phenol red broth, 7. Môi trường LDC, 8. Môi trường Urea phenol red broth
3.3.3.6 Khẳng định Salmonella bằng kháng huyết thanh
Thông thường tiến hành thử phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh O đa giá và đơn giá để xác định chủng phân lập là Salmonella.
Chia lame kính sạch làm hai phần: một phần nhỏ một giọi nước muối sinh lý để làm đối chứng âm và nhỏ một giọt huyết thanh. Lấy một ít sinh khối vi sinh vật từ môi trường TSA khuyếch tán vào giọt huyết thanh, làm tương tự với giọt nước muối sinh lý, tán đều. Chờ 30 – 60 giây quan sát trên nền đen, phản ứng ngưng kết kháng huyết thanh xảy ra khi không có hiện tượng ngưng kết ở giọt nước muối sinh lý hỗn hợp vẫn đục đều như sữa, còn ở giọt huyết thanh thì có hiện tượng ngưng kết, xuất hiện các kết tủa dạng hạt hoặc dạng sợi, dịch huyết thanh thì lại trong suốt .
Sau khi quá trình thử nghiệm phản ứng sinh hóa phù hợp và có sự ngưng kết huyết thanh O đa giá và đơn giá thì kết luận Salmonella dương tính trong 25 g mẫu.
Chỉ làm phản ứng với kháng huyết thanh sau khi đã xác định sinh hóa. Thực hiện phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh O đa giá của vi khuẩn Salmonella
trước, sau đó mới làm kháng huyết thanh đơn giá sau.
Quy trình phân tích định tính Salmonella spp. trong thực phẩm bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống được tóm tắt trong Hình 3.7
Hình 3.7 Sơ đồ tóm tắt quy trình phát hiện Salmonella trong thực phẩm
25g mẫu thực phẩm
225 ml môi trường tiền tăng sinh BPW 1- Bước đồng nhất mẫu
2- Tiền tăng sinh Ủ 37oC/18 - 24h
3- Tăng sinh chọn lọc Ủ 42o
C/24h
Hút 0,1ml canh khuẩn tiền tăng sinh 10ml môi trường RV
Ủ ở bể điều nhiệt 42 0,2oC/18 – 24h đục
4- Phân lập Ủ 37o
C/24h Môi trường XLD, khuẩn lạc tâm đen, trong suốt
5- Phục hồi Ủ 37o
C/18-24h
Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ
6- Thử nghiệm sinh hóa Huyết thanh học
Ủ 37o
C qua đêm Môi trường TSA
Urea TSI Mannitol LDC Giọt huyết thanh Nước muối
Thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh O đa giá và đơn giá ở giọt huyết thanh, và mẫu đối chứng âm là giọt nước muối sinh lý.
3.3.4 Xác định S. enterica I
Sau khi đã xác định được Salmonella spp., tiến hành nhân giống và phục hồi giống vi sinh vật bằng cách sử dụng que cấy vòng lấy một ít sinh khối từ ống nghiệm chứa chủng Salmonella đã được bảo quản ở 3 – 4oC cấy chuyển sang các ống nghiệm môi trường thạch nghiêng TSA mới, ủ ở 37o
C trong 18 – 24 giờ.
Để xác định S.enterica I, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên bốn phản ứng sinh hóa đặc trưng như sau:
Thử nghiệm khả năng sử dụng malonate: dùng que cấy vòng chuyển sinh khối từ môi trường TSA sang môi trường Malonate broth, phải sử dụng thêm ống môi trường malonate không chứa vi khuẩn làm đối chứng, bởi vì loại môi trường này đôi khi không được cấy vẫn chuyển qua màu xanh dương (màu biểu hiện kết quả dương tính). Đem ủ ở 37oC qua đêm. S. enterica I không sử dụng malonate nên môi trường vẫn giữ nguyên màu xanh lục ban đầu.
Thử nghiệm ONPG: sử dụng que cấy vòng lấy một ít sinh khối từ môi trường TSA cấy chuyển sang môi trường Lactose agar và ủ 37oC qua đêm, sau đó cấy vi khuẩn bằng que cấy vòng từ môi trường Lactose agar sang ống nghiệm chứa 0,5 ml nước cất có chứa đĩa ONPG. Đem ủ ở 37oC trong 4 giờ và đọc kết quả. Loài phụ S. enterica I không có hệ enzyme - galactosidase nên cho phản ứng âm tính, vì vậy không làm đổi màu dung dịch, dung dịch có màu trắng đục. Các loài phụ khác của S. enterica có thể làm nước cất chuyển sang màu vàng. Phản ứng dương tính trong ống nghiệm dung dịch có màu vàng thường sau một giờ, một số vi khuẩn cho phản ứng nhanh hơn chỉ sau 5 – 10 phút.
Thử nghiệm khả năng lên men đường sorbitol: lấy ít sinh khối từ môi trường TSA, dùng que cấy vòng cấy chuyển sang môi trường Sorbitol phenol red broth. Biểu hiện dương tính khi môi trường chuyển từ màu đỏ sang màu vàng và môi trường đục.
Thử nghiệm khả năng lên men đường dulcitol: chuyển vi khuẩn bằng que cấy vòng từ môi trường TSA sang môi trường Dulcitol phenol red broth. Đậy nút không quá chặt và ủ ở 37o
C qua đêm. Phản ứng dương tính khi môi trường chuyển từ màu đỏ sang màu vàng và xuất hiện sinh khối, đôi khi có bọt khí trên bề mặt môi trường.
Bốn phản ứng sinh hóa đặc trƣng của S. enterica I đƣợc thể hiện trong Bảng 3.3 và Hình 3.8.
Bảng 3.3Biểu hiện sinh hóa của S. enterica I
Môi trƣờng Phản ứng Biểu hiện của môi trƣờng
Malonate broth - Không đổi màu, giữ màu xanh lục ban đầu
O.N.P.G. - Không đổi màu, môi trường trắng đục
Dulcitol phenol red broth + Chuyển từ màu đỏ sang màu vàng Sorbitol phenol red broth + Chuyển từ màu đỏ sang màu vàng
Hình 3.8Môi trƣờng xác định S. enterica I trƣớc và sau khi nuôi cấy vi sinh vật