Bài viết xác định đặc điểm phân tử và kiểu gen của chủng Pneumocystis jirovecii ở bệnh nhân HIV/AIDS mắc viêm phổi đang điều trị tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương. Đối tượng và phương pháp: nghiên cứu tiến cứu, mô tả cắt ngang 31 bệnh nhân HIV/AIDS mắc viêm phổi nhiễm P. jirovecii được khẳng định bằng nội soi phế quản và realtime PCR từ 01 - 2014 đến 12 - 2017. Kết quả và kết luận: đặc điểm phân tử của chủng P. jirovecii: phân tích nucleotid không tìm thấy biến đổi ở các locus β-TUB, CYB, DHFR, DHPS, trong đó locus SOD chỉ có duy nhất hai vị trí biến đổi, biến đổi nhiều nhất tập trung ở 3 locus mt26S, 26S và ITS1.
Tạp chí y - dợc học quân số 7-2019 ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ VÀ KIỂU GEN CỦA Pneumocystis jirovecii Ở BỆNH NHÂN HIV/AIDS MẮC VIÊM PHỔI TẠI BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT ĐỚI TRUNG ƯƠNG TỪ 2014 - 2017 Nguyễn Tuấn Anh1; Đỗ Quyết2; Nguyễn Huy Lực3 TÓM TẮT Mục tiêu: xác định đặc điểm phân tử kiểu gen chủng Pneumocystis jirovecii bệnh nhân HIV/AIDS mắc viêm phổi điều trị Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương Đối tượng phương pháp: nghiên cứu tiến cứu, mô tả cắt ngang 31 bệnh nhân HIV/AIDS mắc viêm phổi nhiễm P jirovecii khẳng định nội soi phế quản realtime PCR từ 01 - 2014 đến 12 - 2017 Kết kết luận: đặc điểm phân tử chủng P jirovecii: phân tích nucleotid khơng tìm thấy biến đổi locus β-TUB, CYB, DHFR, DHPS, locus SOD có hai vị trí biến đổi, biến đổi nhiều tập trung locus mt26S, 26S ITS1 Phân bố kiểu gen: kiểu gen tìm thấy chủng P jirovecii gây bệnh Việt Nam gồm: mt26S - 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23; ITS1 - A6, B7, B8, B9, B10; SOD - SOD6 Phân bố kiểu gen P jirovecii: locus ITS1 có 14 kiểu gen - A1, A2, A3, A4, A5, A6, B1, B2, B3, B7, B8, B9, B10 Locus mt26S có 14 kiểu gen - 2, 7, 8, 11, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 Locus 26S có kiểu gen - 1, 11, 12, 13 Trong đó, locus SOD có kiểu gen - SOD1 SOD6, locus CYB, β-TUB, DHPS DHFR locus có kiểu gen, số kiểu gen phân bố chủng Pneumocystis jirovecii Việt Nam * Từ khóa: Viêm phổi; Pneumocystis jirovecii; HIV/AIDS; Kiểu gen; Locus ĐẶT VẤN ĐỀ Pneumocystis jiroveci sinh vật gây bệnh hội bất thường nguyên gây viêm phổi (VP) nặng với tỷ lệ tử vong cao người bị suy giảm miễn dịch [1] Đến năm 1980, VP P jirovecii không phổ biến chủ yếu gây bệnh đối tượng mắc hội chứng suy giảm miễn dịch sử dụng thuốc ức chế miễn dịch kéo dài, đặc biệt hóa trị ung thư [2] Tuy nhiên, với đại dịch HIV/AIDS, P jirovecii lên nguyên gây bệnh phổ biến đối tượng mắc HIV/AIDS nước công nghiệp phát triển Trước đây, chưa có phác đồ dự phòng đặc hiệu cho P jirovecii, nguyên tìm thấy > 60% bệnh nhân (BN) nhiễm HIV ước tính > 80% số BN có CD4 200 bị nhiễm P jirovecii [11, 12] Sau sử dụng phác đồ dự phòng P jirovecii bậc bậc vào đầu năm 1990, tỷ lệ nhiễm P jirovecii BN HIV/AIDS giảm đáng kể, tiếp tục giảm sau điều trị thuốc kháng retrovirus hoạt tính cao (HAART) vào năm 1990 [9, 10] Tuy nhiên, P jirovecii tiếp tục nguyên gây bệnh phổ biến với tỷ lệ mắc bệnh tử vong đáng kể Trong thời đại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương Học viện Quân y Bệnh viện Quân y 103 Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tuấn Anh (dranhnhtd@gmail.com) Ngày nhận bài: 12/07/2019; Ngày phản biện đánh giá báo: 19/08/2019 Ngày báo c ng: 27/08/2019 28 Tạp chí y - dợc học qu©n sù sè 7-2019 cơng nghiệp hóa, P jirovecii mối đe dọa phổ biến BN nhiễm HIV/AIDS [9], đặc biệt BN bị nhiễm HIV lý khác không đến sở y tế thăm khám thường xuyên Do P jirovecii khó phát hiện, nhiễm trùng loài nấm chưa chẩn đoán nước phát triển [3] Việc nghiên cứu đặc điểm phân tử kiểu gen chủng P jirovecii gây bệnh Việt Nam cần thiết, giúp nâng cao hiểu biết đặc điểm gây bệnh loài nấm Trên sở đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu nhằm: Xác định đặc điểm phân tử kiểu gen P jirovecii liên quan đến VP BN HIV/AIDS Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương từ tháng - 2014 đến 12 - 2017 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 31 bệnh phẩm dịch rửa phế quản BN HIV/AIDS mắc VP nhiễm P jirovecii thu thập từ - 2014 đến 12 - 2017 khẳng định kỹ thuật realtime PCR Phương pháp nghiên cứu * Thiết kế nghiên cứu: mơ tả cắt ngang * Quy trình nghiên cứu: - Xét nghiệm xác định kiểu gen P jirovecii: + Vật liệu: vật liệu dùng cho PCR tinh sản phẩm PCR (Hãng Qiagen, Mỹ), vật liệu dùng cho giải trình tự gen (Hãng Applied Biosystem, Mỹ) + Primers dùng cho giải trình tự gen [13] (bảng 1): Gen đích Tên mồi mt26S mt26S-F GATGGCTGTTTCCAAGCCCA mt26S-R GTGTACGTTGCAAAGTACTC 26S rDNA ITS1 β-TUB SOD CYB DHPS 26S-F GAAGAAATTCAACCAAGC 26S-R ATTTGGCTACCTTAAGAG ITS1-F CTGCGGAAGGATCATTAGAAA ITS1-R CGCGAGAGCCAAGAGATC β-Tubulin-F TCATTAGGTGGTGGAACGGG β-Tubulin-R ATCACCATATCCTGGATCCG MnSODFw GGGTTTAATTAGTCTTTTTAGGCAC MnSODRw CATGTTCCCACGCATCCTAT CytbFw CCCAGAATTCTCGTTTGGTCTATT CytbRw AAGAGGTCTAAAAGCAGAACCTCAA Ahum Bhs’ DHFR Trình tự nucleotid (5’-3’) GCGCCTACACATATTATGGCCATTTTAAATC Kích thước (bp) 347 426 204 309 652 638 318 ACCTTCCCCCACTTATATC FR208 GCAGAAAGTAGGTACATTATTACGAGA FR1018 AAGCTTGCTTCAAACCTTGTGTAACGCG 610 29 Tạp chí y - dợc học quân số 7-2019 + Thiết bị: máy PCR ProLex (Applied Biosystem, Mỹ), máy điện di MuPis (Nhật), máy giải trình tự nucleotid 3130 sequencer (Applied Biosystem, Mỹ) + Kỹ thuật xác định kiểu gen: theo phương pháp Céline Maitte CS [13], thành phần phản ứng PCR nhân dòng đoạn ADN 08 locus, bao gồm 0,5 µl mồi, X Qiagen Mutiplex PCR Kit µl ADN khn Chu trình nhiệt bắt đầu bước kích hoạt HotStarTaq DNA Polymerase nhiệt độ 95oC 15 phút, lặp lại 35 chu kỳ nhiệt độ 940C 30 giây, 60oC 45 giây 720C phút Sản phẩm PCR sau điện di kiểm tra gel agarose 1,5% + Kỹ thuật giải trình tự gen: sản phẩm PCR sau tinh Qiagen PCR purification kít sử dụng làm khn cho phản ứng PCR sequencing Phản ứng PCR sequencing thực sử dụng kít BigDye™ Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, Mỹ) theo hướng dẫn nhà sản xuất Cặp mồi xuôi ngược dùng cho gen mt26S, 26S, ITS1, SOD, β-TUB, DHPS DHFR sử dụng để giải trình tự hệ thống máy ABI 3130 (Applied Biosystems) + Kỹ thuật xác định kiểu gen: trình tự nucleotid locus sau so sánh với trình tự gốc mt26S, 26S, ITS1, SOD, β-TUB, DHPS DHFR Ngân hàng Dữ liệu Gen (GenBank - NCBI), phân tích phần mềm ATGC 7.2 (Nhật) để tìm khác biệt di truyền chủng P jirovecii nghiên cứu với chủng P jirovecii công bố * Xử lý số liệu: phần mềm Stata 10.0 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết phân tích trình tự nucleotid 08 locus Bảng 2: Kết xác định biến thể 08 locus 31 chủng P jirovecii Mẫu Loại mẫu 30 Kiểu gen xác định locus mt26S 26S β-TUB ITS1 CYB SOD DHFR DHPS DPQ β-TUB A3 CYB1 SOD Wt Wt DPQ β-TUB A3 CYB1 SOD Wt Wt DPQ 11 β-TUB A3 CYB1 SOD Wt Wt DPQ β-TUB A2 CYB1 SOD Wt Wt DPQ β-TUB A6 CYB1 SOD Wt Wt DPQ β-TUB A1 CYB1 SOD Wt Wt DPQ β-TUB A1 CYB1 SOD Wt Wt DPQ 12 β-TUB A1 CYB1 SOD Wt Wt Tạp chí y - dợc học quân sù sè 7-2019 DPQ 12 β-TUB B7 CYB1 SOD Wt Wt 10 DPQ 15 13 β-TUB A2 CYB1 SOD Wt Wt 11 DPQ 16 11 β-TUB A2 CYB1 SOD Wt Wt 12 DPQ 17 β-TUB A5 CYB1 SOD Wt Wt 13 DPQ 18 β-TUB A2 CYB1 SOD Wt Wt 14 DPQ 19 β-TUB B8 CYB1 SOD Wt Wt * 15 DPQ β-TUB ND CYB1 SOD Wt Wt 16 DPQ 11 β-TUB B9 CYB1 SOD Wt Wt 17 DPQ 20 12 β-TUB B2 CYB1 SOD Wt Wt 18 DPQ 17 12 β-TUB A1 CYB1 SOD Wt Wt 19 DPQ 21 β-TUB B CYB1 SOD Wt Wt 20 DPQ 11 12 β-TUB B CYB1 SOD Wt Wt 21 DPQ 21 β-TUB B1 CYB1 SOD Wt Wt 22 DPQ β-TUB A4 CYB1 SOD Wt Wt 23 DPQ 22 β-TUB A2 CYB1 SOD Wt Wt 24 DPQ 23 β-TUB B3 CYB1 SOD Wt Wt 25 DPQ 12 β-TUB ND CYB1 SOD Wt Wt 26 DPQ 21 β-TUB B10 CYB1 SOD Wt Wt 27 DPQ 13 β-TUB ND CYB1 SOD Wt Wt 28 DPQ 22 β-TUB B3 CYB1 SOD Wt Wt 29 DPQ 11 β-TUB A2 CYB1 SOD Wt Wt 30 DPQ 11 β-TUB B3 CYB1 SOD Wt Wt 31 DPQ 12 12 β-TUB A3 CYB1 SOD Wt Wt * * Phân tích trình tự 08 locus nucleotid từ 31 chủng P jirovecii cho thấy khơng có biến đổi locus β-TUB, CYB, DHFR DHPS, locus SOD tìm thấy đột biến vị trí C/110 A/215, phân loại thành kiểu gen SOD6 Số liệu phân tích cho thấy thay đổi phổ biến tập trung locus mt26S, 26S ITS1, phân thành kiểu gen khác Trong nghiên cứu này, chúng tơi khơng tìm thấy đột biến số nghiên cứu Maitte CS [13], Hauser CS [6], Estevesm CS [5], Ma CS [7] Costa CS [4] Tuy nhiên, tìm thấy số kiểu gen phân bố chủng P jirovecii Việt Nam Kết cho thấy chủng P jirovecii có đa dạng trình tự nucleotid genome chúng, điều tìm thấy nghiên cứu nghiên cứu khác giới 31 T¹p chÝ y - dợc học quân số 7-2019 Kiu gen tìm thấy chủng P jirovecii gây bệnh Việt Nam Bảng 3: Các biến thể tìm thấy chủng P jirovecii nghiên cứu Locus Kiểu gen Mt26S 15 CGAA/54-57, C/85, C/248, A/288 16 GAT/54-57, A/85, C/248, A/288 17 AAAA/54-57, A/85, T/248, A/288 18 AGTG/54-57, A/85, C/248, A/288 19 GAAA/54-57, C/85, C/248, A/288 20 GCG/54-57, T/85, C/248, A/288 21 GAA/54-57, A/85, C/248, A/288 22 GCAA/54-57, T/85,C /248, A/288 23 GAAA/54-57, A/85, T/248, A/288 A6 T/2, TTT/8-10, A/11, T/17, T/22, TC/46-47, 10xT/54-62, GAGG/71-72, TTA/111-113 B7 T/2, TT/8-10, A/11, T/17, T/22, TC/46-47, 10xT/54-62, GAGG/71-72, TTA/111-113 B8 C/2, TT/8-10, C/11, T/17, C/22, TC/46-47, 9xT/54-62, GAGG/71-72, TTA/111-113 B9 C/2, TT/8-10, A/11, T/17, T/22, TC/46-47, 10xT/54-62, GAGG/71-72, TTA/111-113 B10 T/2, TT/8-10, C/11, T/17, C/22, TC/46-47, 10xT/54-62, GAGG/71-72, TTA/111-113 ITS1 SOD Vị trí nucleotid thay đổi C/110, A/215 Xác định kiểu gen P jirovecii dựa phân loại Maitte CS [13], Hauser CS [6], Esteves CS [5], Ma CS [8], Kazanjian CS [7] Costa CS [4] Biến thể locus mt26S, ITS1 SOD có liên quan tới kiểu gen phân bố chủng P jirovecii Việt Nam Lý đa dạng di truyền chủng P jirovecii khoảng cách địa lý, khí hậu, yếu tố vật chủ, tiến hóa di truyền tiếp xúc với chất ức chế Thêm vào thời gian điều trị dự phòng cho BN HIV/AIDS thuốc kháng virut hoạt tính cao (HAART) phác đồ điều trị khác dẫn tới hình thành đột biến, biến đổi tiến triển mặt lâm sàng nguy tử vong cho BN 32 Tạp chí y - dợc học qu©n sù sè 7-2019 Phân bố kiểu gen chủng P jirovecii gây bệnh Việt Nam Số liệu cho thấy locus ITS1 có 14 kiểu gen, chủng mang kiểu gen A6, Bảng 4: Phân bố kiểu gen chủng P jirovecii gây bệnh Việt Nam dựa locus A1 A3, kiểu gen có chủng, B3 có chủng, kiểu gen B có chủng, kiểu Số kiểu gen Phân bố chủng mang kiểu gen ITS1 14 A1 (4) A2 (6) A3 (4) A4 (1) A5 (1) A6 (1) B (2) B1 (1) B2 (1) B3 (3) B7 (1) B8 (1) B9 (1) B10 (1) ND (3) CYB CYB1 (31) Locus (5) (6) (2) 11 (3) 12 (2) 15 (1) Mt26S 14 16 (1) 17 (2) 18 (1) 19 (1) 20 (1) 21 (3) 22 (2) 23 (1) (20) 26S 11 (3) 12 (6) 13 (2) SOD1 (30) SOD β-TUB Β-TUB (31) DHPS DHPSwt (1) DHFR DHFRwt (1) SOD6 (1) gen lại phân bố chủng Biến đổi di truyền locus mt26S chia thành 14 kiểu gen, số chủng phân bố nhiều kiểu gen 7, 12, 2, kiểu gen lại có phân bố từ - chủng Locus 26S có kiểu gen, có tới 20 chủng mang kiểu gen 1; chủng mang kiểu gen 6; kiểu gen 11 13 mang chủng Locus SOD có kiểu gen chính, kiểu gen SOD1 chiếm đa số (30/31 chủng), có chủng mang kiểu gen SOD6 Các locus CYB, β-TUB, DHPS, DHFR có kiểu gen Như vậy, 31 chủng P jirovecii gây bệnh Việt Nam có mức độ biến đổi di truyền lớn, chủ yếu locus mt26S, 26S SOD KẾT LUẬN Nghiên cứu 31 BN HIV/AIDS nhiễm P jirovecii cho thấy: - Biến đổi trình tự nucleotid nhiều 31 chủng P jirovecii tìm thấy locus ITS1, mt26S, 26S SOD, đa dạng di truyền có liên quan tới đa dạng kiểu gen - Một số dạng đột biến phân bố chủng P jirovecii Việt Nam - Khơng tìm thấy đột biến locus CYB, β-TUB, DHPS, DHFRI 31 chủng P jirovecii Kết khác biệt so với nghiờn cu trc õy 33 Tạp chí y - dợc häc qu©n sù sè 7-2019 TÀI LIỆU THAM KHẢO sulfa or sulfone prophylaxis exposure in AIDS patients J Infect Dis 2000, 182 (2), pp.551-557 Nguyễn Kim Thư TCD4 mối liên quan với nhiễm trùng hội bệnh nhân HIV/AIDS điều trị nội trú Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương Tạp chí Y học thực hành 2011, 842, tr.112-116 Ma L et al Pneumocystis carinii dihydropteroate synthase but not dihydrofolate reductase gene mutations correlate with prior trimethoprim-sulfamethoxazole or dapsone use J Infect Dis 1999, 180 (6), pp.1969-1978 Lê Mạnh Hùng Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ, lâm sàng trường hợp viêm phổi nhiễm trùng người nhiễm HIV Thành phố Hồ Chí Minh Luận án Tiến sỹ Y học 2008 Mocroft A et al AIDS across Europe, 1994 - 1998: The EuroSIDA study Lancet 2000, 356 (9226), pp.291-296 Nguyễn Tiến Lâm Căn nguyên nhiễm trùng hội bệnh nhân HIV/AIDS điều trị nội trú Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương Tạp chí Y học thực hành 2011, 781, tr.135-138 Costa M.C et al Genetic characterization of the dihydrofolate reductase gene of Pneumocystis jirovecii isolates from Portugal J Antimicrob Chemother 2006, 58 (6), pp.1246-1249 Esteves F et al Population structure of Pneumocystis jirovecii isolated from immunodeficiency virus-positive patients Infect Genet Evol 2010, 10 (2), pp.192-199 Hauser P.M et al Typing of Pneumocystis carinii f sp hominis by singlestrand conformation polymorphism of four genomic regions J Clin Microbiol 1997, 35 (12), pp.3086-3091 Kazanjian P et al Pneumocystis carinii mutations are associated with duration of 34 10 Palella F.J Jr et al Declining morbidity and mortality among patients with advanced human immunodeficiency virus infection HIV outpatient study investigators N Engl J Med 1998, 338 (13), pp.853-860 11 Selik R.M, Starcher E.T, Curran J.W Opportunistic diseases reported in AIDS patients: Frequencies, associations, and trends AIDS 1987, (3), pp.175-182 12 Crum N.F et al Comparisons of causes of death and mortality rates among HIV-infected persons: Analysis of the pre-, early, and late HAART (highly active antiretroviral therapy) eras J Acquir Immune Defic Syndr 2006, 41 (2), pp.194-200 13 Maitte C, Leterrier M, Le Pape P, Miegeville M, Morio F Multilocus sequence typing of Pneumocystis jirovecii from clinical samples: How many and which loci should be used? J Clin Microbiol 2013, 51 (9), pp.28432849 ... điểm phân tử kiểu gen P jirovecii liên quan đến VP BN HIV/AIDS Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương từ tháng - 2014 đến 12 - 2017 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 31 bệnh phẩm... đặc điểm phân tử kiểu gen chủng P jirovecii gây bệnh Việt Nam cần thiết, giúp nâng cao hiểu biết đặc điểm gây bệnh lồi nấm Trên sở đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu nhằm: Xác định đặc điểm phân. .. quân số 7-2019 Phân bố kiểu gen chủng P jirovecii gây bệnh Việt Nam Số liệu cho thấy locus ITS1 có 14 kiểu gen, chủng mang kiểu gen A6, Bảng 4: Phân bố kiểu gen chủng P jirovecii gây bệnh Việt Nam