Xác định và phân tích in silico các gen DREB2 ở cây quýt (Citrus clementina)

Xác gen DREB2 thuộc về phân nhóm A2 của họ tác nhân phiên mã DREB (dehydrationresponsive element binding), giữ vai trò quan trọng trong trả lời với các stress vô sinh ở thực vật. Trong công trình này, chúng tôi sử dụng cách tiếp cận in silico để xác định và phân tích bốn gen DREB2 của cây quýt (Citrus clementina).

JOURNAL OF SCIENCE OF HNUE Natural Sci 2015, Vol 60, No 4, pp 127-131 This paper is available online at http://stdb.hnue.edu.vn DOI: 10.18173/2354-1059.2015-00018 XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH IN SILICO CÁC GEN DREB2 Ở CÂY QUÝT (Citrus clementina) Cao Phi Bằng Khoa Sinh học, Trường Đại học Hùng Vương, Phú Thọ Tóm tắt Các gen DREB2 thuộc phân nhóm A2 họ tác nhân phiên mã DREB (dehydrationresponsive element binding), giữ vai trò quan trọng trả lời với stress vơ sinh thực vật Trong cơng trình này, sử dụng cách tiếp cận in silico để xác định phân tích bốn gen DREB2 quýt (Citrus clementina) Chúng có chứa vùng bảo thủ AP2 (PF00847) motif đặc trưng KGCM[RK]GKGGPxN Các gen DREB2 có độ dài từ 633 tới 1581 pb Chỉ gen CclDREB2-2 có intron, ba gen cịn lại mã hóa liên tục Các protein suy diễn có độ dài từ 210 tới 339 axit amin Các protein có tính axit với giá trị pI dao động khoảng từ 4,80 tới 6,99 Cây di truyền cho thấy gen phân bố ba nhánh khác Trong protein suy diễn DREB2, khơng tìm thấy motif PEST lại có axit amin vị trí phosphoryl hóa tiềm protein kinase Bên cạnh đó, axit amin đặc trưng cho vị trí ubiquitin hóa tìm thấy protein DREB2, ngoại trừ CclDREB2-3 Từ khóa: Gen DREB2, di truyền, đặc điểm hóa - lí, in silico, qt Mở đầu Cây quýt (Citrus clementina) thuộc họ Cam, họ ăn quan trọng giới Sản lượng họ Cam đạt 122,3 triệu năm 2009 (FAO 2009) Ở Việt Nam, sản lượng hàng năm thuộc họ cam đạt khoảng 700 nghìn (Thống kê Việt Nam 2012) Một đường trả lời stress nước nhiệt độ cao thực vật biết đường phụ thuộc axit abxixic (ABA) thông qua tác nhân phiên mã DREB2 [1] Các DREB2 thuộc nhóm A2 họ tác nhân phiên mã DREB (dehydration-responsive element binding) [2] Giống protein họ khác, DREB2 có vùng bảo thủ có khả gắn với ADN gọi vùng AP2 chúng khác với protein họ DREB có mặt motif đặc trưng GKGGPxN nằm phía trước vùng AP2 Các DREB2 gắn với yếu tố cis GCCGAC, gọi tên DRE (Dehydration Responsive Element), vùng khởi động gen đích kích hoạt biểu chúng Các DREB2 có khối lượng phân tử biến đổi phạm vi rộng tùy lồi thực vật Phân tích di truyền DREB2 nhiều loài thực vật khác cho thấy chúng xếp vào ba phân nhóm khác Các nghiên cứu biểu gen cho thấy DREB2 thuộc phân nhóm biểu tác động điều kiện nước, nhiệt độ cao Các DREB2 thuộc phân nhóm không bị cảm ứng điều kiện nước Nghiên cứu chức cách chuyển gen DREB2 làm tăng khả chống chịu với stress vô sinh khô hạn, nhiệt độ cao mặn chuyển gen nhiều loài thực vật [3] Sự có mặt vị trí phosphoryl hóa ubiquitin hóa gợi ý Ngày nhận bài: 2/3/2015 Ngày nhận đăng: 17/5/2015 Tác giả liên lạc: Cao Phi Bằng, địa e-mail: phibang.cao@hvu.edu.vn 127 Cao Phi Bằng chế điều hòa sau phiên mã sau dịch mã [1] Trong năm gần đây, nhiều nghiên cứu đáng kể thực để xác định gen DREB2 hệ gen thực vật với toàn gen thuộc siêu họ AP2, có loài thân gỗ hay thực vật khác [2, 4] Do có vai trị đặc biệt quan trọng trả lời với stress vô sinh DREB2, nghiên cứu này, chúng tơi hướng tới xác định trình tự bốn DREB2 quýt Các đặc trưng, motif bảo thủ cấu trúc chúng xác định nhờ phương pháp in silico Bên cạnh đó, kết phân tích phả hệ giới thiệu cơng trình Nội dung nghiên cứu 2.1 Phương pháp nghiên cứu * Cơ sở liệu: Trình tự hệ gen quýt lấy từ Wu nnk (2014) [5] Các trình tự DREB2 Arabidopsis lấy từ Sakuma nnk (2002) [2] * Xác định gen DREB2 quýt: Các protein DREB2 Arabidopsis [2] dùng làm khn dị, chương trình TBLASTN sử dụng để tìm kiếm gen tương đồng liệu hệ gen quýt với giá trị e-value mức e-5 * Xác định motif bảo thủ: Các motif từ DREB2 quýt số thực vật khác tìm phần mềm MEME [6] * Tạo phả hệ: Các trình tự protein DREB2 dãy cách dùng phần mềm MAFFT [7] Cây phả hệ xây dựng từ DREB2 dãy phần mềm MEGA5 nhờ sử dụng phương pháp Maximum Likelihood, liệu xử lí tất vị trí phương pháp Bootstrap với 1000 lần lặp lại [8] * Các đặc điểm hóa - lí cấu trúc khơng gian: Các đặc điểm vật lí, hóa học gen/protein khảo sát nhờ phần mềm ExPASy [9] Cấu trúc không gian vùng AP2 xây dựng nhờ phần mềm Phyre2 [10] Các vị trí phosphoryl hóa phân tử protein suy diễn xác định phần mềm Musite [11] Các vị trí ubiquitin hóa xác định chương trình UbPred [12] 2.2 Kết nghiên cứu thảo luận 2.2.1 Xác định bốn gen DREB2 quýt Bước đầu xác định bốn gen mã hóa cho DREB thuộc phân nhóm A2 (Bảng 1) Như vậy, số lượng gen DREB2 tìm thấy qt Arabidopsis, dương, nho hay táo [2, 4] Bảng Các DREB2 quýt đặc điểm chúng Tên Locus Kích thước Gen (bp) Kích thước protein (aa) Khối lượng phân tử (kDa) pI Số lượng Intron CclDREB2-1 CclDREB2-2 CclDREB2-3 CclDREB2-4 Ciclev10022244m.g Ciclev10032029m.g Ciclev10002280m.g Ciclev10005549m.g 633 1581 747 882 210 339 248 293 23,25 38,20 27,12 32,64 6,09 4,80 6,99 6,27 0 2.2.2 Đặc điểm DREB2 quýt Các gen DREB2 quýt có độ dài từ 633 tới 1581 bp, quy định protein có kích thước từ 210 tới 339 axit amin, tương ứng với khối lượng phân tử từ 23,25 kD tới 38,20 kD, đó, DREB22 có kích thước lớn Các CclDREB2 có tính axít yếu với giá trị điểm đẳng điện (pI) dao động từ 4,80 tới 6,99 (Bảng 1) Những kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu DREB2 số loài khác [2, 4] 128 Xác định phân tích in silico gen DREB2 quýt (Citrus clementina) 2.2.3 Xác định motif bảo thủ cấu trúc không gian DREB2 quýt Hình Biểu tượng trình tự axit amin vùng bảo thủ AP2 (A) motif đặc trưng (B) DREB2 Hình Kết dãy DREB2 quýt Vùng bảo thủ AP2 nằm có đường kẻ liền Motif đặc trưng nằm có đường kẻ đứt Dấu sao: axit amin bảo thủ, dấu trịn: vị trí gắn AND, kí tự in đậm, nghiêng: vị trí phosphoryl hóa, kí tự in đậm, gạch chân: vị trí ubiquitin hóa Vùng bảo thủ AP2 (PF00847) motif đặc trưng cho DREB thuộc phân nhóm A2 tìm thấy bốn DREB2 quýt Trình tự vùng bảo thủ motif đặc trưng giới thiệu Hình Hình Kết dãy CclDREB2 nhờ sử dụng phần mềm MAFFT minh họa rõ motif vị trí chúng phân tử protein Các axit amin có khả gắn với ADN xác định nằm vùng bảo thủ AP2 (Hình 2) Các vị trí phosphoryl hóa ubiquitin hóa tìm thấy bốn protein DREB2 quýt Kết phù hợp với nhiều báo cáo trước gen DREB2 [3] Đồng thời, gợi ý gen DREB2 qt điều hịa chế điều hòa sau phiên mã 129 Cao Phi Bằng Cấu trúc không gian vùng bảo thủ AP2 DREB2 xây dựng nhờ chương trình Phyre2 (Hình 3) Kết bốn DREB2 có chuỗi  xoắn  Cấu trúc tương đồng với DREB thuộc nhóm A1, DREB có khả gắn lên yếu tố cis GCCGAC giống DREB2 [1, 2] Hình Mơ hình 3D cấu trúc bậc hai DREB2 quýt (A) DREB2-1, (B): DREB2-2, (C): DREB2-3, (D): DREB2-4 2.2.4 Phân tích phả hệ phân loại DREB2 Hình Cây phả hệ xây dựng từ DREB2 quýt (Ccl), táo (Md), dương (Pt), nho (Vv) Arabidopsis (At) Cây phả hệ thiết lập từ protein DREB2 câu quýt, táo, dương Arabidopsis thể Hình Kết cho thấy DREB2 quýt nằm ba nhánh khác di truyền Điều gợi ý DREB2 quýt xếp vào ba phân nhóm khác Kết phù hợp với phân loại DREB2 nhiều loài thực vật khác [1] Cây phả hệ cho thấy qt khơng có kiện nhân gen xảy sau thời điểm biệt hóa lồi Arabidopsis, dương đặc biệt táo Đây ngun nhân giải thích số lượng gen DREB2 quýt so với loài Kết luận Trong cơng trình chúng tơi xác định bốn gen DREB2 qt Đặc điểm lí-hóa gen khảo sát Các motif bảo thủ cấu trúc chúng báo cáo báo Hơn nữa, kết phân tích phả hệ cho phép kết luận DREB2 quýt chia thành ba nhóm Đây kết bước đầu có ý nghĩa quan trọng, mở đường cho việc nghiên cứu chức DREB2 lồi 130 Xác định phân tích in silico gen DREB2 quýt (Citrus clementina) TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Mizoi J., Shinozaki K and Yamaguchi-Shinozaki K., 2012 AP2/ERF family transcription factors is plant abiotic stress responses Biochem Biophys Acta, 1819(2), pp 86-96 [2] Sakuma Y., Liu Q., Dubouzet J G., et al., 2002 DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of arabidopsis DREBs, transcription factors involved in dehydration- and coldinducible gene expression Biochem Biophys Res Commun, 290(3), pp 998-1009 [3] Agarwal P., Reddy M and Sopory S., 2006 Role of DREB transcription factors in abiotic and biotic stress tolerance in plants Plant Cell Rep, 25(12), pp 1263-1274 [4] Girardi C L., Rombaldi C V., Dal Cero J., et al., 2013 Genome-wide analysis of the AP2/ERF superfamily in apple and transcriptional evidence of ERF involvement in scab pathogenesis Sci Hort, 151(0), pp 112-121 [5] Wu G A., Prochnik S., Jenkins J., et al., 2014 Sequencing of diverse mandarin, pummelo and orange genomes reveals complex history of admixture during citrus domestication Nat Biotech, 32(7), pp 656-662 [6] Bailey T L., Williams N., Misleh C and Li W W., 2006 MEME: discovering and analyzing DNA and protein sequence motifs Nucleic Acids Res, 34(suppl 2), pp W369-W373 [7] Katoh K and Standley D M., 2013 MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability Mol Biol Evol, 30(4), pp 772-780 [8] Tamura K., Peterson D., Peterson N., et al., 2011 MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods Mol Biol Evol, 28(10), pp 2731-2739 [9] Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., et al., 2005 Protein identification and analysis tools on the ExPASy server The proteomics protocols handbook Springer pp 571-607 [10] Kelley L A and Sternberg M J., 2009 Protein structure prediction on the Web: a case study using the Phyre server Nat Protoc, 4, pp 363-371 [11] Wong Y H., Lee T Y., Liang H K., et al., 2007 KinasePhos 2.0: a web server for identifying protein kinase-specific phosphorylation sites based on sequences and coupling patterns Nucleic Acids Res, 35, pp W588-594 [12] Radivojac P., Vacic V., Haynes C., et al., 2010 Identification, analysis, and prediction of protein ubiquitination sites Proteins, 78(2), pp 365-380 ABSTRACT Identification and in silico analysis of DREB2 genes in Clementine oranges (Citrus clementina) DREB2 genes belong to the A2 subgroup of DREB (dehydration-responsive element binding) transcription factor family which plays an important role in the response to abiotic stress in plants In this work, we used the in silico approach to identify and analyze four DREB2 genes in Clementine oranges (Citrus clementina) These genes contain an AP2 conserved domain (PF00847) and typical KGCM[RK]GKGGPXN motif The full-length genomic sequence of clementine DREB2 genes includes those from 633 to 1581 pb Clementine DREB2 genes are a continously coding gene except for CclDREB2-2 which has an intron region In silico analysis results showed that the full-length predicted protein sequences contain 387 to 392 amino acids All of the DREB2 proteins are acidic or neutral with a pI value ranging from 4.80 to 6.99 A phylogenetic tree analysis showed four CclDREB2 genes distributed on three different branches We did not find any PEST motif in the CclDREB2 proteins, however, the potentially targeted sites of protein kinases were present on all four proteins In addition, characterized residues for the ubiquitination sites were found in the DREB2 proteins, except for CclDREB2-3 Keywords: DREB2 genes, phylogenetic tree, physico-chemical properties, in silico, Clementine 131 ... quan trọng, mở đường cho việc nghiên cứu chức DREB2 loài 130 Xác định phân tích in silico gen DREB2 quýt (Citrus clementina) TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Mizoi J., Shinozaki K and Yamaguchi-Shinozaki K.,... role in the response to abiotic stress in plants In this work, we used the in silico approach to identify and analyze four DREB2 genes in Clementine oranges (Citrus clementina) These genes contain... tích in silico gen DREB2 quýt (Citrus clementina) 2.2.3 Xác định motif bảo thủ cấu trúc không gian DREB2 quýt Hình Biểu tượng trình tự axit amin vùng bảo thủ AP2 (A) motif đặc trưng (B) DREB2 Hình