Đột biến đồng hợp tử p.C222R gen LDLR trong phả hệ bệnh nhân tăng cholesterol máu có tính chất gia đình

Nghiên cứu được thực hiện nhằm phát hiện đột biến gen LDLR ở các thành viên còn lại trong gia đình bằng kỹ thuật giải trình tự gen. Kết quả: 13/21 thành viên trong gia đình mang đột biến dị hợp tử c.664 T>C (p.C222R) trên exon 4.

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ĐỘT BIẾN ĐỒNG HỢP TỬ p.C222R GEN LDLR TRONG PHẢ HỆ BỆNH NHÂN TĂNG CHOLESTEROL MÁU CĨ TÍNH CHẤT GIA ĐÌNH Hồng Thị Yến1,  , Vũ Đức Anh2, Đỗ Thị Thanh Mai3, Vũ Chí Dũng3, Đặng Thị Ngọc Dung2 Bệnh viện Tim Hà Nội, 2Trường Đại học Y Hà Nội, 3Bệnh viện Nhi Trung ương Bệnh tăng cholesterol có tính chất gia đình (Familial Hypercholesterolemia - FH) bệnh di truyền trội nhiễm sắc thể thường đặc trưng nồng độ LDL-cholesterol (LDL-C) máu tăng cao bất thường Các nghiên cứu phát 1.000 đột biến gen LDLR xác định nhóm bệnh nhân FH với tỷ lệ mắc từ 1:500 đến 1:300 Đột biến gây bệnh xảy chủ yếu gen: LDLR, apoB, PCSK9, LDLRAP1, 80% phát đột biến gen LDLR Hiện bệnh FH chưa quan tâm cách thực sự, dẫn tới chậm trễ điều trị Nhân bệnh nhân nữ tuổi mã số MS15 chẩn đoán FH phát đột biến đồng hợp tử p.C222R gen LDLR, nghiên cứu thực nhằm phát đột biến gen LDLR thành viên cịn lại gia đình kỹ thuật giải trình tự gen Kết quả: 13/21 thành viên gia đình mang đột biến dị hợp tử c.664 T>C (p.C222R) exon Đột biến xuất hai bên gia đình nội ngoại bệnh nhân sở giúp tư vấn điều trị sớm cho thành viên trên, giảm thiểu nguy mắc bệnh lý mạch vành sau Từ khóa: Tăng cholesterol máu có tính chất gia đình, đột biến gen LDLR, exon I ĐẶT VẤN ĐỀ Tăng cholesterol đóng vai trị quan trọng việc hình thành, phát triển nứt vỡ mảng xơ vữa, làm tăng nguy mắc bệnh tim mạch (coronary heart disease: CHD) nguyên phát tử vong Bệnh mạch vành nguyên nhân gây tử vong hàng đầu 10 năm trở lại đây.1 Bệnh tăng cholesterol có tính chất gia đình (Familial Hypercholesterolemia FH) bệnh di truyền trội nhiễm sắc thể thường đặc trưng nồng độ LDL - cholesterol (LDL - C) máu tăng cao bất thường Một số nghiên cứu giới cho thấy 1.000 đột biến gen LDLR xác định bệnh nhân tăng cholesterol có tính chất gia Tác giả liên hệ: Hồng Thị Yến, Bệnh viện Tim Hà Nội Email: yenhoangbvtim@gmail.com Ngày nhận: 23/10/2019 Ngày chấp nhận: 13/11/2019 TCNCYH 125 (1) - 2020 đình Tỷ lệ mắc bệnh ước tính tồn giới từ 1:500 đến 1:300 Đây bệnh di truyền đơn gen, nguyên nhân đột biến gen: LDLR, apoB, PCSK9, LDLRAP1, chủ yếu liên quan đến đột biến gen LDLR với tỷ lệ đột biến 80%.2 - Viện quốc gia y tế lâm sàng Anh (NICE) đưa khuyến cáo sàng lọc phân tầng người thân có quan hệ huyết thống gần với bệnh nhân chẩn đoán lâm sàng FH, giúp giảm tỷ lệ bệnh tật tử vong bệnh tim mạch người FH thơng qua chẩn đốn bệnh sớm quản lý bệnh hiệu quả.5 Trong nghiên cứu này, chúng tơi mơ tả trường hợp điển hình chẩn đoán FH theo tiêu chuẩn Simon Broome phát có đột biến đồng hợp tử exon Tiến hành xác định đột biến gen LDLR thành viên cịn lại gia đình bệnh nhân lập phả TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC hệ để tìm quy luật di truyền Kết có ý nghĩa việc phát sớm, tư vấn dự phòng biến chứng kịp thời cho thành viên gia đình mang gen bệnh II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng - Bệnh nhân chẩn đoán FH theo tiêu chuẩn Simon Broome⁴ xác định có đột biến đồng hợp tử: c.664 T>C (p.C222R) exon gen LDLR - Tiến hành xác định đột biến 21 thành viên cịn lại gia đình bệnh nhân bị FH - Lấy mẫu: 21 thành viên gia đình lấy 4ml máu tĩnh mạch (2ml chống đông EDTA 2ml chống đông heparin) - Một số kỹ thuật thực nghiên cứu: (1) Thực xét nghiệm lipid máu: cholesterol, Triglycerid, HDL - C, LDL - C thành viên gia đình (2) Sử dụng kỹ thuật tách chiết DNA kit Exgene Blood SV mini (3) Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi thiết kế đặc hiệu với exon (4) Giải trình tự gen hệ thống máy ABI 3730 XL so sánh với trình tự exon gen LDLR GeneBank để xác định đột biến thành viên Các thành viên nằm hệ gia đình Xử lý số liệu bệnh nhân Sử dụng phần mềm thống kê y học phù hợp với nghiên cứu Thời gian địa điểm - Nghiên cứu tiến hành từ 1/2016 - 7/2019 Trung tâm Kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học, Trường Đại học Y Hà Nội Phương pháp Đạo đức nghiên cứu Đề tài tuân thủ đạo đức nghiên cứu y sinh Hội đồng Đạo đức Trường Đại học Y Hà Nội chấp thuận theo số 187/ HĐĐĐĐHYHN ngày 20/02/2016 III KẾT QUẢ Chẩn đoán bệnh nhân MS15 Bệnh nhân nữ sinh năm 2011 vào viện xuất nhiều u vàng da vùng mông khớp gối bên, cổ tay khuỷu tay bên (hình 1) Dưới tuổi bệnh nhân xuất u vàng da Hình Hình ảnh u vàng vùng mơng, đầu gối khuỷu tay Lúc vào viện (năm 2014): khám có nhiều u vàng da khớp gối bên, vùng mông, cổ tay khuỷu tay bên Kết xét nghiệm máu thời điểm vào viện: Cholesterol tăng cao (19,1 mmol/l); LDL - C tăng cao (15,4 mmol/l) Bệnh nhân MS15 thỏa mãn tiêu chuẩn Simon Broome [4] chẩn đoán FH Tiến hành giải trình tự gen LDLR bệnh nhân MS15 phát có đột biến đồng hợp tử: c.664 T > C (p.C222R) exon công bố cho đột biến gây bệnh Tiến hành phân tích TCNCYH 125 (1) - 2020 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC xác định loại đột biến exon gen LDLR thành viên lại gia đình Kết điện di kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR Một cặp mồi đặc hiệu sử dụng để khuếch đại exon gen LDLR bệnh nhân MS15 20 thành viên lại gia đình bệnh nhân Kích thước sản phẩm PCR exon – 529 bp Hình Hình ảnh đại diện kết điện di sản phẩm PCR exon gen LDLR Trong đó: 1→ thành viên gia đình, (+): mẫu đối chứng dương, ( - ): mẫu đối chứng âm, MK: thang 100 bp Chúng làm tương tự với thành viên cịn lại Kết PCR cho thấy hình ảnh sản phẩm băng đặc hiệu, đủ điều kiện tiến hành phản ứng giải trình tự Kết xác định đột biến gen LDLR Kết 13/21 thành viên thuộc hệ gia đình bệnh nhân FH có đột biến dị hợp tử gen LDLR; 8/21 thành viên khơng có đột biến exon 4, thành viên khơng có quan hệ huyết thống, 13/21 thành viên có quan hệ huyết thống, bệnh nhân MS15 có đột biến đồng hợp tử loại đột biến: c.664 T > C (p.C222R) exon Đột biến mã hóa sai acid amin Cystein thành Arginin codon 222 (Exon bình thường-mồi ngược) B15-dị hợp tử Exon (mồi xuôi) MS15-đồng hợp tử Exon (mồi ngược) Me15-dị hợp tử Exon (mồi xuôi) Hình Hình ảnh giải trình tự gen LDLR bệnh nhân MS15 thành viên gia đình mang đột biến c.664 T > C (p.C222R) exon TCNCYH 125 (1) - 2020 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình Phả hệ gia đình bệnh nhân FH mã số MS15 Đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng thành viên có đột biến Bảng Một số đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng thành viên có đột biến STT Mã số Bệnh Giới nhân Tuổi U vàng Cholesterol LDL - C 19,1 15,4 16,0 14,4 MS15 Nữ + Me15 Nữ 34 - 6,0 4,4 B15 Nam 34 - 6,5 5,0 I.2 Nam 55 - 8,4 6,8 I.4 Nữ 59 - 9,1 7,6 II.8 Nam 31 - 8,2 6,5 III.6 Nữ - 6,1 4,7 II.6 nam 33 - 5,4 4,4 III.3 nam - 7,0 5,6 10 III.4 Nữ - 5,3 4,5 11 II.2 Nữ 29 - 5,9 4,8 12 III.1 Nữ - 7,3 6,1 13 II.4 Nam 31 - 8,3 6,2 14 III.2 Nữ - 6,9 5,3 Cholesterol TB nhóm dị hợp tử: 7,08 mmol/l (n=13)/đồng hợp tử: 19,1 mmol/l TCNCYH 125 (1) - 2020 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC LDL - C TB nhóm dị hợp tử: 5,68 mmol/l (n=13) /đồng hợp tử: 15,4 mmol/l IV BÀN LUẬN Năm 1938, Carl Müller nhận liên hệ tăng nồng độ cholesterol huyết thanh, xanthomas gân vữa xơ động mạch thành viên nhóm gia đình đưa giả thuyết bệnh di truyền đơn gen.6 Năm 1964, FH xác định bệnh di truyền trội NST số 19 gen LDLR mô tả khác biệt lâm sàng dạng đồng hợp tử dị hợp tử.7 Đột biến gen LDLR dẫn đến việc thiếu thụ thể có chức (LDL receptor) bề mặt tế bào Điều gây giảm hấp thu LDL vào tế bào, đặc biệt vào tế bào gan, từ máu, dẫn đến tăng cholesterol LDL huyết Từ làm suy yếu thải nội hóa LDL, dẫn đến thiếu ức chế tổng hợp cholesterol nội bào tích tụ LDL lịng mạch Xanthoma (từ Hy Lạp: màu vàng) mảng nốt sần bao gồm lắng đọng lipid bất thường tế bào bọt (đại thực bào chứa lipid) collagen Vì cholesterol khơng bị phân hủy, tích tụ tế bào này, gây phản ứng viêm, tạo đại thực bào bọt xốp xơ hóa vùng này.9 Exon mã hóa cho vùng phối tử thụ thể làm trung gian cho tương tác với lipoproteins Đột biến exon đột biến gặp với tỷ lệ cao,5 lý đột biến exon gặp với tỷ lệ cao nhiều nghiên cứu, phần trội trình tự CpG exon này.7 Một lý khác vị trí mã hóa cho đoạn gắn apoB apoE, đoạn vùng gắn phối tử mã hóa cho đoạn gắn apoB.7 Vì nên đột biến vùng chìa khóa thường ảnh hưởng có hại cách rõ rệt đến chức thụ thể LDL, dẫn tới cá thể mang đột biến thường biểu rối loạn lipid điển hình, từ bệnh nhân dễ phát exon exon dài TCNCYH 125 (1) - 2020 Đột biến p.C222R phát nghiên cứu cho gây bệnh công bố nhiều nghiên cứu trước đây.3,4,10 Bệnh nhân MS15 trường hợp đồng hợp tử exon nhận đột biến từ bố mẹ, đột biến cơng bố gây bệnh, biểu mức độ xanthomas gân nhiều vị trí diện rộng với mức độ tăng nặng cholesterol LDL - C máu Cả bố mẹ bệnh nhân có loại đột biến dị hợp tử exon 4, hệ sinh có khả đột biến đồng hợp tử exon 25%, mang đột biến dị hợp tử 50%, 25% lại trường hợp bình thường Thật khơng may mắn, bệnh nhân nghiên cứu đứa đầu đứa lại nhận đột biến từ bố mẹ Mức độ trầm trọng tiên lượng bệnh nhân FH thể đồng hợp tử phụ thuộc mức độ hoạt động thụ thể đánh giá nguyên bào sợi nuôi cấy, < 2% hoạt động bình thường (âm tính) thường khó sống qua 20 tuổi, nhiên nhóm - 25% thụ thể hoạt động bình thường (nhóm thiếu hụt) thường tiên lượng tốt nhóm trên, thường xuất bệnh lý mạch vành năm 30 tuổi.8 Những bệnh nhân dạng đồng hợp tử thường đáp ứng với biện pháp điều trị thông thường thay đổi chế độ sống, điều trị kết hợp nhóm thuốc statin…thường phải cân nhắc cách nghiêm túc vấn đề ghép gan, biện pháp lọc loại bỏ LDL - C khỏi máu.11 Hiện bệnh nhân Ms15 điều trị với statin nhóm ức chế hấp thụ cholesterol chế độ ăn kiểm soát, nhiên mức độ cải thiện đáp ứng chưa tốt thể xét nghiệm cholesterol LDL - C Khuyến cáo biện pháp điều trị tích cực theo dõi sát (siêu âm mạch đánh giá mức độ xơ vữa, xét nghiệm cholesterol, LDL - C…) vô cần thiết quan trọng với bệnh nhân MS15 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ngăn ngừa nhồi máu tim tử vong sớm Kết xét nghiệm cholesterol LDL - C thành viên gia đình hồn tồn phù hợp với kết xác định đột biến dạng dị hợp tử gen LDLR, 13/21 thành viên gia đình có đột biến dị hợp tử exon với mức cholesterol trung bình 7,08 mmol/l mức LDL - C trung bình 5,68 mmol/l Các thành viên chưa chẩn đoán FH thời điểm bắt đầu tiến hành nghiên cứu chưa xét nghiệm kiểm tra số tử exon Bệnh nhân đồng hợp tử có mức tăng cholesterol LDL - C máu nặng với biểu xanthomas gân điển hình lâm sàng, bệnh nhân đáp ứng với thuốc điều trị: statin ezetimibe Tất thành viên gia đình có đột biến ko chẩn đoán FH thời điểm nghiên cứu nên khơng tư vấn điều trị dự phịng Do đó, sàng lọc phân tầng thành viên gia đình bệnh nhân đóng vai trị quan trọng việc phát hiện, tư vấn di truyền điều trị bệnh lipid máu tới thời điểm khơng có chế độ dinh dưỡng chế độ luyện tập phù hợp Việc phát người mang gen bệnh với xét nghiệm tiến hành tư vấn cho thành viên chế độ ăn, sinh hoạt khuyến cáo tới bệnh viện khám, theo dõi Nghiên cứu trường hợp nhấn mạnh tiến y tế lớn, bệnh FH chưa trọng chẩn đoán cách mực, dẫn tới sự chậm trễ điều trị.12 Kết nghiên cứu giới cho thấy có 10% bệnh nhân FH phát Với chẩn đoán sớm điều trị kịp thời, bệnh nhân sống lâu có chất lượng sống tốt Chẩn đốn FH quan trọng khơng tiên lượng bệnh nhân mà cịn có ý nghĩa vô quan trọng thành viên gia đình mắc thể bệnh FH Do đó, tư vấn di truyền sàng lọc phân tầng thành viên gia đình bệnh nhân đóng vai trò quan trọng việc phát điều trị bệnh sớm kể trường hợp thành viên phả hệ khơng có biểu u vàng lâm sàng không tăng lipid máu.12 sớm kể trường hợp thành viên phả hệ biểu u vàng lâm sàng, khơng tăng nhẹ lipid máu V KẾT LUẬN Nghiên cứu xác định đột biến đồng hợp tử exon4 bệnh nhân hầu hết thành viên gia đình dịng họ nội dịng họ ngoại có loại đột biến p.C222R dị hợp Lời cảm ơn Xin chân thành cảm ơn giúp đỡ cộng cán Trung tâm Kiểm chuẩn chất lượng Xét nghiệm Y học, Trường Đại học Y Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Wang Z Ge J Managing hypercholesterolemia and preventing cardiovascular events in elderly and younger Chinese adults: focus on rosuvastatin Clin Interv Aging 2014;9:1 - Varret JM, Abifadel M, Rabes JP et al Genetic heterogeneity of autosomal dominant hypercholesterolemia Clin Genet 2008;73(1):1 - 13 Varret JM Missense Mutation in the LDLR gene: A Wide Spectrum in the Severity of Familial Hypercholesterolemia Intech 2012;55 - 70 Henderson R, O’Kane M, McGilligan V et al The genetics and screening of familial hypercholesterolaemia J Biomed Sci 2016;23:39 DeMott K, Nherera L, Shaw EJ et al (2008) Clinical Guidelines and Evidence Review for Familial hypercholesterolaemia: the TCNCYH 125 (1) - 2020 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC identification and management of adults and children with familial hypercholesterolaemia., National Collaborating Centre for Primary Care and Royal College of General Practitioners London 2008 Müller Carl (1938) Xanthomata, Hypercholesterolemia, Angina Pectoris Acta Medica Scandinavica 1938;95(S89):75 - 84 Khachadurian AK The inheritance of essential familial hypercholesterolemia Am J Med 1964;37:402 - 407 Rader DJ Hobbs HH Disorders of lipoprotein metabolism Harrison’s principles of internal medicine 17th ed., In: Fauci AS, Braunwald E, Kasper DL, Hauser SL, Longo DL, Jameson JL, Loscalzo J, editors, New York: The McGraw - Hill Companies, Inc., 2018;2416 – 2428 Basavaraj A, Jadhav S Dhadwad J Familial hypercholesterolemia presenting as intracranial xanthoma J Assoc Physicians India 2006;54:330 - 332 10 Zhao X, Bu L, Qin S et al Early development of xanthoma and coronary disease in a young female with homozygous familial hypercholesterolemia Int J Cardiol 2014;176(1):15 - 19 11 Jayaram S, Meera S, Kadi S et al An Interesting Case of Familial Homozygous Hypercholesterolemia - A Brief Review Indian J Clin Biochem 2012;27(3):309 - 313 12 Fahed AC Nemer GM Familial hypercholesterolemia: the lipids or the genes? Nutr Metab (Lond) 2011;8(1):23 Summary HOMOZYGOUS MUTATION OF THE LDLR GENE IN THE FAMILLY OF FH PATIENT Familial hypercholesteroleamia (FH) is an autosomal dominant disorder of lipoprotein metabolism characterized by high levels of LDL-cholesterol (LDL-C) in the blood Studies identified more than 1,000 mutations of the LDLR gene in FH patients with incidence rates between 1: 500 and 1: 300 The mutation occurs primarily in: LDLR, apoB, PCSK9, and LDLRAP1 genes, 80% of which the LDLR gene mutation was detected Nowadays, FH disease has not been given much attention, leading to a delay in treatment This study was conducted to detect mutation of the LDLR gene by Sequencing, of all family members of an 8-year-old female patient, code MS15, diagnosed with FH with detected homozygous mutations of p.C222R in LDLR gene Results: 13/21 family members carried heterozygous mutations c.664 T > C (p.C222R) on exon This mutation occurred in both paternal and maternal familiy members This discovery facilitates early counseling and treatment for these family members, minimizing the risk of real coronary diseases Keywords: Familial hypercholesteroleamia, LDLR mutations, exon TCNCYH 125 (1) - 2020 ... kiện tiến hành phản ứng giải trình tự Kết xác định đột biến gen LDLR Kết 13/21 thành viên thuộc hệ gia đình bệnh nhân FH có đột biến dị hợp tử gen LDLR; 8/21 thành viên khơng có đột biến exon 4,... xác định có đột biến đồng hợp tử: c.664 T>C (p.C222R) exon gen LDLR - Tiến hành xác định đột biến 21 thành viên cịn lại gia đình bệnh nhân bị FH - Lấy mẫu: 21 thành viên gia đình lấy 4ml máu tĩnh... 4, thành viên khơng có quan hệ huyết thống, 13/21 thành viên có quan hệ huyết thống, bệnh nhân MS15 có đột biến đồng hợp tử loại đột biến: c.664 T > C (p.C222R) exon Đột biến mã hóa sai acid