền dịch vi khuẩn cho vào ml canh thang MRS, đồng thời trải kiểm tra đĩa thạch khơng chọn lọc thích hợp Mẫu tiến hành phân tích lần theo quy trình nghiên cứu ghi nhận kết Nghiên cứu Y học Chúng tiến hành thu thập 20 mẫu thực phẩm chức (2 mẫu dạng lỏng 18 mẫu dạng bột) bán nhà thuốc TP Hồ Chí Minh, ghi nhận thơng tin bao bì tiến hành phân tích theo quy trình khảo sát KẾT QUẢ Lựa chọn quy trình tách chiết DNA Bước nghiên cứu phân tích mặt di truyền từ sinh vật trình tách chiết tinh DNA chất lượng Trong nghiên cứu này, muốn lựa chọn phương pháp tách chiết phù hợp cho phân tích PCR từ vi khuẩn Lactobacillus Từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sau 48 giờ, tiến hành tách chiết theo phương pháp: nhiệt, quy trình A kit Promega Để đánh giá hiệu phương pháp tách chiết, tỷ số độ hấp thụ A260/A280, A260/A230 Áp dụng quy trình để phân tích số nồng độ DNA dịch sau tách chiết so mẫu thực phẩm chức thực tế sánh với nhau, kết thể Bảng Bảng 3: So sánh kết tách chiết DNA từ phương pháp khác STT 10 Chủng vi khuẩn L acidophilus L rhamnosus L bulgaricus L casei L fermentum L plantarum L pentosus L reuteri L brevis L sakei Trung bình Nhiệt 1,58 1,56 1,45 1,60 1,57 1,58 1,39 1,46 1,69 1,46 1,53 A260/A280 A 2,18 2,25 2,11 2,12 2,22 2,23 2,20 2,23 1,79 2,30 2,16 Kit 1,86 2,00 2,34 1,98 1,83 2,02 2,14 2,05 2,48 1,76 2,05 Phương pháp tách chiết nhiệt cho sản phẩm sau tách chiết có tỷ lệ A260/A280, A260/A230 hàm lượng DNA thấp nhất; phương pháp tách chiết theo quy trình A (thay đổi từ quy trình tác giả Alimolaei M cộng (1)) tách chiết kit Wizard® Genomic DNA Purification (Promega, Mỹ) cho tỷ lệ xấp xủ Khảo sát độ đặc hiệu mồi Để phát loài Lactobacillus khác nhau, số tác giả thiết kế cặp mồi đặc hiệu Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Nhiệt 0,95 1,15 0,88 1,04 0,90 1,13 0,93 0,80 0,80 0,94 0,95 A260/A230 A 1,83 2,14 1,88 1,94 1,99 2,07 2,03 2,30 1,76 1,83 1,98 Kit 1,84 2,30 1,79 2,19 1,87 2,26 2,23 2,15 1,89 1,69 2,02 Nhiệt 143,6 279,8 122,6 199,9 190,4 263,8 105,2 177,4 91,8 87,1 166,16 [DNA] (ng/µl) A 459,5 599,7 547,4 227,2 503,2 429,5 601,2 516,3 138,4 190,8 421,32 Kit 323,0 369,1 368,0 348,8 236,0 349,7 353,7 402,0 156,5 156,0 306,28 cho loài vi khuẩn này(2,4) Tham khảo nhiều công bố trước, dựa kết kiểm tra chương trình BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), chúng tơi lựa chọn cặp mồi cho loài vi khuẩn Lactobacillus, với trình tự liệt kê Bảng Cặp mồi giúp khuếch đại gen mục tiêu khác nhau, bao gồm vùng trình tự gen mã hóa cho 16S RNA 23S RNA (gọi 16S-23S ISR), gen giữ nhà (“house-keeping gene”) recA, polA Khi tiến hành phản ứng PCR 25 chủng vi khuẩn không mục tiêu, kết 433 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 cho thấy cặp mồi cho kết đặc hiệu cho vi khuẩn mục tiêu, đồng thời không cho sản phẩm chủng khơng mục tiêu Hình kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra độ đặc hiệu mồi phát L fermentum (Hình 1) 500 bp 191 bp Hình 1: Kết kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi Lfer-F Lfer-F phát L fermentum Giếng 1: L acidophilus; 2: L bulgaricus; 3: L casei; 4: L fermentum; 5: L brevis; 6: L pentosus; 7: L plantarum; 8: L reuteri; 9: L rhamnosus; 10: L sakei; 11: L paracasei; 12: Lc lactis; 13: E coli; 14: S aureus; 15: B cereus; 16: B subtilis; 17: S Typhimurium; 18: Shi sonnei; 19: P aeruginosa; 20: En faecalis; 21: S thermophilus; 22: B animalis; 23: B lactis; 24: B breve; 25: B bifidum; 26: Chứng âm; Lad: Thang DNA 100bp Tối ưu hóa quy trình phát L reuteri Khi áp dụng quy trình phát vi khuẩn L reuteri, nhận thấy xuất vạch sản phẩm phụ gel điện di bên cạnh sản phẩm (305 bp) Vì vậy, để phương pháp đạt hiệu tốt, chúng tơi tiến hành tối ưu hóa phản ứng PCR Phương pháp Hot-start b) PCR ngăn chặn kéo dài DNA polymerase nhiệt độ thấp hơn, giảm sản phẩm phụ không mong muốn Thay đổi nồng độ magie cách thức đơn giản để tối ưu hóa điều kiện phản ứng tác động dễ thấy lên tính nghiêm ngặt phản ứng PCR Hình 2: Kết thay đổi nồng độ MgCl2 để tối ưu hóa điều kiện phản ứng phát L reuteri NC: chứng âm, số ghi giếng nồng độ MgCl2 (tăng dần từ 1,5 - 5,5 mM) Lad: thang DNA 100bp 434 Kết khảo sát cho thấy sử dụng 500 bp pháp Hot start PCR với nồng độ magie phương thay đổi từ 1,5 mM đến 5,5 mM để phát L reuteri với sản phẩm có kích thước 305bp lượng sản phẩm phụ giảm dần (Hình 2) Phản ứng đạt điều kiện tối ưu 4,5mM Mg2+ với kit Hot start PCR (Takara) Kết PCR thay đổi nhiệt độ bắt cặp phản ứng khơng cho thấy có khác biệt Khảo sát số thơng số quy trình Mức phát Bảng 4: Kết xác định mức phát LOD50 phương pháp mẫu thực phẩm chức (Đơn vị: CFU/ g mL) STT Vi khuẩn L acidophilus L bulgaricus L casei L fermentum 500bp L plantarum L pentosus L reuteri L rhamnosus L sakei Thực phẩm chức Thực phẩm chức dạng lỏng dạng bột 0,7 1,3 1,3 1,5 1,0 1,2 1,1 1,1 1,8 1,4 1,5 1,1 1,0 0,8 1,9 1,0 2,5 2,7 Kết xác định mức phát LOD50 phương pháp chúng tơi nghiên cứu lồi vi khuẩn Lactobacillus khác thể Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Bảng Xác định độ chọn lọc Nghiên cứu Y học không phát chủng vi khuẩn không mục tiêu Theo đó, quy trình cho thấy có độ chọn lọc tốt: cho kết dương tính chủng vi khuẩn mục tiêu âm tính chủng vi khuẩn khơng mục tiêu (Hình 3) Ứng dụng quy trình mẫu thực tế Chúng tơi thu thập ngẫu nhiên 20 mẫu thực phẩm chức có bổ sung vi khuẩn Lactobacillus để phân tích quy trình xây dựng Kết cho thấy tổng số 20 mẫu phân tích, có sản phẩm khơng bổ sung lồi vi 500 bp 248 bp khuẩn thơng tin ghi bao bì (Bảng 5) Phần lớn sản phẩm ghi nhãn có bổ Hình Kết kiểm tra độ chọn lọc quy trình sung vi khuẩn L acidophilus (17/20 mẫu); phát L plantarum nhiên, theo kết phân tích, có 15/17 mẫu có phát L acidophilus 2/17 mẫu khơng Giếng 1: L acidophilus; 2: L bulgaricus; 3: L casei; 4: L fermentum; 5: L brevis; 6: L pentosus; 7: L plantarum; 8: phát vi khuẩn (M6, M17) Bên cạnh đó, L reuteri; 9: L rhamnosus; 10: L sakei; 11: L paracasei; mẫu (M2, M11) nhà sản xuất cơng bố có 12: Lc lactis; 13: Chứng âm; Lad: Thang DNA 100bp chứa loài vi khuẩn Lactobacillus khác nhau, Phương pháp kiểm tra khả phát nhiên kết phát loài chọn lọc chủng vi khuẩn mục tiêu Bảng 5: Kết phân tích mẫu thực phẩm chức thực tế STT Mã số mẫu 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 Thơng tin ghi bao bì L acidophilus L rhamnosus, L plantarum, L acidophilus L acidophilus L acidophilus L acidophilus L acidophilus L acidophilus L acidophilus L acidophilus L acidophilus L plantarum, L casei, L acidophilus L acidophilus Lactobacillus L acidophilus L acidophilus L acidophilus L acidophilus L acidophilus L casei L reuteri BÀN LUẬN Tách chiết DNA bước quan trọng quy trình PCR, ảnh hưởng trực tiếp Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Kết phân tích L acidophilus L plantarum L rhamnosus L casei L reuteri + + + + + + + + + + + + + + + + + + đến thành công phản ứng PCR Kết so sánh thông số sản phẩm sau tách chiết phương pháp khác thể bảng 435 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 cho thấy phương pháp tách nhiệt cho thấy hiệu thấp Bên cạnh đó, quy trình A cho kết tương đương với phương pháp tách kit thương mại số: tỷ lệ A260/A280, A260/A230 có khả thu DNA với hàm lượng cao Tỷ lệ hấp thụ 260 nm 280 nm sử dụng để đánh giá độ tinh khiết DNA RNA Nucleic acid có độ hấp thụ cực đại 260 nm Một tỷ lệ A260/A280 xấp xỉ 1,8 thường chấp nhận cho DNA tinh Khi tỷ lệ thấp đáng kể có nghĩa dịch sau tách chiết có diện protein, phenol chất tạp nhiễm khác có độ hấp thụ mạnh gần bước sóng 280 nm Trong đó, tỷ lệ A260/A230 sử dụng thước đo thứ cấp độ tinh acid nucleic Giá trị A260/A230 mong muốn thường nằm khoảng 1,8 - 2,2(13) Dịch DNA sau tách chiết quy trình A kit có độ tinh tốt so với phương pháp tách chiết nhiệt có tỷ lệ A260/A280 tỷ lệ A260/A230 lớn 1,9 – điều phương pháp có trải qua bước phân hủy loại bỏ protein Hàm lượng DNA thu từ phương pháp tách chiết đạt mức để sử dụng cho phản ứng PCR phương pháp nghiên cứu quy trình A cho thấy khả thu DNA với hàm lượng cao Trong quy trình A, việc sử dụng lysozyme đồng thời với EDTA Triton X-100 giúp tăng hiệu việc phá vỡ tế bào vi khuẩn (1) Việc loại bỏ bước sử dụng RNase A trình tách chiết khơng làm thay đổi hiệu q trình tách DNA So sánh mặt kinh tế, quy trình A phương pháp thích hợp đưa vào ứng dụng phịng thí nghiệm kiểm tra đạt độ đặc hiệu với chủng vi sinh vật mục tiêu Các thơng số quy trình PCR khảo sát có khả cho phản ứng PCR tốt Tuy nhiên, trước đưa vào áp dụng phương pháp để xác định loài vi khuẩn Lactobacillus thực phẩm chức phịng thí nghiệm, cần thiết phải đánh giá khả áp dụng phương pháp điều kiện thực tế phịng thí nghiệm với thơng số: mức phát độ chọn lọc Kết khảo sát cho thấy phương pháp có khả phát vi khuẩn Lactobacillus mẫu thực phẩm chức dạng lỏng với mật độ thấp: LOD50 CFU/g, thấp Lb acidophilus (0,7 CFU/g) cao Lb sakei (2,5 CFU/g) LOD50 phương pháp phát loài vi khuẩn Lactobacillus mẫu thực phẩm chức dạng bột dao động từ 0,8 CFU/ g (L reuteri) - 2,7 CFU/ g (L sakei) Thông qua bước tăng sinh canh thang MRS sau 48 điều kiện kỵ khí, vi khuẩn phát phương pháp PCR với số lượng thấp vi khuẩn ban đầu mẫu Phương pháp thể độ chọn lọc tốt phát vi sinh vật mục tiêu khơng cho phản ứng dương tính giả chủng vi sinh vật không mục tiêu PCR phương pháp sử dụng phổ biến để phát nhiều đối tượng, tính đặc hiệu đơn giản chúng Để bắt đầu phản ứng kéo dài khuếch đại đoạn trình tự DNA mục tiêu enzyme Taq polymerase, PCR cần phải có cặp mồi đặc hiệu Thành công phản ứng PCR phụ thuộc lớn vào cặp mồi Có cặp mồi lựa chọn đưa vào nghiên cứu KẾT LUẬN 436 Khi áp dụng phương pháp để phân tích ngẫu nhiên 20 mẫu thực phẩm chức có bổ sung vi khuẩn Lactobacillus, kết cho thấy có số mẫu ghi thơng tin bao khơng với thực tế (xem bảng 5) Như cho thấy, thị trường thực phẩm chức năng, có tỷ lệ không nhỏ sản phẩm ghi nhãn sai thực tế - thể nhu cầu cần phải kiểm soát chặt chẽ để tránh gian lận thương mại Qua nghiên cứu, xây dựng phương pháp phát loài vi khuẩn Lactobacillus thường gặp thực phẩm chức với mức phát hiện: LOD50 CFU/g dạng thực phẩm chức khác Phương pháp đồng thời có độ chọn lọc tốt, khơng cho kết dương tính giả Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 chủng vi khuẩn không mục tiêu Như vậy, quy trình đưa vào ứng dụng phịng thí nghiệm vi sinh vật – Trung tâm Kiểm nghiệm an tồn thực phẩm khu vực phía Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Alimolaei M, Golchin M (2016) An Efficient DNA Extraction Method for Lactobacillus casei, a Difficult-to-Lyse Bacterium Int J Enteric Pathog, doi:10.17795/ijep32472 Amin M, Jorfi M, Khosravi AD, Samarbafzadeh AR, Sheikh AF (2009) Isolation and Identification of Lactobacillus casei and Lactobacillus plantarum from Plants by PCR and Detection of their Antibacterial Activity J Biol Sci, 9(8):810–814 Belfiore C, Raya RR, Vignolo GM (2013) Identification, technological and safety characterization of Lactobacillus sakei and Lactobacillus curvatus isolated from Argentinean anchovies (Engraulis anchoita) Springerplus, 2(1):1–8 Bottari B, et al (2017) Effective identification of Lactobacillus casei group species: genome-based selection of the gene mutL as the target of a novel multiplex PCR assay Microbiology, 163:950–960 Cai H, Rodríguez BT, Zhang W, Broadbent JR, Steele JL (2007) Genotypic and phenotypic characterization of Lactobacillus casei strains isolated from different ecological niches suggests frequent recombination and niche specificity Microbiology, 153(8):2655–2665 FAO (2001) Probiotics in food - Health and nutritional properties and guidelines for evaluation Jt FAO/WHO Expert Consult Eval Heal Nutr Prop Probiotics Food Incl Powder Milk with Live Lact Acid Bact, 1-4:2 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 10 11 12 13 14 Nghiên cứu Y học FAO, WHO (2002) Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food URL: https://www.who.int/foodsafety/fs_management/en Karapetsas A, Vavoulidis E, Galanis A, Sandaltzopoulos R, Kourkoutas Y (2010) Rapid Detection and Identification only by Probiotic Lactobacillus casei ATCC 393 by Multiplex PCR J Mol Microbiol Biotechnol, 18:156–161 NMKL (2009) Protocol for the validation of alternative microbiological methods NMKL, pp.5-12 Prosekov A, Babich O, Bespomestnih K (2013) Identification of Industrially Important Lactic Acid Bacteria in Foodstuffs Foods Raw Mater, 1(2):42–45 Song Y, et al (2000) Rapid identication of 11 human intestinal Lactobacillus species by multiplex PCR assays using group- and species-specific primers derived from the 16S - 23S rRNA intergenic spacer region and its flanking 23S rRNA FEMS Microbiol Lett, 187:167–173 Statista (2014) Probiotic functional foods: global retail sales value by region 2012 2014 URL: www.statista.com/statistics/252941/probiotic-products-salesworldwide-by-region/ Thermo-Fisher-Scientific T042-TECHNICAL Bull NanoDrop Spectrophotometers Thermo Fish Sci URL: doi:10.1002/jobm.19770170116 Torriani S, Felis GE, Dellaglio F (2001) Differentiation of Lactobacillus plantarum, L pentosus, and L paraplantarum by recA gene sequence analysis and multiplex PCR assay with recA gene-derived primers Appl Environ Microbiol, 67(8):3450–3454 Ngày nhận báo: 15/08/2019 Ngày phản biện nhận xét báo: 31/08/2019 Ngày báo đăng: 15/10/2019 437 ... thay đổi khoảng ± 5oC Khảo sát số thơng số quy trình Xác định mức phát LOD50 Với mẫu này, lựa chọn loại mẫu khác nhau: thực phẩm chức dạng bột dạng lỏng Các mẫu thực phẩm chức kiểm tra trước cho... Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Khảo sát mức phát LOD50 độ chọn lọc quy trình Ứng dụng quy trình để kiểm tra số mẫu thực phẩm chức thị trường ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU... khách hàng, thực đề tài nhằm xây dựng phương pháp định danh số loài Lactobacillus thường gặp thực phẩm chức kỹ thuật PCR Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát quy trình xác định lồi vi khuẩn Lactobacillus