Mục tiêu nghiên cứu nhằm xác định kiểu gen của HBV bằng kỹ thuật PCR, phát hiện đột biến đổi 1762T/1764A ở vùng basal core promotor của HBV bằng kỹ thuật giải trình tự và phát hiện đột biến codon R249S ở gen p53 ở người bằng kỹ thuật PCRRFLP và giải trình tự.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ Số * 2015 XÁC ĐỊNH GENOTYPE, ĐỘT BIẾN BCP CỦA HBV VÀ CODON 249 CỦA GEN P53 Ở NGƯỜI TRONG HUYẾT THANH CỦA BỆNH NHÂN HCC Đỗ Thị Thanh Thủy*, Lương Bắc An*, Vũ Diễm My*, Nguyễn Thị Cẩm Hường*, Phạm Thị Lệ Hoa* TĨM TẮT Mở đầu: Ung thư biểu mơ tế bào gan (HCC) loại ung thư thường gặp, nguyên nhân hàng đầu dẫn đến tử vong bệnh nhân ung thư Nguyên nhân gây ung thư biểu mô tế bào gan, virus gây viêm gan B, viêm gan C aflatoxin B1 (AFB) chiếm 80% trường hợp HCC người Kiểu gen HBV, đôt biến đôi 1762T/1764A vùng basal core promotor (BCP) virus HBV đột biến codon R249S gen p53 người xem dấu ấn sinh học giúp tiên đoán khả mắc HCC bệnh nhân viêm gan HBV phơi nhiễm aflatoxin B1 Mục tiêu: Xác định kiểu gen HBV kỹ thuật PCR, phát đột biến đôi 1762T/1764A vùng BCP HBV kỹ thuật giải trình tự phát đột biến codon R249S gen p53 người kỹ thuật PCRRFLP giải trình tự Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang 22 mẫu máu bệnh nhân chẩn đốn HCC có HBsAg (+) HBV DNA > 1.000 IU/ml phòng khám viêm gan bệnh viện Đại học Y Dược Tp.HCM Thiết lập kỹ thuật xác định kiểu gen HBV, phát đột biến đơi vùng BCP phương pháp giải trình tự, phát đột biến R429S gen p53 người kỹ thuật PCR-RFLP giải trình tự, phân tích kết phần mềm tin sinh học Kết quả: Trong 22 trường hợp thỏa mãn tiêu chí nghiên cứu, tỉ lệ nam/nữ = 2,1, có trường hợp HBV genotype B (41%), 13 trường hợp HBV genotype (59%) Phát có 16 trường hợp mang đột biến 1762T/1764A vùng BCP (72,7%), trường hợp đột biến đơi Khơng phát có đột biến codon 249 gen p53 người 22 trường hợp khảo sát Kết luận: Nghiên cứu ứng dụng thành công kĩ thuật PCR, PCR-RFLP kĩ thuật giải trình tự việc phát kiểu gen HBV, đột biến đôi 1762T/1764A vùng BCP HBV đột biến vị trí thường gặp R249S gen p53 người bệnh nhân HCC Bước đầu cho thấy HBV genotype C đột biến đôi 1762T/1764A vùng BCP HBV phổ biến bệnh nhân HCC Tuy nhiên, cần có nghiên cứu cỡ mẫu lớn nhằm xác định xem đột biến có dấu ấn tiên lượng khả mắc HCC bệnh nhân bị viêm gan HBV phơi nhiễm aflatoxine B1 Từ khóa: Genotype, HCC, PCR-RFLP, sequencing, mutation ABSTRACT IDENTIFICATION OF GENOTYPE AND MUTATION AT BCP OF HBV AND MUTATION AT CODON 249 OF HUMAN P53 IN SERUM OF HCC PATIENTS Do Thi Thanh Thuy, Luong Bac An, Vu Diem My, Nguyen Thi Cam Huong, Pham Thi Le Hoa * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 19 - Supplement of No - 2015: 332 - 337 Background: Hepatocellular carcinoma (HCC) is a common cancer, a leading cause of death in cancer patients The main causative agents of HCC- hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), and aflatoxin B1 * Trung tâm Y Sinh học phân tử, Đại học Y Dược TP HCM Tác giả liên lạc: PGS TS.BS Đỗ Thị Thanh Thủy 332 ĐT: 0908487425 Email: thuyprenatal@gmail.com Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ Số * 2015 Nghiên cứu Y học (AFB) are responsible for about 80% of all HCCs in humans Genotype of HBV, the double mutation 1762T/1764A at the basal core promoter (BCP) of HBV and the mutation at codon R249S of human p53 are considered biomarkers to help predict susceptibility to HCC in patients with HBV infection and aflatoxine B1 exposure Objective: Identify genotype of HBV by PCR, detect the double mutation 1762T/1764A at BCP of HBV by sequencing, and detect the mutation at codon R429S of p53 gene by PCR-RFLP and sequencing Method: Descriptive cross-sectional study performed on 22 blood samples from HCC diagnosed patients with positive HbsAg and HBV DNA > 1.000 UI/ml at Hospital of University Medical Center, HCMC Setting up techniques for identifying HBV genotype by PCR, detecting double mutations at BCP region by sequencing and detecting R249S mutation at p53 human gene by PCR-RFLP and sequencing as well as result analysis by bioinformatics software Result: In 22 cases met the criteria of our study, male/female = 2.1, there were cases of HBV genotype B (41%) and 13 cases of HBV genotype C (59%) We detected 16 cases carrying the double mutation 1762T/1764A in BCP region (72.7%) and cases with no mutation We did not detect any case with the mutation at codon 249 of p53 human gene Conclusion: Our research successfully applied PCR, PCR-RFLP, and sequencing in detection of HBV genotypes, double mutation 1762T / 1764A in the BCP region of HBV and the hotspot mutation at position 249 of p53 human gene in HCC patients Initially, the study showed that HBV genotype C and double mutation 1762T / 1764A in BCP region are common in patients with HCC However, we need to look for mutations on a larger sample size to determine if these mutations could be used as prognostic markers of susceptibility to HCC in patients with hepatitis B and exposure aflatoxine B Key work: Genotype, HCC, PCR-RFLP, sequencing, mutation vùng có khả làm gia tăng nguy ĐẶT VẤN ĐỀ viêm gan mạn tính, xơ gan ung thư gan Vì Ung thư biểu mô tế bào gan nguyên phát vậy, đột biến coi dấu ấn sinh (Hepatocellular Carcinoma- HCC) bệnh học giúp theo dõi phát sớm bệnh lý ác tính tế bào gan Ở Việt Nam, số bệnh nhân có nguy bị ưng thư gan Ngoài ra, việc nhân ung thư gan đứng hàng thứ ba sau ung thư xác định genotype HBV liên quan đến phổi, ung thư dày nam sau ung thư vú, khả phát triển HCC(11), Việt Nam có ung thư cổ tử cung nữ giới Tại châu Á, có tới loại HBV genotype phổ biến B C, 75% trường hợp HCC nhiễm virus viêm gan nhiễm HBV genotype C yếu tố thuận lợi B (HBV) virus viêm gan C (HVC) mạn tính, dễ tiến triển thành viêm gan mạn, xơ gan ung xơ gan(5,6) Theo WHO, Việt Nam xếp vào thư gan Bên cạnh nguyên gây HCC trên, người vùng lưu hành cao nhiễm vi rút viêm gan B, ta đặc biệt ý tới độc tố aflatoxin tỉ lệ nhiễm HBV Việt Nam trung bình vào sinh từ nấm mốc aspergillus flavus, aspergillus khoảng 15%, tính có khoảng 10-12 parasiticus(9,6) Có 17 loại aflatoxin khác nhau, triệu người mang mầm bệnh Theo Hội aflatoxin B1 (AFB1) có độc tính mạnh gan mật Việt Nam năm 2013, Việt Nam Ước tính có khoảng 4,5 tỉ người vài nước có tỉ lệ nhiễm bị HBV cao vào bậc giới có nguy phơi nhiễm với aflatoxin giới Theo số nghiên cứu HCC thực phẩm(3,10) Các báo cáo dịch tễ cho thấy Trung Quốc nước châu Phi, có xuất AFB1 đóng vai trò quan trọng tỉ lệ đột biến đôi vùng BCP (Basic Core người bị HCC Gen p53 gen ức chế khối u Promoter) gồm A thành T nucleotid 1762 người thường có tần suất đột biến cao bệnh G thành A tai nucleotid 1764 HBV Đột biến nhân ung thư (hơn 50% trường hợp ung thư Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 333 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ Số * 2015 người có đột biến gen này) Do vậy, gen p53 xem dấu ấn cho xét nghiệm ung thư Hơn 50% bệnh nhân HCC phơi nhiễm AFB1 có mang đột biến codon 249 (R249S) exon gen p53 gây biến đổi amino acid Arg thành Ser(9,11) Đột biến hotspot R249S coi dấu ấn phản ánh ung thư biểu mô tế bào gan nhiễm AFB1 Việc tìm hiểu đột biến hotspot R249S gen p53 bệnh nhân HCC Việt Nam cần thiết(8, 7) Chính tiến hành khảo sát genotype, đột biến đôi vùng BCP HBV, đồng thời phát đột biến codon 249 gen p53 người huyết bệnh nhân HCC kỹ thuật sinh học phân tử PCR, giải trình tự gen để tìm hiểu tỉ lệ đột biến kiểu gen HBV mẫu mô gan chẩn đoán CT HCC ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Thiết kế nghiên cứu Mô tả cắt ngang Lấy mẫu thuận lợi Đối tượng nghiên cứu Bệnh nhân chẩn đoán HCC có HbsAg (+) từ tháng 1-2013 đến tháng 9-2014 bệnh viện Đại học Y Dược Đối tượng loại trừ Bệnh nhân chẩn đốn HCC có HbsAg (+) HBV ADN âm tính Phương pháp nghiên cứu Định lượng ADN HBV Để xác định mẫu HBV (+) kỹ thuật real time PCR Các mẫu chọn có tải lượng HBV > 1.000 UI/ml Kỹ thuật ly trích DNA từ huyết tương ADN HBV tách chiết kit BOOM theo nguyên lý sử dụng Guanidine thiocyanate (GuSCN) để ly giải hoạt tính nuclease, ADN từ HBV phóng thích bám vào hạt silica, nhờ ADN từ mẫu bệnh phẩm tách chiết cách tinh khiết 334 Mồi cho phản ứng Mồi sử dụng để xác định kiểu gen B C HBV liệt kê bảng 1(4) PCR xác định kiểu gen HBV Sử dụng kít Hot Start Taq Polymerase Takara Tiến hành phản ứng PCR với mồi BGB2, BB1R BC1R chu kì nhiệt PCR: 98oC/3 phút; 45 chu kì với chu kì gồm bước: 98oC/10 giây, 58oC/20 giây; chu kì 72oC/5 phút Tiến hành điện di sản phẩm với gel 3% 70V 40 phút có chứa ethidium bromide Sau đọc kết điện di nhằm xác định kiểu gen PCR khuếch đại vùng BCP HBV Các mẫu bệnh phẩm xác định genotype HBV tiếp tục khuếch đại vùng BCP để xác định đột biến đôi A1762T G1764A Thực phản ứng PCR với cặp mồi BCF2 BCR2 để khuếch đại vùng gen cần giải trình tự với chương trình PCR sau: chu kì 98oC/3 phút; 40 chu kì gồm bước: 98oC/10 giây, 60oC/30 giây, 72oC/1 phút; chu kì 72oC/3 phút Tiến hành điện di sản phẩm với gel 2% 100V 30 phút có chứa ethidium bromide Giải trình tự vùng BCP HBV Sản phẩm PCR vùng BCP tinh với kit Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE healthcare), bảo quản sản phẩm tinh nhiệt độ 4oC Sau giải trình tự đoạn gen mồi BCF2 (bảng 2) hệ thống điện di mao quản 3130 xl với thuốc thử ABI PRISM Big Dye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Ready reaction (AB, USA) PCR khuếch đại Exon gen p53 Sử dụng kít Hot Start Taq Polymerase Takara Thực phản ứng PCR với cặp mồi p53-7F p53-7R để khuếch đại vùng exon gen P53 người cần giải trình tự Các mồi thực PCR liệt kê bảng Chu trình nhiệt PCR sau: chu kì 98oC/3 phút; 40 chu kì gồm bước: 98oC/10 giây, 58oC/20 giây, 72oC/20 giây; chu kì 72oC/3 phút Tiến hành Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ Số * 2015 Nghiên cứu Y học điện di sản phẩm với gel 3% 100V 30 phút có chứa ethidium bromide kiểu đột biến vị trí hotspot R249S gen p53 người Bảng 1: Mồi xác định kiểu gen virus HBV Bảng 4: Kiểu gen, kiểu đột biến đôi A1762C G1764T HBV kiểu đột biến vị trí hotspot R249S gen p53 Mồi Trình tự (5’-3’) Mồi chung BGB2 GGC TCM AGT TCM GGA ACA GT Genotype B BB1R CAG GTT GGT GAG TGA CTG GAG A Genotype C BC1R GGT CCT AGG AAT CCT GAT GTT G Bảng 2: Mồi sử dụng PCR giải trình tự vùng BCP HBV Mồi BCF2 BCR2 Trình tự (5’-3’) AGC AAT GTC AAC GAC CGA CC AGT AAC TCC ACA GTA GCT CC Bảng 3: mồi sử dụng cho PCR giải trình tự vùng Exon gen p53(7) Mồi Trình tự (5’-3’) p53-7F GTT GGC TCT GAC TGT ACC AC PCR-RFLP p53-7R CTG GAG TCT TCC AGT GTG AT p53-seq7F GGC CTC CCC TGC TTG CCA CA PCRsequencing p53-vu7R TGC AGG GTG GCA AGT GGC TC Cắt enzyme xác định đột biến codon 249 gen p53 Sử dụng cắt enzyme BsuRI (HaeIII) Thermo Scientific Thực phản ứng cắt theo hướng dẫn nhà sản xuất Ủ sản phẩm cắt 37oC Điện di sản phẩm cắt với gen 4% 70V 40 phút có chứa ethidium bromide Ngồi việc xác định đột biến vị trí hotspot R249S gen p53 phương pháp PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphysim – Đa hình chiều dài đoạn cắt hạn chế), khẳng định kết đột biến phương pháp giải trình gen vùng exon gen p53 người KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Trong 22 bệnh nhân nhóm nghiên cứu, bệnh nhân nhỏ tuổi 32 tuổi bệnh nhân lớn tuổi 69 tuổi Số bệnh nhân nam lớn gấp 2,1 lần so với số bệnh nhân nữ (15/7) Tất bệnh nhân chẩn đốn lâm sàng mắc ung thư biểu mơ tế bào gan dựa kết CT scan tăng AFP máu Bảng trình bày kết vầ kiểu gen, kiểu đột biến đôi A1762T G1764A HBV Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Bệnh nhân 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Giới Tuổi Đột biến Đột biến Genotype tính 1762/1764 (codon 249) Nam 69 B WT WT 49 Nữ C WT MT Nam 41 C WT MT Nam 35 C WT MT 41 Nam B WT MT Nam 53 B WT MT 55 Nữ B WT MT 32 Nữ C WT MT 43 Nữ C WT MT Nam 52 B WT WT Nam 57 B WT WT Nam 55 C WT MT Nam 55 C WT MT Nữ 53 C WT WT Nam 50 C WT MT Nữ 35 B WT WT 50 Nam C WT MT Nam 53 C WT MT Nam 39 C WT MT Nam 48 B WT WT 58 Nữ C WT MT Nam 39 B WT MT MT: mutation-đột biến WT: Wild type: thể hoang dại Kiểu gen HBV Xác định kiểu gen HBV cách sử dụng cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho kiểu gen virus Xác định kiểu gen chủ yếu dựa trình tự gen vùng gen S Đến có 10 loại genotype HBV xác định giới đặt tên từ A đến J, dựa vào khác biệt gen từ 8% trở lên Trong đó, genotype B, C A phổ biến nước châu Á, Việt Nam, có loại genotype B C, genotype B gấp ba lần so với genotype C(4) Trong 22 mẫu HCC này, có trường hợp mang kiểu gen B (41%) 13 trường hợp mang kiểu gen C (59%) Như bệnh nhân HCC, genotype C tương đối nhiều so với 335 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ Số * 2015 genotype B Trong đó, theo nghiên cứu khảo sát Cao Minh Nga cộng bệnh nhân nhiễm HBV tỉ lệ genotype B 69,6% genotype C 7,6%(1) Điều cho thấy bệnh nhân nhiễm HBV genotype C có khả cao mắc HCC Đột biến đơi vùng BCP nghiên cứu trước trẻ em mắc HCC, làm tăng hoạt động core promotor khoảng 2-8 lần Đột biến cho hình thành vị trí giả định gắn yếu tố chép nhân tế bào gan (transcription factor hepatocyte nuclear factor – HNF3)(2) Đột biến A1762C chưa thấy có báo cáo ghi nhận Giải trình tự vùng gen HbX có chứa vùng BCP Kết hiển thị CLC Main Workbench cho thấy tín hiệu nucleotide thể qua đỉnh sóng đều, tín hiệu khơng bị nhiễu Điều chứng tỏ sản phẩm phản ứng PCR giải trình tự có độ tinh cao, khơng bị tạp nhiễm, kết phân tích xác, khách quan có độ tin cậy cao Kết giải trình tự vùng BCP cho thấy có 15 trường hợp mang đột biến đôi A1762T, G1764A (68,2%); trường hợp mang đột biến A1762C, G1764T (4,5%) trường hợp không mang đột biến (27,3%) Tần suất đột biến nghiên cứu tương đương với nghiên cứu Shuang-Yuan Kuang cộng sự(11) Một trường hợp đột biến tìm thấy A1762C G1764T Đột biến G1764T biết đến Đột biến vùng core promotor ảnh hưởng tới biểu gen chép virus HBV Đột biến đôi A1762T G1764A mô tả nhiều trạng thái nhiễm HBV Ý nghĩa sinh học đột biến đôi nghiên cứu, đặc biệt có liên quan tới đột biến codon stop vùng precore Đột biến đôi BCP cho thấy số trường hợp nghiên cứu có HbeAg âm tính, diện đột biến đơi cho thấy có ức chế điều hòa sản xuất HBeAg Đột biến đơi làm giảm mức độ mRNA precore dẫn tới giảm hình thành HBeAg Đột biến gây gia tăng tần số bệnh lý HBV viêm gan kịch phát, viêm gan mạn tính có HBeAg anti-HBeAg dương tính, ung thư biểu mơ tế bào gan Tuy nhiên nhiều tranh cãi đột biến vùng địa lí khác 1762 17 1764 Sóng bình thường Sóng đột biến Sóng đột biến Hình 1: Đột biến vị trí 1762 1764 Xác định đột biến codon 249 gen p53 người phương pháp PCR-RFLP giải trình gen Sản phẩm PCR sau khuếch đại exon gen p53 110 bp(7) Trong trường hợp có đột biến codon 249 làm cho vị trí cắt enzym BsuRI Do sản phẩm điện di sau phản 336 ứng cắt enzym cắt hạn chế RE, dạng wt đồng hợp tử có băng sáng vị trí 74bp 36bp, dạng đột biến dị hợp tử có băng 110, 74 36 bp, dạng đột biến đồng hợp tử có băng sáng 110 bp Thực phản ứng PCR khuếch đại exon 22 trường hợp bệnh nhân Tiến hành xác Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ Số * 2015 định đột biến codon 249 phương pháp RFLP với enzyme HaeIII Sử dụng thang chuẩn ladder 50 bp để tính kích thước sản phẩm PCR Và kết 22 mẫu cho kết đồng hợp tử kiểu hoang dại với băng sáng vị trí 74 bp 36bp, khơng phát có đột biến codon khảo sát Để đảm bảo độ tin cậy PCR-RFLP, chúng tơi khẳng định kết khơng có đột biến vị trí 249 gen p53 người giải trình tự mẫu (31,8%) cho kết phù hợp Trong đó, nghiên cứu ShuangYuan Kuang cộng tỉ lệ đột biến codon 249 26,5%(11); theo Mengsu Yang cộng 33,3%(6) Đột biến đặc trưng cho nhiễm AFB1 thường liên kết với gốc G vùng giàu GC, dễ hình thành nên biến đổi từ G thành T Codon 249 gen p53 vị trí có nhiều GC dễ hình thành đột biến vị trí nhiễm AFB1 tần suất đột biến tùy thuộc vào mức độ phơi nhiễm AFB1 cho thấy vai trò gây bệnh HCC AFB1(10) Trong nghiên cứu không thấy đột biến hotspot 249 xuất hiện, trường hợp HCC chủ yếu có nguồn gốc viêm gan HBV mạn tính, khơng liên quan đến phơi nhiễm lâu dài với aflatoxin B1 dấu ấn sinh học giúp tiên lượng khả mắc HCC bệnh nhân bị viêm gan mạn HBV phơi nhiễm với aflatoxine B1 TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 KẾT LUẬN Nghiên cứu ứng dụng thành công kĩ thuật PCR, PCR-RFLP kĩ thuật giải trình tự việc phát kiểu gen đột biến HBV, đột biến hotspot codon G249T gen p53 người Nghiên cứu bước đầu cho thấy tỉ lệ HBV có genotype C mẫu huyết bệnh nhân HCC chiếm tới 59%, đột biến đôi 1762T/1764A phát phổ biến bệnh nhân HCC 68,2% Tuy nhiên, nghiên cứu chưa tìm đột biến codon 249 gen p53 người, cần có nghiên cứu sâu mở rộng khảo sát phạm vi đột biến cỡ mẫu lớn nhằm xác định xem đột biến có Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Nghiên cứu Y học 11 12 Cao Minh Nga, et.al., 2011 Sự phân bố kiểu gen (genotype) virus viêm gan B (HBV) trẻ em nhiễm HBV Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh Tập 15 Số Gerner, P., et.al., 1999 Hepatitis B virus core promoter mutations in children with multiple anti-HBe/HBeAg reactivations result in enhanced promoter activity J Med Virol 59, 415-423 Hamid, A.S., et al., 2013 Aflatoxin B1-induced hepatocellular carcinomas in developing countries: Geographical distributiton, mechanism of action and prevention Oncol Lett 5(4): p.1087-1092 Hideo Naito, et.al., 2001 Rapid and specific genotyping system for hepatitis B virus corresponding to six major genotypes by PCR using type-specific primers Journal of clinical microbiology 39(1), p 362-364 Masao Omata., et al., 2010 Asian Pacific Association for the Study of the Liver consensus recommendations on hepatocellular carcinoma Hepatol Int 4:439–474 Mengsu Yang, et.al.,1997 Mutations at codon 249 of p53 gene in human hepatocellular carcinomas from Tongan, China Mutation research 381 p:25-29 Nikolaidou A et,al., 1993 Detection of hepatitis B virus DNA and mutation in K-ras and p53 genes in human hepatocellular carcinomas International journal of oncology p.593-596 Okuda, K., et al., 1985 Natural history of hepatocellular carcinoma and prognosis in relation to treatment Study of 850 patients Cancer 56(4): p.918-28 Qi, L.N., et al., 2014 The p53 mutation spectrum in hepatocellular carcinoma from Guangxi, China: role of chronic hepatitis B virus infection and aflatoxin B1 exposure Liver int Stephanie villar, et.al., 2012 Aflatoxin-induced TP53 R249S mutation in hepatocellular carcinoma in Thailand: Association with tumor developing in the absence of liver cirrhosis Plos one 7(6) Shuang-Yuan Kuang, et.al., 2005 Hepatitis B 1762T/1764A mutations, hepatitis C infection and codon 249 p53 mutations in hepatocellular carcinomas from Thailand Cancer epidemiol biomarker and prevention, 14:380-384 Yang, M., et al., (1997) Mutations at codon 249 of p53 gene in human hepatocellular carcinomas form Tongan, China Mutat Res 381(1): p.25-9 Ngày nhận báo: 30/10/2014 Ngày phản biện nhận xét báo: 30/10/2014 Người phản biện: TS Bùi Chí Bảo Ngày báo đăng: 10/04/2015 337 ... genotype, đột biến đôi vùng BCP HBV, đồng thời phát đột biến codon 249 gen p53 người huyết bệnh nhân HCC kỹ thuật sinh học phân tử PCR, giải trình tự gen để tìm hiểu tỉ lệ đột biến kiểu gen HBV. .. kiểu gen đột biến HBV, đột biến hotspot codon G249T gen p53 người Nghiên cứu bước đầu cho thấy tỉ lệ HBV có genotype C mẫu huyết bệnh nhân HCC chiếm tới 59%, đột biến đôi 1762T/1764A phát phổ biến. .. Sóng đột biến Sóng đột biến Hình 1: Đột biến vị trí 1762 1764 Xác định đột biến codon 249 gen p53 người phương pháp PCR-RFLP giải trình gen Sản phẩm PCR sau khuếch đại exon gen p53 110 bp(7) Trong