các chủng Salmonella trên các nhóm thực 1

các chủng Salmonella trên các nhóm thực

1 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Theo dõi tổng kết nhiều năm nhà khoa học giới xác định nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm ăn uống nhiễm vi khuẩn gây bệnh thực phẩm, vi khuẩn gây bệnh lao, sốt thương hàn dịch tả… Ở Canada hàng năm có khoảng triệu người bị ngộ độc thức ăn, tính trung bình theo dân số 11 người có người mắc bệnh Ở Mỹ có khoảng 13 triệu người ngộ độc thức ăn năm 18 người có người mắc bệnh thực phẩm, 85% số ca ngộ độc thức ăn nguyên nhân vi sinh [16] Ngộ độc thực phẩm vi sinh ngày gia tăng nhiều nước, Salmonella tác nhân đứng hàng thứ hai sau Campylobacter Do đó, quy định an tồn vệ sinh thực phẩm Việt Nam hầu giới khơng cho phép có diện chủng Salmonella có mặt thực phẩm mà khơng phân biệt chủng độc lực hay không người [13, 14] Đến có khoảng 2500 kiểu huyết Salmonella xác định số có khả gây bệnh cho người Thực vậy, Salmonella vi khuẩn phân bố rộng tự nhiên Chúng có khả nhiễm vào công đoạn trình chế biến bảo quản thực phẩm, thực phẩm tươi sống Nhiều nghiên cứu gần cho thấy khơng phải tất dịng Salmonella nhiễm thực phẩm có khả gây nguy hiểm cho người Ngược lại có tỉ lệ Salmonella thực phẩm có khả gây ngộ độc, dòng tập trung chủ yếu loài phụ S enterica I Nhưng phương pháp để phân tích Salmonella thực phẩm xác định đến giống khơng phân biệt lồi hay kiểu huyết tạo hàng rào cản thương mại cho nhà sản xuất, kinh doanh thực phẩm làm hạn chế việc trao đổi thực phẩm quốc gia khu vực Tuy nhiên, để phân biệt Salmonella có khả gây bệnh với Salmonella khác việc làm khó khăn, chưa có phương pháp hay chuẩn mực để phân biệt nhóm với Hướng đến mục tiêu nghiên cứu tìm phương pháp phân biệt Salmonella có khả gây bệnh với Salmonella lành tính, khóa luận tập trung vào nội dung khảo sát, đánh giá tỉ lệ lây nhiễm tương đối loài phụ kiểu huyết Salmonella nhiễm thực phẩm 1.2 Mục đích Nhằm khảo sát thành phần loài phụ thành phần kiểu huyết chủng Salmonella nhiễm nhóm thực phẩm thịt gia súc, thịt gia cầm, trứng, thủy hải sản loại rau 1.3 Nội dung Khảo sát tỉ lệ diện chủng Salmonella nhóm thực phẩm tỉ lệ xuất tương đối Salmonella enterica I Salmonella spp thực phẩm phương pháp nuôi cấy phân lập truyền thống Xác định thành phần loài phụ Salmonella phân bố nhóm thực phẩm Xác định thành phần kiểu huyết Salmonella nhóm thực phẩm Đề tài có ý nghĩa đóng góp phần nhỏ vào việc giúp nhà khoa học quan quản lý thực phẩm đánh giá vấn đề chất lượng thực phẩm địa bàn thành phố Hồ Chí Minh nhìn nhận khách quan mối nguy hiểm thật Salmonella Do thời gian kinh phí thực đề tài có hạn nên đánh giá khởi đầu tỉ lệ nhiễm định kiểu huyết loài phụ Salmonella giúp ngăn ngừa cách hiệu ngộ độc thực phẩm Các kết thu thành bước đầu tiếp cận với công tác nghiên cứu phịng thí nghiệm nên nội dung chắn cịn nhiều thiếu sót khóa luận khơng thể tránh khỏi khiếm khuyết Rất mong nhận nhận xét, đánh giá quý báu đóng góp chân thành q thầy cơ, anh chị bạn để khóa luận xúc tích hơn, hoàn thiện Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đại cƣơng Salmonella 2.1.1 Giới thiệu chung Salmonella Cho đến phát có khoảng 500 lồi vi sinh vật khác gây bệnh thương hàn phó thương hàn cho người gia súc Salmonella gây nhiều bệnh truyền nhiễm cho động vật phó thương hàn lợn, bệnh sẩy thai cừu ngựa, bệnh bạch lỵ gà, bệnh thương hàn chuột, bệnh viêm ruột bò Những bệnh kể Salmonella gây người ta gọi bệnh truyền nhiễm ngun phát, ngồi phát Salmonella chất tiết động vật lành [8, 11, 16] Những Salmonella thường gây ngộ độc thường gặp S typhimurium, S choleraesuis S enteritidis [12, 22] Do việc chuẩn đốn xác loại trực khuẩn động vật có ý nghĩa quan trọng mặt bảo vệ sức khỏe, vệ sinh cơng cộng, dự phịng bệnh truyền nhiễm [11, 16] 2.1.1.1 Đặc điểm hình thái Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, tộc Salmonelleae giống Salmonella Salmonella vi khuẩn hình gậy, mập, ngắn, trực khuẩn gram âm, hai đầu trịn, kích thước 0,4 – 0,6 x – m, sống kị khí tùy nghi, khơng hình thành giáp mơ nha bào, có khả di động nhờ lơng mao có khoảng đến 12 lơng mao chung quanh thân, trừ S gallinarum S pullorum gây bệnh cho gia cầm Salmonella dễ dàng nuôi cấy 37oC môi trường ni cấy bình thường, chúng phát triển khuẩn lạc có đường kính – mm, trơn, sáng đồng [1, 11, 13] Hình 2.1 Vi khuẩn Salmonella 2.1.1.2 Phân loại Salmonella theo loài theo kiểu huyết Hiện theo phân loại hệ thống Viện Pasteur giới, Trung tâm Kiểm soát ngăn ngừa dịch bệnh Mỹ CDC (Control and Prevent Disease Center), giống Salmonella chia làm hai loài: S enterica S bongori Trong S bongori gồm tất kiểu huyết (serotype) loài phụ số V, S enterica chia làm loài phụ đánh số: I, II, IIIa, IIIb, IV VI (Bảng 2.1) Các lồi lồi phụ phân biệt phản ứng sinh hóa Trong lồi phụ có nhiều kiểu huyết [7, 18, 29] Cho đến xác định 2463 kiểu huyết thuộc giống Salmonella Theo hệ thống Kauffman White, kiểu huyết chia dựa kháng nguyên thân O, kháng nguyên tiêm mao H kháng nguyên bề mặt Vi Phần lớn kiểu huyết đặt tên theo công thức kháng nguyên, số khác đặt tên riêng Enteritidis (S enteritidis), Typhi (S typhi), Paratyphi (S paratyphi), Typhimurium (S typhimurium)…[1, 15, 21, 32] Bảng 2.1 Phân loại Salmonella theo loài theo kiểu huyết [28 ] Loài S enterica Loài phụ Số kiểu huyết 1454 S enterica salamae (II) 489 S enterica arizonae (IIIa) 94 S enterica diarizonae (IIIb) 324 S enterica houtenae (IV) 70 S enterica indica (VI) S bongori S enterica enterica (I) 12 (V) 20 Loài phụ S enterica I chiếm đa số (99%), tìm thấy hầu hết động vật máu nóng Lồi phụ chiếm 59% (1454/2463) tổng số kiểu huyết Salmonella có khả xâm nhập gây nhiễm cao cho người động vật máu nóng, lồi phụ khác động vật máu lạnh môi trường Như có tới 41% (1009/2463) số kiểu huyết khơng phân lập từ bệnh phẩm người, tỉ lệ có ý nghĩa để quan chức xem xét sữa đổi tiêu chuẩn hành Salmonella thực phẩm tạo điều kiện thuận lợi cho nhà sản xuất tiêu thụ thực phẩm [3, 28, 33] 2.1.1.3 Sự phân bố Salmonella Salmonella phân bố rộng rãi tự nhiên thường xuyên phân lập từ ống tiêu hóa động vật người bị nhiễm trùng Ngoài ra, chúng phân lập từ đất, khơng khí, nước sơng hồ, nước biển thực phẩm [13, 15] 2.1.1.4 Đặc điểm ni cấy Salmonella phát triển nhiệt độ 5oC – 45oC, điều kiện tối thích cho sinh trưởng chúng 37oC điều kiện cực đoan nhiệt độ thấp cao Salmonella khả di động Ở 5oC chúng ngừng phát triển, 60oC sống khoảng giờ, 70oC bị chết sau 10 phút, độ sơi nước bị chết tức [10] pH thích hợp cho tăng trưởng nằm khoảng trung tính 6,8 – 7,2 Khoảng pH dành cho phát triển vi khuẩn 4,1 – thực phẩm acid thấp, rau cải vi khuẩn không phát triển pH từ 5,5 – 5,7 Độ ẩm 0,94% hay nồng độ muối vượt q 8% ức chế hồn tồn tăng trưởng Salmonella [17, 25] 2.1.1.5 Đặc điểm sinh hóa Salmonella có đặc tính sinh hóa chủ yếu mà dựa vào người ta định hướng phân biệt với vi khuẩn đường ruột khác Các chủng Salmonella sinh acid lên men glucose, mannitol, dulcitol không lên men lactose (trừ S arizona) sucrose, khả tách amine từ trytophan Chúng khơng sinh indol acetoin phân giải urea Phần lớn chủng sinh hydrogen sulfide (H 2S) tách carboxyl (de-carboxylate) từ ornithine lysine Chúng chịu nhiệt chịu đuợc số hóa chất brilliant green, sodium lauryl sulfite, selenite, sodium tetrathionate Những chất dùng để chọn lọc chúng từ mẫu thực phẩm nước [1, 21] 2.1.1.6 Cấu trúc kháng nguyên độc tố a Cấu trúc kháng nguyên Khi nghiên cứu huyết học vi khuẩn Salmonella, người ta đặc biệt ý đến đặc tính kháng nguyên vi khuẩn Salmonella có loại kháng nguyên kháng nguyên O (kháng nguyên thân – somatic), kháng nguyên H (kháng nguyên tiêm mao – flagella) kháng nguyên Vi (kháng nguyên bề mặt – capsule) [11, 31, 37] Kháng nguyên O: có 60 loại ký hiệu số 1, 2, …12, bao bọc bề mặt vi khuẩn tạo thành lớp không Chia kháng nguyên O thành 34 nhóm A, B, C1, C2, C3, D1, D2, E1, E2, E3, E4, F, G1, G2, H, I, J, L, M, N, O, P, Q, R, S, T,U, V, W, X, Y, Z, 49, 50 Mỗi nhóm huyết gồm số loại vi khuẩn có kháng nguyên O cấu tạo thành phần định Ví dụ nhóm A, S paratyphi A, kháng ngun O gồm phần (1), 2, 12 thành phần có khơng, thành phần thành phần đặc biệt dùng để phân biệt mặt huyết học với nhóm khác Kháng nguyên O gồm chuỗi lipoplysaccharide-protein bề mặt tế bào Loại kháng nguyên coi nội độc tố vi khuẩn, có đặc tính ổn định nhiệt 100oC giờ, alcol Ngoài kháng nguyên O cịn có tác dụng ngăn cản bạch huyết cầu qua mao mạch làm thay đổi tạm thời thẩm thấu mao quản [3, 7, 11] Kháng nguyên H: có chất protein, bền vững so với kháng nguyên O Là loại protein không bền nhiệt, bị diệt 70oC hay tác dụng cồn, enzyme tiêu hủy protein, chịu formol Kháng nguyên H gắn liền với roi vi khuẩn nên kháng nguyên diện chủng có tiêm mao Kháng nguyên tiêm mao H có thành phần khác tùy vào kiểu huyết Kháng nguyên H có chứa pha: Pha pha đặc hiệu chất kháng nguyên đặc hiệu loài vi khuẩn tạo thành, bao gồm 28 loại kháng nguyên tiêm mao, biểu thị chữ La tinh: a, b, c, g, m…[11, 31] Pha pha không đặc hiệu: nhiều loại Salmonella chứa pha này, gồm loại biểu thị số Ả rập 1, 2, 3, 4, 5, hay chữ La tinh e, n, x… Đến người ta có khuynh hướng khơng đặt tên chủng Salmonella nữa, mà biểu thị công thức kháng nguyên O kháng nguyên H, ví dụ S 6, 8: r – 1, [11, 31] Kháng thể kháng kháng nguyên H ngưng kết vi khuẩn roi chúng Sự ngưng kết tạo thành mảng kết tụ, chúng bị tách yếu tố có khả cắt roi vi khuẩn Kháng ngun H khơng có tác dụng gây bệnh, khơng gây miễn dịch, đặc hiệu cho loài vi khuẩn dựa vào kháng nguyên H để phân loại phương pháp huyết [7] Kháng nguyên Vi: kháng nguyên nằm kháng nguyên O nơi biểu độc tố, cấu tạo polysaccharide vỏ vách tế bào, thường kết hợp với tính gây độc chun biệt cho vật chủ Nó ức chế biểu kháng nguyên O phát triển nhiều, ổn định với nhiệt độ, cồn HCl Kháng nguyên xác định kiểu huyết thanh: S typhi, S paratyphi S dublin Kháng nguyên Vi số chủng S typhi đặc biệt có sức đề kháng tốt nhiệt độ cao chủng Salmonella thông thường khác (Heyns ctv 1959; Euzeby, 1997) [18] Khi kháng nguyên Vi bị S typhi chết Pili Hình 2.2 Vị trí kháng ngun Salmonella Tất loại kháng nguyên sử dụng để chuẩn đốn bệnh thương hàn phịng xét nghiệm cận lâm sàng Kháng nguyên O biểu chủ yếu lúc bệnh khởi phát Kháng nguyên H biểu mạnh lúc bệnh kết thúc Kháng nguyên Vi biểu mạnh người mang vi khuẩn mãn tính Bảng 2.2 Cấu trúc kháng nguyên số lồi Salmonella [19, 21] Nhóm vi Loại vi khuẩn Kháng nguyên thân O khuẩn Kháng nguyên tiêm mao H Pha A… S paratyphi A B… S typhimurium S abortivo equina Pha 1, 2, 12 a (1, 5) 1, 4, (5), 12 i 1, e, n, x 1, 4, 5, 12 S choleraesuis 1, S typhi suis 6, c 1, 6, d 1, 9, 12, Vi g, m (1, 7) S dublin 1, 9, 12 g, p S gallinarum 1, 9, 12 - - S pullorum D (c) S typhosa C1 6, 1, 9, 12 d 1, S enteritidis S typhi 9, 12, (Vi) ( ): biến đổi, -: diện từ biến đổi trực khuẩn thể b Độc tố đƣờng ruột Salmonella sản sinh hai loại nội độc tố độc tố ruột gây xung huyết, mụn loét độc tố thần kinh gây triệu chứng thần kinh [5, 17] 2.1.1.7 Sức đề kháng vi khuẩn Salmonella có sức đề kháng tốt, sống ngồi thể thời gian lâu Trong đất nước tồn từ – tuần, phân – tháng, nước đá hay thực phẩm đơng lạnh tồn – tháng [11] Ở môi trường bên vi khuẩn Salmonella sống lâu, ruột bánh mì sống 25 đến 30 ngày, bơ từ – ngày, mát 36 ngày, mỡ đến tháng, thực phẩm bảo quản lạnh nhiệt độ - 18oC chúng sống vài tháng [10] Tuy nhiên lại mẫn cảm với thuốc sát trùng như: phenol 5%, cloramin 1%, clorua thủy ngân 0,2% chúng bị chết sau vài phút [10] 2.1.2 Các đặc điểm gây bệnh Salmonella 2.1.2.1 Điều kiện gây bệnh Không phải tất người tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm Salmonella bị ngộ độc Bởi Salmonella gây ngộ độc cho người phải có điều kiện: Thức ăn phải nhiễm lượng lớn vi khuẩn sống, khoảng 106 – 107 để vượt qua tính acid cao dày cạnh tranh với quần thể vi sinh vật tự nhiên ruột có khả biệu bệnh Cịn lượng tế bào khơng đủ lớn bị thể thải ngồi khơng gây biểu bệnh [15, 17] Vi khuẩn thức ăn vào thể phát triển chết tiết lượng lớn độc tố [17, 30] Tùy thuộc vào sức chống đỡ thể chủ Trẻ em người già, người ốm yếu, chức gan suy yếu bệnh máu làm giảm sức đề kháng bệnh [ 17, 30] Chủng Salmonella: khơng phải chủng Salmonella nhiễm vào có biểu bệnh mà số như: S typhi, S paratyphi, S enteritidis… gây bệnh cho người, biểu bệnh khác tùy kiểu huyết [15, 26, 28] 2.1.2.2 Cơ chế gây bệnh Vi khuẩn vào ruột phát triển đó, sau theo hệ thống bạch huyết tuần hoàn gây nên tình trạng nhiễm trùng huyết Do thời kỳ đầu, lấy máu người bệnh truyền cấy phát vi khuẩn Vi khuẩn gây viêm ruột, phá hỏng tế bào niêm mạc ruột, tiết độc tố Độc tố thấm qua thành ruột vào máu Ngoài ra, vi khuẩn hệ tuần hoàn tiết nội độc tố Nội độc tố chủ yếu tác động hệ thần kinh vận động huyết quản, làm giảm độ bền thành mao quản giảm chức điều tiết thân nhiệt thể Như vậy, Salmonella gây bệnh độc tố ruột (enterotoxin) có lẽ cytotoxin neurotoxin [17] 2.1.2.3 Các kiểu bệnh vi khuẩn Salmonella Các kiểu huyết Salmonella thường có biểu bệnh với triệu chứng lâm sàng khơng giống tóm tắt Hình 2.3 Viêm ruột: S enteritidis S typhimurium thường gây bệnh viêm dày, viêm ruột, bệnh gây tình trạng vệ sinh thực phẩm Biểu bệnh đặc trưng buồn nôn, đau bụng tiêu chảy Vi khuẩn không vào máu Bệnh thường khu trú ruột [1, 2, 10, 34] 10 Nhiễm trùng máu: S choleraesuis nguyên nhân gây nhiễm trùng máu, vi khuẩn vào thể đường miệng, xâm nhập vào máu gây bệnh, khu trú phổi, xương, màng não Ví dụ xương, gây biến chứng bệnh viêm khớp kinh niên, xảy vào – tuần sau bắt đầu phát bệnh mạnh mẽ [1, 2, 6] Các bệnh gây ngộ độc độc tố S enteritidis, S typhimurium, S choleraesuis khơng sốt, gây ói mửa Cơ thể trở lại bình thường điều trị, khơng gây thành dịch.[2, 34] Bệnh thương hàn: S typhi gây bệnh sốt thương hàn, S paratyphi A, S paratyphi B (S schottmuleri) gây bệnh phó thương hàn Triệu chứng bệnh giống sốt thương hàn, mức độ nhẹ Bệnh phát triển thành dịch người bệnh nằm viện lâu [2, 6, 18] Enterobacteriacea e Salmonella S choleraesuis Nhiễm trùng máu S enteritidis S typhimurium Viêm dày S paratyphi A, B, C Phó thương hàn S typhi Thương hàn Hình 2.3 Các chủng Salmonella biểu bệnh thƣờng gặp 2.1.2.4 Nguồn lây nhiễm Thực phẩm bị nhiễm bệnh nguồn gây bệnh dễ dàng nhanh vi khuẩn phát triển nhanh thực phẩm, thực phẩm chưa nấu chín, rau tươi, quả, rau salát, bánh bao, bánh rán, sữa chưa trùng, nhuyễn thể, tôm, cua sống khu vực có nguồn nước thải nhiễm cao nguồn phân người động vật Các loại thực phẩm có nguy bị nhiễm Salmonella cao thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng sản phẩm từ trứng, thủy hải sản Nguồn gây nhiễm loại thực phẩm thường phân người động vật, nhiễm gián tiếp hay trực tiếp [13, 15, 16] 24 phát quang vàng xanh đen, vật khác diện vết bôi phân biệt dễ dàng với Salmonella chúng bắt thuốc nhuộm yếu hay không nhuộm thiếu hình dạng phù hợp Phương pháp linh động, nhanh, kết phát sau vài Phần VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1 Thời gian địa điểm thực 3.1.1 Thời gian thực Thời gian thực đề tài từ 01/03/2005 đến 01/08/2005 3.1.2 Địa điểm thực Nơi lấy mẫu: Mẫu lấy chợ địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh chợ Bà Chiểu chợ Nguyễn Đình Chiểu quận Phú Nhuận, chợ Tân Phú quận Thủ Đức… Nơi tiến hành phân tích thí nghiệm: Phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học Mơi trường Trung tâm Phân tích Hóa sinh – Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh 3.2 Vật liệu 3.2.1 Dụng cụ thiết bị 25 3.2.1.1 Dụng cụ Bình tam giác, cốc, ống đong hình trụ 50, 100, 500 ml, pipetman, ống nghiệm, hộp đĩa petri, que cấy vịng, que cấy thẳng, đèn cồn, bao PE vơ trùng, kéo cắt, pince kim loại, khay kim loại, lame, màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 m, bơm hút chân khơng 3.2.1.2 Thiết bị Cân phân tích, máy đo pH, máy dập mẫu, kính hiển vi, nồi hấp autoclave, tủ sấy, tủ cấy an toàn sinh học, tủ ấm 37oC, bể điều nhiệt 42oC, tủ lạnh 3.2.2 Hóa chất mơi trƣờng 3.2.2.1 Hóa chất Các loại kháng huyết O đa giá, hỗn hợp OMA, OMB kháng huyết đơn nhóm A, B, C, D, E Các loại kháng huyết Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh sản xuất Các loại carbonhydrate sorbitol, dulcitol Cồn 70o, cồn 96o nước cất 3.2.2.2 Môi trƣờng Bao gồm loại môi trường thông dụng để nuôi cấy, phân lập khẳng định Salmonella thực phẩm Môi trường Buffered Pepton Water (BPW): sử dụng để tiền tăng sinh Salmonella diện mẫu Thành phần môi trường gồm: peptone 10 g/l, NaCl g/l, Na2HPO4.12H2O g/l, KH2PO4 1,5 g/l, hấp khử trùng 121oC 15 phút, pH sau khử trùng Môi trường Saline Peptone Water (SPW): peptone g/l, NaCl 8,5 g/l, hấp khử trùng 121oC 15 phút, pH sau khử trùng 7,0 0,2 Môi trường Rapparport Vassiliadis broth (RV): sử dụng để tăng sinh chọn lọc cho Salmonella Thành phần môi trường sau: peptone đậu nành 4,5 g/l, MgCl2.6H2O 29 g/l, NaCl g/l, K2HPO4 0,6 g/l, malachite green oxalate 0,036 g/l, pH 5,5 0,2 Phân phối 10ml môi trường vào ống nghiệm Hấp khử trùng 115 oC 15 phút Môi trường Xylose Lysine Desoxycholate agar (XLD): dùng để phân lập Salmonella Thành phần XLD bao gồm: cao nấm men g/l, L – Lysine HCl g/l, 26 xylose 3,75 g/l, lactose 7,5 g/l, sucrose 7,5 g/l, sodium desoxycholate g/l, NaCl g/l, Na2S2O5 6,8 g/l, ammonium ferrous (II) citrate 0,8 g/l, phenol red 0,8 g/l, agar 18 g/l, pH cuối 7,4 0,2 Đun sôi môi trường, không hấp Để nguội đến 50oC Môi trường đỗ đĩa petri để khô trước cấy Môi trường Tryptic Soya Agar (TSA): sử dụng để bảo quản phục hồi giống vi sinh vật q trình thí nghiệm Thành phần TSA gồm: tryptone 15 g/l, peptone đậu nành g/l, agar 15 g/l Đun nóng để hịa tan agar cốc bercher, phân phối vào ống nghiệm khoảng – ml Hấp khử trùng 121oC 15 phút, pH sau khử trùng 7,3 Sau để nguội khoảng 50 – 60oC để thạch nghiêng Môi trường Triple Sugar Iron Agar (TSI) gồm môi trường có thành phần sau: peptone 20 g/l, NaCl g/l, lactose 10 g/l, sucrose 10 g/l, glucose g/l, Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O 0,2 g/l, Na2S2O3 0,2 g/l, phenol red 0,025 g/l, agar 13 g/l môi trường gồm thành phần sau: cao thịt 3g/l, cao nấm men 3g/l, peptone 15g/l, proteose peptone g/l, glucose g/l, lactose 10 g/l, sucrose 10 g/l, FeSO4 0,2 g/l, NaCl g/l, Na2S2O3 0,3 g/l, phenol red 0,024 g/l, agar 12 g/l Phân phối vào ống nghiệm, ống ml Hấp khử trùng 121oC 15 phút, sau đợi nguội khoảng 50 – 60oC để nghiêng phần thạch sâu đáy ống cao 2,5 cm Môi trường Mannitol phenol red broth: sử dụng để thử nghiệm khả lên men đường mannitol Salmonella Thành phần môi trường bao gồm: peptone thịt g/l, peptone đậu nành g/l, mannitol 10 g/l, NaCl g/l, phenol red 0,018 g/l, pH sau khử trùng 7,4 0,2 Môi trường Lysine Decarboxylate broth (LDC): sử dụng để thử nghiệm khả sinh enzyme lysine decarboxylase Salmonella Thành phần môi trường sau: peptone g/l, cao nấm men g/l, dextrose g/l, L-Lysine HCl 10 g/l, ferric (II) ammonium citrate 0,5 g/l, Na2S2O5 0,04 g/l, bromocresol purple 0,016g/l, pH 6,7 Môi trường Urea broth: dùng để thử nghiệm khả thủy phân urea Salmonella Thành phần môi trường sau: cao nấm men 0,1 g/l, KH2PO4 9,1 g/l, Na2HPO4 9,5 g/l, urea 20 g/l, phenol red 0,08 g/l, pH 6,8 Môi trường Sorbitol phenol red broth: sử dụng để thử nghiệm khả lên men đường sorbitol Salmonella Thành phần mơi trường gồm có: peptone thịt 27 g/l, peptone đậu nành g/l, sorbitol 10 g/l, NaCl g/l, phenol red 0,018 g/l, pH sau trùng 7,4 0,2 Môi trường Dulcitol phenol red broth: sử dụng để thử nghiệm khả lên men đường dulcitol Salmonella Thành phần mơi trường gồm có: peptone thịt g/l, peptone đậu nành g/l, dulcitol 10 g/l, NaCl g/l, phenol red 0,018 g/l, pH sau trùng 7,4 0,2 Môi trường Malonate broth: sử dụng để thử nghiệm khả sử dụng malonate Salmonella Thành phần môi trường bao gồm: ammonium sulphate g/l, dipotassium phosphate 0,6 g/l, monopotassium phosphate 0,4g/l, sodium chloride g/l, sodium malonate g/l, bromthymol blue 0,025 g/l Phân phối ml vào ống nghiệm Hấp 115oC 10 phút pH cuối 6,7 0,2 Môi trường Lactose agar 1%: sử dụng để cảm ứng tạo enzyme - galactosidase dùng thử nghiệm ONPG Thành phần môi trường sau: lactose 10 g/l, peptone g/l, cao thịt g/l, NaCl 10 g/l, agar 15 g/l Đĩa giấy ONPG: sử dụng để thử nghiệm ONPG khả tổng hợp enzyme - galactosidase Mỗi đĩa phân phối vào ống nghiệm chứa 0,5ml nước cất vô trùng Đĩa giấy ONPG sản xuất hãng Biorad dạng thương phẩm 3.2.3 Vật liệu thí nghiệm Mẫu thực phẩm sử dụng thí nghiệm bao gồm loại thực phẩm tươi sống thu từ chợ khu vực thành phố Hồ Chí Minh Các mẫu thu đại diện cho nhóm thực phẩm: thịt gia súc, thịt gia cầm, trứng, thủy hải sản rau trình bày Bảng 3.1 Bảng 3.1 Các nhóm thực phẩm đƣợc sử dụng thí nghiệm Nhóm mẫu Số lƣợng Loại mẫu 38 Thịt heo, thịt bò, nem thịt, chả chiên, chả lụa, thực phẩm Thịt gia súc sản phẩm từ thịt huyết, lòng… Thịt gia cầm 10 Thịt gà, thịt vịt sản phẩm thịt huyết, lòng… Trứng 19 Trứng vỏ trứng gà, vịt, cút 28 Thủy hải sản 27 Các loại cá, mực, tôm, sò, nghêu, ốc… Rau 21 Các loại rau ăn sống rau nấu canh rau diếp cá, rau thơm, rau xà lách, rau muống, rau tồn ô… 3.3 Phƣơng pháp 3.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu bảo quản mẫu Mẫu thu chợ chứa bao nylon hộp nhựa sạch, phải bảo quản mẫu nước đá vận chuyển đến phịng thí nghiệm để phân tích Nếu chưa phân tích, mẫu bảo quản tủ lạnh - 5oC 24 – 36 giờ, riêng mẫu rau bảo quản ngăn mát 3.3.2 Phƣơng pháp bảo quản chủng vi sinh vật Các chủng Salmonella phân lập từ thực phẩm bảo quản ống nghiệm thạch nghiêng TSA để dùng bước thử nghiệm sinh hóa phản ứng ngưng kết kháng huyết Từ ống thạch nghiêng TSA giai đoạn phục hồi, lấy sinh khối que cấy vịng cấy chuyển sang ống nghiệm thạch nghiêng TSA để nhân giống bảo quản giống, ủ 37oC qua đêm Bảo quản ống vi khuẩn giống tủ lạnh – 4oC đến sử dụng tiếp vào thí nghiệm Thời gian bảo quản từ – tháng Hết hạn bảo quản, chủng hoạt hóa cấy chuyển Mỗi ống chủng phải có ghi thơng tin như: tên, ký hiệu mẫu, ký hiệu chủng, ngày, số lần cấy chuyển 3.3.3 Phát Salmonella spp thực phẩm phƣơng pháp ni cấy Quy trình thực nghiên cứu dựa phương pháp tiêu chuẩn NMLK 79 – 5th, 2001 Hiệp hội phân tích thực phẩm Bắc Âu (Nordic committee on food analysis) 3.3.3.1 Tiền tăng sinh Về nguyên tắc trộn phần mẫu với phần môi trường nước peptone đệm (BPW) Cân 25 g mẫu bao PE vơ trùng hịa lượng mẫu với 225 ml nước peptone đệm, đồng mẫu máy dập mẫu từ 15 – 30 giây (tùy thuộc vào loại mẫu) Ta thu dung dịch huyền phù ủ 37 1oC từ 18 – 24 [16, 19] 3.3.3.2 Tăng sinh chọn lọc Lắc để trộn dịch tiền tăng sinh cấy chuyển 0,1 ml dung dịch tiền tăng sinh sang 10 ml môi trường Rappaport Vassiliadis broth (RV), ủ ống nghiệm bể 29 điều nhiệt 42 0,2oC 24 Nếu tăng sinh dương mơi trường đục đều, lắng cặn tạo váng mỏng, môi trường bị biến đổi sang màu xanh dương nhạt ban đầu [5, 8, 19] a b Hình 3.1 Biểu sinh hóa đặc trƣng mơi trƣờng chọn lọc RV a: Môi trường RV trước cấy b: Môi trường RV sau nuôi cấy 3.3.3.3 Phân lập Từ môi trường tăng sinh chọn lọc RV, dùng que cấy vòng thực kỹ thuật cấy phân lập từ khuẩn dịch tăng sinh chọn lọc sang đĩa môi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng XLD cho tạo khuẩn lạc tách rời Lật ngược đĩa ủ 37 1oC 24 Lý để lựa chọn mơi trường có tính chọn lọc tương đối yếu, muốn tạo thuận lợi cho việc tăng sinh tối đa khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella, vừa ức chế việc mọc vi khuẩn khác hạn chế sai sót Nhờ vào mơi trường phân lập vừa phối hợp tăng sinh làm tăng khả phát chủng vi khuẩn mong muốn Trên mơi trường XLD khuẩn lạc Salmonella điển hình trong, nhuốm đỏ thay đổi chất thị mơi trường, phần lớn có tâm đen giữa, lớn, bóng 30 Bao nhận thấy vùng môi trường đỏ lớn nhỏ, đặc biệt Salmonella mọc dày môi trường [20] Kinh nghiệm điều quan trọng việc nhận biết khuẩn lạc Salmonella Hình thái chúng nhiều có biến động, không theo kiểu kháng huyết mà cịn theo khác biệt lơ mơi trường sử dụng Hình 3.2 Mơi trường XLD trước cấy Hình 3.3 Hình dạng khuẩn lạc Salmonella XLD 3.3.3.4 Phục hồi 31 Chọn – khuẩn lạc điển hình hay nghi ngờ đĩa cấy giai đoạn phân lập chuyển sang môi trường rắn không chọn lọc Tryptic Soy Agar (TSA) để nhân sinh khối phục hồi chủng vi sinh vật phân lập từ thực phẩm để tiến hành thực thí nghiệm tiếp theo, ủ 37 1oC 18 – 24 3.3.3.5 Khẳng định thử nghiệm sinh hóa Những khuẩn lạc nghi ngờ phải kiểm tra khẳng định thử nghiệm sinh hóa kháng huyết Cần tiến hành kiểm tra khẳng định thử nghiệm sinh hóa phù hợp Theo chúng tơi để kiểm tra định tính Salmonella xác định đến giống Salmonella, khơng cần đến lồi, kết số thử nghiệm sinh hóa phù hợp hoàn toàn đủ để đến kết luận khẳng định Trong trường hợp phản ứng huyết mang tính hỗ trợ [1] Trong khóa luận này, chúng tơi tiến hành thử nghiệm bốn phản ứng sinh hóa môi trường TSI, Mannitol phenol red broth, Urea phenol red both LDC broth Thử nghiệm môi trường TSI: Thử nghiệm khả lên men lactose, glucose sinh khí H2S Dùng que cấy nhọn lấy sinh khối từ môi trường phục hồi TSA cấy đâm sâu vào phần thạch sâu, cấy ria bề mặt phần thạch nghiêng Ủ 37 oC 24 giờ, Salmonella sinh trưởng làm môi trường phần thạch nghiêng chuyển thành màu đỏ (kiềm), phần thạch sâu chuyển thành màu vàng (acid) chúng không lên men lactose mà lên men glucose Đa số dòng Salmonella có khả tạo thành khí H2S nên môi trường xuất vệt đen bên thạch hay bề mặt thạch nghiêng Vặn nút ống nghiệm lỏng để trì điều kiện hiếu khí ủ thạch nghiêng tránh tạo thành nhiều H 2S Có thể thấy tượng sinh qua tượng làm vỡ thạch môi trường môi trường bị đẩy lên tạo khoảng không bên đáy ống nghiệm [9] Thử nghiệm khả lên men đường mannitol: dùng que cấy vòng lấy sinh khối từ môi trường TSA sang môi trường Mannitol phenol red broth Ủ 37oC 24 giờ, Salmonella lên men sinh acid từ mannitol nên môi trường sau nuôi cấy chuyển sang màu vàng [20] Thử nghiệm khả tổng hợp enzyme lysine decarboxylase: dùng que cấy vịng chuyển sinh khối từ mơi trường TSA sang môi trường LDC broth Ủ 37 oC 32 24 giờ, Salmonella cho phản ứng kiềm có biểu LDC dương tính mơi trường có sinh khối chuyển sang màu tím màu xanh Thử nghiệm khả phân giải urea: dùng que cấy vòng lấy sinh khối từ môi trường TSA cấy chuyển sang môi trường Urea phenol red broth Ủ 37 oC 24 giờ, Salmonella không thủy giải urea nên không làm chuyển màu mơi trường Những vi sinh vật có phản ứng urea dương tính làm tăng pH mơi trường nên sau nuôi cấy môi trường chuyển sang màu đỏ hồng Các biểu sinh hóa Salmonella spp trình bày Bảng 3.2 Bảng 3.2 Biểu sinh hóa Salmonella spp Môi trƣờng Phản ứng Biểu môi trƣờng Phần nghiêng đỏ/phần sâu vàng TSI H2 S +/- Có hay khơng có vệt đen Sinh khí +/- Có hay khơng có sinh khí Lysine Decaroxylase broth + Chuyển từ xanh sang tím Mannitol phenol red broth + Chuyển từ đỏ sang vàng, đục Urea phenol red broth - Không đổi màu a b 33 Hình 3.4 Mơi trƣờng thử nghiệm sinh hóa Salmonella spp trƣớc sau nuôi cấy vi sinh vật a- Môi trƣờng trƣớc nuôi cấy: Môi trường TSI, Môi trường Mannitol phenol red broth, Môi trường LDC, Môi trường Urea phenol red broth b- Môi trƣờng sau nuôi cấy: Môi trường TSI, Môi trường Mannitol phenol red broth, Môi trường LDC, Môi trường Urea phenol red broth 3.3.3.6 Khẳng định Salmonella kháng huyết Thông thường tiến hành thử phản ứng ngưng kết với kháng huyết O đa giá đơn giá để xác định chủng phân lập Salmonella Chia lame kính làm hai phần: phần nhỏ giọi nước muối sinh lý để làm đối chứng âm nhỏ giọt huyết Lấy sinh khối vi sinh vật từ môi trường TSA khuyếch tán vào giọt huyết thanh, làm tương tự với giọt nước muối sinh lý, tán Chờ 30 – 60 giây quan sát đen, phản ứng ngưng kết kháng huyết xảy khơng có tượng ngưng kết giọt nước muối sinh lý hỗn hợp đục sữa, cịn giọt huyết có tượng ngưng kết, xuất kết tủa dạng hạt dạng sợi, dịch huyết lại suốt Sau trình thử nghiệm phản ứng sinh hóa phù hợp có ngưng kết huyết O đa giá đơn giá kết luận Salmonella dương tính 25 g mẫu Chỉ làm phản ứng với kháng huyết sau xác định sinh hóa Thực phản ứng ngưng kết với kháng huyết O đa giá vi khuẩn Salmonella trước, sau làm kháng huyết đơn giá sau Hình 3.5 Phản ứng khơng ngƣng kết xảy giọt nƣớc muối sinh lý 33 Hình 3.6 Phản ứng ngƣng kết xảy giọt huyết 34 Quy trình phân tích định tính Salmonella spp thực phẩm phương pháp ni cấy truyền thống tóm tắt Hình 3.7 1- Bước đồng mẫu 225 ml môi trường tiền tăng sinh BPW 25g mẫu thực phẩm 2- Tiền tăng sinh Ủ 37oC/18 - 24h Hút 0,1ml canh khuẩn tiền tăng sinh 3- Tăng sinh chọn lọc 10ml môi trường RV o Ủ 42 C/24h Ủ bể điều nhiệt 42 0,2oC/18 – 24h đục 4- Phân lập Môi trường XLD, khuẩn lạc tâm đen, suốt Ủ 37oC/24h Chọn khuẩn lạc nghi ngờ 5- Phục hồi Môi trường TSA Ủ 37oC/18-24h 6- Thử nghiệm sinh hóa Huyết học Ủ 37oC qua đêm TSI Mannitol LDC Urea Thử nghiệm ngưng kết kháng huyết Giọt huyết Nước muối O đa giá đơn giá giọt huyết thanh, mẫu đối chứng âm giọt nước muối sinh lý sinh khối vi sinh vật từ môi trường TSA khuyếch tán vào tán Hình 3.7 Sơ đồ tóm tắt quy trình phát Salmonella thực phẩm 35 3.3.4 Xác định S enterica I Sau xác định Salmonella spp., tiến hành nhân giống phục hồi giống vi sinh vật cách sử dụng que cấy vòng lấy sinh khối từ ống nghiệm chứa chủng Salmonella bảo quản – 4oC cấy chuyển sang ống nghiệm môi trường thạch nghiêng TSA mới, ủ 37oC 18 – 24 Để xác định S.enterica I, chúng tơi tiến hành thí nghiệm bốn phản ứng sinh hóa đặc trưng sau: Thử nghiệm khả sử dụng malonate: dùng que cấy vòng chuyển sinh khối từ môi trường TSA sang môi trường Malonate broth, phải sử dụng thêm ống môi trường malonate khơng chứa vi khuẩn làm đối chứng, loại môi trường không cấy chuyển qua màu xanh dương (màu biểu kết dương tính) Đem ủ 37oC qua đêm S enterica I không sử dụng malonate nên môi trường giữ nguyên màu xanh lục ban đầu Thử nghiệm ONPG: sử dụng que cấy vịng lấy sinh khối từ mơi trường TSA cấy chuyển sang môi trường Lactose agar ủ 37oC qua đêm, sau cấy vi khuẩn que cấy vịng từ mơi trường Lactose agar sang ống nghiệm chứa 0,5 ml nước cất có chứa đĩa ONPG Đem ủ 37oC đọc kết Lồi phụ S enterica I khơng có hệ enzyme - galactosidase nên cho phản ứng âm tính, khơng làm đổi màu dung dịch, dung dịch có màu trắng đục Các lồi phụ khác S enterica làm nước cất chuyển sang màu vàng Phản ứng dương tính ống nghiệm dung dịch có màu vàng thường sau giờ, số vi khuẩn cho phản ứng nhanh sau – 10 phút Thử nghiệm khả lên men đường sorbitol: lấy sinh khối từ mơi trường TSA, dùng que cấy vịng cấy chuyển sang môi trường Sorbitol phenol red broth Biểu dương tính mơi trường chuyển từ màu đỏ sang màu vàng môi trường đục Thử nghiệm khả lên men đường dulcitol: chuyển vi khuẩn que cấy vịng từ mơi trường TSA sang mơi trường Dulcitol phenol red broth Đậy nút không chặt ủ 37oC qua đêm Phản ứng dương tính mơi trường chuyển từ màu đỏ sang màu vàng xuất sinh khối, đơi có bọt khí bề mặt mơi trường 36 Bốn phản ứng sinh hóa đặc trƣng S enterica I đƣợc thể Bảng 3.3 Hình 3.8 Bảng 3.3 Biểu sinh hóa S enterica I Môi trƣờng Phản ứng Biểu môi trƣờng Malonate broth - Không đổi màu, giữ màu xanh lục ban đầu O.N.P.G - Không đổi màu, môi trường trắng đục Dulcitol phenol red broth + Chuyển từ màu đỏ sang màu vàng Sorbitol phenol red broth + Chuyển từ màu đỏ sang màu vàng a b Hình 3.8 Môi trƣờng xác định S enterica I trƣớc sau nuôi cấy vi sinh vật a- Môi trƣờng trƣớc nuôi cấy: Môi trường Malonate broth, Thử nghiệm O.N.P.G., Môi trường Sorbitol phenol red broth, Môi trường Dulcitol phenol red broth b- Môi trƣờng sau nuôi cấy: Môi trường Malonate broth, Thử nghiệm O.N.P.G., Môi trường Sorbitol phenol red broth, Môi trường Dulcitol phenol red broth 37 3.3.5 Nhận định kết Quy trình kiểm nghiệm cho phép phân tích định tính Salmonella giúp kết luận có hay khơng có Salmonella diện 25 g mẫu, khơng cho phép phân biệt dòng Salmonella diện mẫu Nếu phản ứng sinh hóa phù hợp với đặc tính Salmonella spp phiến kính có ngưng kết, kết luận Salmonella Nếu phản ứng sinh hóa phù hợp phản ứng huyết lại âm tính, kết luận vi khuẩn khơng ngưng kết thuộc Salmonella Một số điểm cần lưu ý xác định Salmonella có thực phẩm phương pháp truyền thống: Cần tiến hành phân tích số lượng cần thiết đơn vị mẫu sở tính xác mang tính chất thống kê Các mơi trường thạch đĩa vừa chuẩn bị ức chế vài chủng Salmonella, nên chuẩn bị thạch đĩa ngày trước đem sử dụng Cần bảo quản đĩa bóng tối nhiệt độ phòng lúc sử dụng Sau quan sát thấy có khuẩn lạc Salmonella nghi vấn môi trường thạch chọn lọc, phải tiến hành test sinh hóa huyết tất khuẩn lạc cần phải lấy số lượng lớn để trì độ nhạy phương pháp Đơi vi khuẩn Salmonella cho thử nghiệm sinh hóa khơng điển H2S âm tính, dulcitol âm tính, hay malonate dương tính, phân lập Cần lưu ý việc xếp loại khuẩn lạc Salmonella phân lập phụ thuộc hoàn toàn vào cấu trúc kháng nguyên không riêng vào đặc điểm sinh hóa Đơi ống nghiệm chứa mơi trường dịch thể malonate không cấy vi khuẩn chuyển qua màu xanh để lâu, cần sử dụng ống chứa môi trường dịch thể malonate để làm đối chứng Vì Salmonella nhóm chứa dịng gây bệnh nguy hiểm Do cần tuân thủ triệt để biện pháp an toàn làm việc với chủng Salmonella dùng làm đối chứng dương thao tác chủng phân lập Các môi trường hay mẫu vật sau nuôi cấy cần phải hấp khử trùng cẩn thận trước rửa ... n, x 1, 4, 5, 12 S choleraesuis 1, S typhi suis 6, c 1, 6, d 1, 9, 12 , Vi g, m (1, 7) S dublin 1, 9, 12 g, p S gallinarum 1, 9, 12 - - S pullorum D (c) S typhosa C1 6, 1, 9, 12 d 1, S... lồi Salmonella [19 , 21] Nhóm vi Loại vi khuẩn Kháng nguyên thân O khuẩn Kháng nguyên tiêm mao H Pha A… S paratyphi A B… S typhimurium S abortivo equina Pha 1, 2, 12 a (1, 5) 1, 4, (5), 12 i 1, ... capsule) [11 , 31, 37] Kháng nguyên O: có 60 loại ký hiệu số 1, 2, ? ?12 , bao bọc bề mặt vi khuẩn tạo thành lớp không Chia kháng nguyên O thành 34 nhóm A, B, C1, C2, C3, D1, D2, E1, E2, E3, E4, F, G1,