Biểu hiện gen mã hoá kháng thể kháng CD20 và thử nghiệm để phát hiện CD20 trong huyết thanh của bệnh nhân ung thư lympho không Hodgkin

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phạm Thu Thùy BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG THỂ KHÁNG CD20 VÀ THỬ NGHIỆM ĐỂ PHÁT HIỆN CD20 TRONG HUYẾT THANH CỦA BỆNH NHÂN UNG THƢ LYMPHO KHÔNG HODGKIN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phạm Thu Thùy BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG THỂ KHÁNG CD20 VÀ THỬ NGHIỆM ĐỂ PHÁT HIỆN CD20 TRONG HUYẾT THANH CỦA BỆNH NHÂN UNG THƢ LYMPHO KHÔNG HODGKIN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Trần Minh Đạo PGS TS Lê Quang Huấn Hà Nội – 2014 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Luận án cơng trình nghiên cứu thực cá nhân, đƣợc thực dƣới hƣớng dẫn khoa học PGS TS Trần Minh Đạo PGS TS Lê Quang Huấn Các số liệu, kết luận án trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình khác Tơi xin chịu trách nhiệm nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng Nghiên cứu sinh Phạm Thu Thùy i năm 2014 Lời cảm ơn Trƣớc hết, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới: PGS TS Trần Minh Đạo – Giám đốc bệnh viện 198 – Bộ Công an PGS TS Lê Quang Huấn – Trƣởng phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học Việt Nam tận tình hƣớng dẫn tơi q trình nghiên cứu để hồn thành luận án tiến sĩ Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.T.S Nguyễn Thị Hồng Vân – Trƣởng môn Di truyền học, thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học Khoa Sinh học – Trƣờng đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội bảo tận tình tạo điều kiện thuận lợi cho thực luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới T.S Lã Thị Huyền, cô chú, anh chị bạn cơng tác phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam Tôi xin chân thành cảm ơn cô chú, anh chị bạn đồng nghiệp Khoa Vi sinh – Bệnh viện 198 nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn Khoa giải phẫu bệnh – Học viện quân y, Trung tâm Ung bƣớu - Bệnh viện 198 Viện chăn ni cung cấp mẫu thí nghiệm cho Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình tất ngƣời thân, bạn bè giúp đỡ thời gian qua Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Nghiên cứu sinh Phạm Thu Thùy ii Mục lục Trang phụ bìa Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt vii Danh mục bảng, biểu ix Danh mục hình x MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 UNG THƢ MÁU 1.1.1 Đại cƣơng ung thƣ máu 1.1.2 Tình hình ung thƣ máu giới Việt Nam 1.1.3 Các phƣơng pháp chẩn đoán điều trị ung thƣ máu 1.1.4 Bệnh ung thƣ lympho không Hodgkin (Non-Hodgkin lymphoma) 1.2 KHÁNG NGUYÊN CD20 11 1.2.1 Cấu trúc gen protein CD20 11 1.2.2 Chức CD20 thể 12 1.2.3 Kháng nguyên CD20 – mục tiêu phân tử điều trị ung thƣ ung thƣ máu 14 1.2.4 Tình hình nghiên cứu kháng nguyên CD20 tái tổ hợp 16 1.3 KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG (mAb), KHÁNG THỂ SCFV VÀ 17 KHÁNG THỂ PHAGE-SCFV 1.3.1 Kháng thể 17 1.3.2 Kháng thể đơn dòng (mAb) 18 1.3.3 Kháng thể đơn chuỗi (kháng thể scFv) 20 1.3.4 Kháng thể phage-scFv 22 1.3.5 Ứng dụng mAb chẩn đoán bệnh ung thƣ máu 25 1.3.6 Tình hình nghiên cứu sản xuất mAb đặc hiệu kháng nguyên iii CD giới 27 1.4 KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN CD20 28 1.4.1 Cơ chế hoạt động kháng thể đặc hiệu CD20 28 1.4.2 Một số mAb đặc hiệu CD20 đƣợc sử dụng điều trị 32 1.4.3 Tình hình nghiên cứu mAb đặc hiệu CD20 36 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 VẬT LIỆU 39 2.1.1 Sinh phẩm 39 2.1.2 Mồi 39 2.1.3 Hóa chất trang thiết bị 40 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.2.1 Các phƣơng pháp thao tác với DNA VÀ RNA 41 2.2.1.1 Tách chiết RNA từ máu bệnh nhân tủy gà gây miễn 42 dịch 2.2.1.2 RT-PCR nhân gen mã hóa kháng nguyên CD20 kháng 42 thể scFv đặc hiệu CD20 2.2.1.3 Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR2.1 43 2.2.1.4 Biến nạp plasmid vào tế bào E coli 44 2.2.1.5 Tách DNA plasmid từ vi khuẩn E coli 45 2.2.1.6 Tạo vector tái tổ hợp chứa đoạn gen CD20 45 2.2.1.7 Tách dịng gen antiCD20Fa mã hóa kháng thể scFv-CH2 46 2.2.1.8 Điện di gel agarose 46 2.2.1.9 Thu đoạn DNA từ gel agarose 47 2.2.1.10 Tinh DNA cắt, gắn DNA 47 2.2.1.11 Phƣơng pháp nhân gen PCR 48 2.2.1.12 Xác định trình tự nucleotide 49 2.2.2 Các phƣơng pháp thao tác với protein tái tổ hợp 49 2.2.2.1 Biểu gen tế bào E coli 49 2.2.2.2 Tinh protein tái tổ hợp 50 2.2.2.3 Điện di protein 51 2.2.3 Kĩ thuật Western blot Dot blot 51 iv 2.2.4 Gây miễn dịch gà kháng nguyên CD20 52 2.2.5 Kĩ thuật phage display 53 2.2.5.1 Tạo kháng thể phage-scFv từ thƣ viện Griffin.1 53 2.2.5.2 Sàng lọc kháng thể phage-scFv đặc hiệu kháng nguyên đích 53 2.2.6 ELISA 54 2.2.7 Xác định khả liên kết kháng thể scFv-CH2 với CD20 54 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57 3.1 TẠO KHÁNG NGUYÊN CD20 TÁI TỔ HỢP 57 3.1.1 Tách chiết RNA tổng số từ máu bệnh nhân ung thƣ lympho không Hodgkin 57 3.1.2 Nhân gen mã hoá CD20 58 3.1.3 Tách dịng gen mã hố CD20 58 3.1.4 Xác định trình tự gen mã hóa CD20 59 3.1.5 Thiết kế vector biểu kháng nguyên CD20 60 3.1.6 Biểu hiện, tinh xác định hoạt tính CD20 61 3.2 KẾT QUẢ GÂY MIỄN DỊCH GÀ BẰNG CD20 TẠO RA 64 3.3 THU NHẬN GEN MÃ HÓA scFv KHÁNG CD20 TỪ GÀ 65 3.3.1 Tạo gen tái tổ hợp mã hóa cho scFv từ gà gây miễn dịch 65 3.3.2 Tạo phage biểu lộ scFv sàng lọc scFv có khả gắn đặc hiệu với kháng nguyên đích 68 3.4 TẠO KHÁNG THỂ scFv KHÁNG CD20 69 3.4.1 Tách dịng gen antiCD20 mã hóa scFv 69 3.4.2 Thiết kế vector biểu pET22b(+)/antiCD20 69 3.4.3 Tối ƣu số điều kiện biểu scFv 71 3.4.4 Tinh kháng thể scFv đặc hiệu CD20 76 3.4.5 Khả liên kết scFv với kháng thể cộng hợp 78 3.4.6 Độ ổn định scFv tinh 79 3.5 TẠO KHÁNG THỂ scFv-CH2 KHÁNG CD20 81 3.5.1 Tách dịng gen antiCD20Fa mã hóa scFv-CH2 81 3.5.2 Sàng lọc hệ vector biểu scFv-CH2 82 3.5.2.1 Nhân dòng vector biểu scFv-CH2 82 v 3.5.2.2 Biểu kháng thể scFv-CH2 hệ vector 83 3.5.2.3 Chọn vector biểu scFv-CH2 84 3.5.3 Tối ƣu số điều kiện biểu scFv-CH2 85 3.5.4 Tinh kháng thể scFv-CH2 88 3.5.5 Độ ổn định scFv-CH2 tinh 91 3.5.6 Khả liên kết scFv-CH2 với CD20 91 3.6 THỬ NGHIỆM scFv-CH2 PHÁT HIỆN CD20 TRONG 93 HUYẾT THANH BỆNH NHÂN NHL 3.6.1 Phát CD20 huyết bệnh nhân Western blot 93 3.6.2 Phát CD20 huyết bệnh nhân ELISA 95 3.6.2.1 Lựa chọn độ pha loãng huyết 95 3.6.2.2 Thử nghiệm scFv-CH2 phát CD20 huyết bệnh 96 nhân ELISA KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 100 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 101 TÀI LIỆU THAM KHẢO 102 PHỤ LỤC vi Danh mục kí hiệu, từ viết tắt ADCC Antibody dependent cellular Gây độc tế bào phụ thuộc cytotoxicity kháng thể ADC Antibody drug conjugate Kháng thể mang thuốc AIDS acquired immune deficiency Hội chứng suy giảm miễn dịch syndrome mắc phải ALL Acute Lymphocytic Leukemia Ung thƣ tế bào lympho cấp tính AML Acute Myelogenous Ung thƣ bạch cầu dịng tủy cấp Leukemia tính CD Cluster of differenciation Cụm biệt hóa CDC Complement dependent Gây độc tế bào phụ thuộc bổ cytotoxicity thể Complementary ADN bổ sung cDNA Deoxyribonucleic acid CDR Complementarity determining Vùng định bổ trợ region CLL Chronic Lymphocytic Ung thƣ tế bào lympho mạn Leukemia tính Chronic Myelogenous Ung thƣ bạch cầu dịng tủy Leukemia mạn tính CR Complete remission Đáp ứng hoàn toàn DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleoside CML triphosphate ELISA FDA HAMA Enzyme-Linked Kỹ thuật miễn dịch liên kết ImmunoSorbent Assay enzyme Food and Drug Cục Quản lý thuốc thực Administration phẩm Human against mouse allergic Hiện tƣợng mAb có nguồn gốc vii grade, follicular, or transformed B-cell non-Hodgkin’s lymphoma”, Clinical Oncology, 20(10), pp 2453-2463 129 Yang O.H., Michael J.K., Helene L.S., Jilani I., Lerner S., and Maher Albitar M (2001), “HigFher levels of surface CD20 expression on circulating lymphocytes compared with bone marrow and lymph nodes in B-Cell chronic lymphocytic leukemia”, Clinical Pathology, 116(3), pp 437443 130 Zhang X.Y., Sun Z.W., Yu W.Y., Cheng J.Z (2004), “Cloning and expression of fusion gene of transmembrane domain of human CD20 and g3pN in Escherichia coli”, China Journal of Cell Molecular Immunology, 20(4), pp 481-483 131 Zola H (2006), “Medical applications of leukocyte surface molecules-the CD molecules”, Molecular Medicine, 12 (11-12), pp 312-316 118 PHỤ LỤC Phụ lục 1.1 Kết xác định trình tự nucleotide protein suy biến gen mã hóa kháng nguyên CD20 10 20 30 40 50 60 CATATGGCGACGCCGCGTAATAGCGTTAATGGTACGTTCCCGGCCGAGCCGATGAAGGGT H M A T P R N S V N G T F P A E P M K G 70 80 90 100 110 120 CCGATCGCGATGCAGTCTGGCCCGAAGCCGTTATTCCGCCGTATGAGCTCTCTGGTGGGT P I A M Q S G P K P L F R R M S S L V G 130 140 150 160 170 180 CCGACGCAGAGCTTCTTCATGCGTGAAAGCAAGACGCTGGGCGCGGTGCAAATCATGAAC P T Q S F F M R E S K T L G A V Q I M N 190 200 210 220 230 240 GGCCTGTTCCACATCGCCTTAGGCGGCCTGCTGATGATCCCGGCAGGTATTTACGCCCCA G L F H I A L G G L L M I P A G I Y A P 250 260 270 280 290 300 ATTTGTGTTACGGTTTGGTACCCGCTGTGGGGTGGCATCATGTATATTATCAGCGGTTCT I C V T V W Y P L W G G I M Y I I S G S 310 320 330 340 350 360 CTGCTGGCGGCGACGGAGAAGAACAGCCGCAAGTGTCTGGTGAAAGGTAAGATGATTATG L L A A T E K N S R K C L V K G K M I M 370 380 390 400 410 420 AATAGCCTGTCTCTGTTTGCCGCCATTAGCGGCATGATTCTGAGCATCATGGACATCCTG N S L S L F A A I S G M I L S I M D I L 430 440 450 460 470 480 AACATCAAGATCAGCCACTTCCTGAAGATGGAGAGCCTGAATTTCATTCGCGCCCACACC N I K I S H F L K M E S L N F I R A H T 490 500 510 520 530 540 CCGTACATTAACATCTATAATTGTGAGCCAGCGAACCCGAGCGAGAAAAATAGCCCGAGC P Y I N I Y N C E P A N P S E K N S P S 550 560 570 580 590 600 ACCCAGTATTGTTACTCTATCCAAAGCCTGTTCCTGGGCATTCTGAGCGTCATGTTAATT T Q Y C Y S I Q S L F L G I L S V M L I 610 620 630 640 650 660 TTCGCATTTTTCCAGGAGCTGGTCATTGCCGGTATCGTCGAGAATGAATGGAAACGCACG F A F F Q E L V I A G I V E N E W K R T 670 680 690 700 710 720 TGTTCTCGCCCAAAGAGCAACATCGTGCTGCTGAGCGCGGAGGAGAAGAAGGAGCAGACC C S R P K S N I V L L S A E E K K E Q T 730 740 750 760 770 780 ATCGAAATCAAAGAGGAGGTGGTTGGTTTAACCGAAACGAGCAGCCAGCCAAAAAACGAA I E I K E E V V G L T E T S S Q P K N E 790 800 810 820 830 840 GAAGACATCGAGATCATCCCGATCCAGGAGGAGGAAGAGGAAGAGACCGAGACCAATTTT E D I E I I P I Q E E E E E E T E T N F 850 860 870 880 890 900 CCGGAGCCACCGCAGGATCAGGAATCTAGCCCAATCGAAAACGATAGCTCTCCACTCGAG P E P P Q D Q E S S P I E N D S S P L E 1.2 Kết so sánh trình tự protein suy biến gen mã hóa kháng ngun CD20 tách dịng với trình tự công bố Ngân hàng gen quốc tế 119 So sánh trình tự axit amin đoạn gen CD20 tách dịng với trình tự đƣợc đăng kí Ngân hàng gen quốc tế phần mềm FASTA Đoạn gen CD20 nhân đƣợc có độ tƣơng đồng cao với trình tự ngân hàng gen đƣợc đăng kí Kết trình tự có độ tƣơng đồng từ 96,6 % đến 100 %, trình tự tƣơng đồng tới 99,7 % so với kháng nguyên CD20 tế bào B chứng tỏ đoạn gen CD20 đặc trƣng có trình tự bảo thủ cao 120 1.3 Kết xác định trình tự DNA protein suy diễn kháng nguyên CD20 gắn vào vector biểu pET21a(+) Gen mã hóa kháng ngun CD20 tạo cơng nghệ gen với mã mở đầu ATG, mã kết thúc TGA đầu gắn đuôi histidine Gen CD20 gắn vào vector biểu pET-21a(+) chiều khung đọc 10 20 30 40 50 60 CATATGGCGACGCCGCGTAATAGCGTTAATGGTACGTTCCCGGCCGAGCCGATGAAGGGT H M A T P R N S V N G T F P A E P M K G 70 80 90 100 110 120 CCGATCGCGATGCAGTCTGGCCCGAAGCCGTTATTCCGCCGTATGAGCTCTCTGGTGGGT P I A M Q S G P K P L F R R M S S L V G 130 140 150 160 170 180 CCGACGCAGAGCTTCTTCATGCGTGAAAGCAAGACGCTGGGCGCGGTGCAAATCATGAAC P T Q S F F M R E S K T L G A V Q I M N 190 200 210 220 230 240 GGCCTGTTCCACATCGCCTTAGGCGGCCTGCTGATGATCCCGGCAGGTATTTACGCCCCA G L F H I A L G G L L M I P A G I Y A P 250 260 270 280 290 300 ATTTGTGTTACGGTTTGGTACCCGCTGTGGGGTGGCATCATGTATATTATCAGCGGTTCT I C V T V W Y P L W G G I M Y I I S G S 310 320 330 340 350 360 CTGCTGGCGGCGACGGAGAAGAACAGCCGCAAGTGTCTGGTGAAAGGTAAGATGATTATG L L A A T E K N S R K C L V K G K M I M 370 380 390 400 410 420 AATAGCCTGTCTCTGTTTGCCGCCATTAGCGGCATGATTCTGAGCATCATGGACATCCTG N S L S L F A A I S G M I L S I M D I L 430 440 450 460 470 480 AACATCAAGATCAGCCACTTCCTGAAGATGGAGAGCCTGAATTTCATTCGCGCCCACACC N I K I S H F L K M E S L N F I R A H T 490 500 510 520 530 540 CCGTACATTAACATCTATAATTGTGAGCCAGCGAACCCGAGCGAGAAAAATAGCCCGAGC P Y I N I Y N C E P A N P S E K N S P S 550 560 570 580 590 600 ACCCAGTATTGTTACTCTATCCAAAGCCTGTTCCTGGGCATTCTGAGCGTCATGTTAATT T Q Y C Y S I Q S L F L G I L S V M L I 610 620 630 640 650 660 TTCGCATTTTTCCAGGAGCTGGTCATTGCCGGTATCGTCGAGAATGAATGGAAACGCACG F A F F Q E L V I A G I V E N E W K R T 670 680 690 700 710 720 TGTTCTCGCCCAAAGAGCAACATCGTGCTGCTGAGCGCGGAGGAGAAGAAGGAGCAGACC C S R P K S N I V L L S A E E K K E Q T 730 740 750 760 770 780 ATCGAAATCAAAGAGGAGGTGGTTGGTTTAACCGAAACGAGCAGCCAGCCAAAAAACGAA I E I K E E V V G L T E T S S Q P K N E 790 800 810 820 830 840 GAAGACATCGAGATCATCCCGATCCAGGAGGAGGAAGAGGAAGAGACCGAGACCAATTTT E D I E I I P I Q E E E E E E T E T N F 850 860 870 880 890 900 CCGGAGCCACCGCAGGATCAGGAATCTAGCCCAATCGAAAACGATAGCTCTCCACTCGAG P E P P Q D Q E S S P I E N D S S P L E 910 920 CACCACCACCACCACCACTGA H H H H H H * 121 Phụ lục Kết xác định trình tự DNA protein suy diễn kháng thể scFv ảnh Chromas trình tự đoạn gen mã hóa kháng thể scFv Gen mã hóa kháng thể scFv antiCD20 kháng CD20 tạo công nghệ gen bao gồm vùng: VL-VH với tổng số 840 bp bao gồm đoạn nối (linker) VL-VH (SSGGGGSGGGGSGS), đoạn gen mã hóa His-tag cuối gen, mã mở đầu ATG mã kết thúc TGA, cụ thể nhƣ sau: 10 20 30 40 50 60 ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCG M K Y L L P T A A A G L L L L A A Q P A 70 80 90 100 110 120 ATGGCCATGGATATCGGAATTAATTCGGATCCGAATTCTGTATTATCTCAATCTCCTGCA M A M D I G I N S D P N S V L S Q S P A 130 140 150 160 170 180 ATTTTATCTGCATCTCCTGGAGAAAAAGTAACAATGACATGTCGTGCATCTTCTTCTGTA I L S A S P G E K V T M T C R A S S S V 190 200 210 220 230 240 TCTTATATGCATTGGTATCAACAAAAACCTGGATCTTCTCCTAAACCTTGGATTTATGCA S Y M H W Y Q Q K P G S S P K P W I Y A 250 260 270 280 290 300 CCTTCTAATTTAGCATCTGGAGTACCTGCACGTTTTTCTGGATCTGGATCTGGAACATCT P S N L A S G V P A R F S G S G S G T S 310 320 330 340 350 360 TATTCTTTAACAATTTCTCGTGTAGAAGCAGAAGATGCAGCAACATATTATTGTCAACAA Y S L T I S R V E A E D A A T Y Y C Q Q 370 380 390 400 410 420 TGGTCTTTTAATCCTCCTACATTTGGAGCAGGAACAAAATTAGAATTAAAACGTTCTTCT W S F N P P T F G A G T K L E L K R S S 430 440 450 460 470 480 GGAGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGATCTGGATCTCAAGCATATTTACAACAATCTGGA G G G G S G G G G S G S Q A Y L Q Q S G 490 500 510 520 530 540 GCAGAATTAGTACGTCCTGGAGCATCTGTAAAAATGTCTTGTAAAGCATCTGGATATACA A E L V R P G A S V K M S C K A S G Y T 550 560 570 580 590 600 TTTACATCTTATAATATGCATTGGGTAAAACAAACACCTCGTCAAGGATTAGAATGGATT F T S Y N M H W V K Q T P R Q G L E W I 610 620 630 640 650 660 GGAGCAATTTATCCTGGAAATGGAGATACATCTTATAATCAAAAATTTAAAGGAAAAGCA G A I Y P G N G D T S Y N Q K F K G K A 670 680 690 700 710 720 ACATTAACAGTAGATAAATCTTCTTCTACAGCATATATGCAATTATCTTCTTTAACATCT T L T V D K S S S T A Y M Q L S S L T S 730 740 750 760 770 780 GAAGATTCTGCAGTATATTTTTGTGCACGTGTAGTATATTATTCTAATTCTTATTGGTAT E D S A V Y F C A R V V Y Y S N S Y W Y 790 800 810 820 830 840 TTTGATGTATGGGGAACAGGAACAACAGTAACACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA F D V W G T G T T V T L E H H H H H H * 122 Phụ lục Kết xác định trình tự DNA protein suy diễn dạng ảnh Chromas trình tự gen mã hóa kháng thể scFv-CH2 Gen mã hóa kháng thể scFv- CH2 antiCD20Fa kháng CD20 tạo công nghệ gen bao gồm vùng: VL-VH- CH2 với tổng số 1185 bp (~ 1200 bp) bao gồm đoạn linker nối VL-VH (SSGGGGSGGGGSGS), đoạn His-tag đầu mã kết thúc TAG, cụ thể nhƣ sau: 10 20 30 40 50 60 ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCAT M G S S H H H H H H S S G L V P R G S H 70 80 90 100 110 120 ATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGTATTATCTCAATCTCCT M A S M T G G Q Q M G R G S V L S Q S P 130 140 150 160 170 180 GCAATTTTATCTGCATCTCCTGGAGAAAAAGTAACAATGACATGTCGTGCATCTTCTTCT A I L S A S P G E K V T M T C R A S S S 190 200 210 220 230 240 GTATCTTATATGCATTGGTATCAACAAAAACCTGGATCTTCTCCTAAACCTTGGATTTAT V S Y M H W Y Q Q K P G S S P K P W I Y 250 260 270 280 290 300 GCACCTTCTAATTTAGCATCTGGAGTACCTGCACGTTTTTCTGGATCTGGATCTGGAACA A P S N L A S G V P A R F S G S G S G T 310 320 330 340 350 360 TCTTATTCTTTAACAATTTCTCGTGTAGAAGCAGAAGATGCAGCAACATATTATTGTCAA S Y S L T I S R V E A E D A A T Y Y C Q 370 380 390 400 410 420 123 CAATGGTCTTTTAATCCTCCTACATTTGGAGCAGGAACAAAATTAGAACTAAAACGTTCT Q W S F N P P T F G A G T K L E L K R S 430 440 450 460 470 480 TCTGGAGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGATCTGGATCTCAAGCATATTTACAACAATCT S G G G G S G G G G S G S Q A Y L Q Q S 490 500 510 520 530 540 GGAGCAGAATTAGTACGTCCTGGAGCATCTGTAAAAATGTCTTGTAAAGCATCTGGATAT G A E L V R P G A S V K M S C K A S G Y 550 560 570 580 590 600 ACATTTACATCTTATAATATGCATTGGGTAAAACAAACACCTCGTCAAGGATTAGAATGG T F T S Y N M H W V K Q T P R Q G L E W 610 620 630 640 650 660 ATTGGAGCAATTTATCCTGGAAATGGAGATACATCTTATAATCAAAAATTTAAAGGAAAA I G A I Y P G N G D T S Y N Q K F K G K 670 680 690 700 710 720 GCAACATTAACAGTAGATAAATCTTCTTCTACAGCATATATGCAATTATCTTCTTTAACA A T L T V D K S S S T A Y M Q L S S L T 730 740 750 760 770 780 TCTGAAGATTCTGCAGTATATTTTTGTGCACGTGTAGTATATTATTCTAATTCTTATTGG S E D S A V Y F C A R V V Y Y S N S Y W 790 800 810 820 830 840 TATTTTGATGTATGGGGAACAGGAACAACAGTAACACCCGGGGAACCTAAATCTTGTGAT Y F D V W G T G T T V T P G E P K S C D 850 860 870 880 890 900 AAAACACATACATGTCCTCCTTGTCCTGCACCTGAATTATTAGGAGGACCTTCTGTATTT K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F 910 920 930 940 950 960 TTATTTCCTCCTAAACCTAAAGATACATTAATGATTTCTCGTACACCTGAAGTAACATGT L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C 970 980 990 1000 1010 1020 GTAGTAGTAGATGTATCTCATGAAGATCCTGAAGTAAAATTTAATTGGTATGTAGATGGA V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G 1030 1040 1050 1060 1070 1080 GTAGAAGTACATAATGCAAAAACAAAACCTCGTGAAGAACAATATAATTCTACATATCGT V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R 1090 1100 1110 1120 1130 1140 GTAGTATCTGTATTAATAGTATTACATCAAGATTGGTTAAATGGAAAAGAATATAAATGT V V S V L I V L H Q D W L N G K E Y K C 1150 1160 1170 1180 1190 AAAGTATCTAATAAAGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA K V S N K A L E H H H H H H * 124 125 126 Phụ lục 4: Sơ đồ vector 4.1 Sơ đồ vector tách dòng pCR2.1-TOPO 127 4.2 Sơ đồ vector biểu pET21a(+) 128 4.3 Sơ đồ vector biểu pET22b(+) 4.4 Sơ đồ vectorVùng biểu nhânpET28a dòng/biểu pET22b(+) 129 4.4 Sơ đồ vector biểu pET28a 130 4.5 Sơ đồ vector biểu pET30GB1 131 4.6 Sơ đồ vector biểu MBP 132