1. Trang chủ
  2. » Luận Văn - Báo Cáo

XÁC ĐỊNH các đột BIẾN GEN katg LIÊN QUAN đến TÍNH KHÁNG THUỐC i SONIAZID của một số CHỦNG VI KHUẨN LAO tại VIỆT NAM

20 280 0

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 20
Dung lượng 333,83 KB

Nội dung

MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Nhiễm vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) là một những nhiễm trùng phổ biến nhất ở loài người Hiện tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lao được xác đị nh là chiếm 1/3 dân số thế giới Có khoảng triệu người mắc lao mới và triệu người chết lao mỗi năm Tuy vậy tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tí nh Vì vậy còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị và tiếp tục làm lây lan bệnh cho c ộng đồng Hiện nay, bệnh lao trở nên nghiêm trọng với đặc trưng là kháng đa thuốc Trong các trường hợp bệnh lao kháng đa thuốc, khó khăn không chỉ là điều trị thất bại cao , dẫn đến lan truyền nhanh chóng vi khuẩn lao kháng đa thuốc mà còn chưa tì m được những thuốc thay thế hiệu quả và hợp lý , các thuốc chống lao thực sự có hiệu quả chỉ tập trung co5́ thuốc Những bệnh nhân bị nhiễm các chủng vi khuẩn lao kháng đa thuốc rấ t khó điều trị Do đó việc phát hiện sớm các chủng vi khuẩn lao kháng đa thuốc sẽ góp phần đáng kể điều trị bệnh lao Để ch ẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc , hiện các sở nước vẫn phải dựa vào nuôi cấ y vi khuẩn và làm kháng sinh đồ chuẩn đoán lao kháng thuốc cần í t nhất Thời gian – tuần Với thời gian dài vậy sẽ khó khăn cho công tác điều trị , khó đáp ứng yêu cầu giám sát và toán bệnh lao Khắc phục nhữ ng nhược điểm đó , việc ứng dụng sinh học phân tử tạo những đột phá chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc chẩn đoán có thể rút ngắn xuống còn vài ngày Thời gian , với độ nhậy và độ đặc hiệu cao, tạo điều kiện cho việc kiểm soát bệnh lao dễ dàng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Các nghiên cứu về sinh học phân tử chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc đã chỉ rằng mỗi loại kháng thuốc là các gen tương ứng chịu trách nhiệm Ví dụ, nếu chỉ được độ t biến ở gen KatG cũng có nghĩa là chủng lao đó kháng isoniazid Xuất phát từ những lý , chúng tiến hành đề tài : "Xác định các đột biến gen katG liên quan đến tí nh kháng thuốc i soniazid của một số chủng vi khuẩn lao tại Việt Nam" Mục tiêu nghiên cứu Nhân bản đoạn gen katG từ các chủng vi khuẩn lao nghiê n cứu Phát hiện đột biến gen katG liên quan đến tính kháng isoniazid các chủng vi khuẩn lao nghiê n cứu Nội dung nghiên cƣ́u - Nhân bản đoạn gen katG từ các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu - Tạo vector tái tổ hợp và biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E coli - Tách dòng gen katG - Giải trình tự gen katG - Phát hiện, phân tích đột biến gen katG liên quan đến tí nh kháng thuốc isoniazid ở các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình bệnh lao 1.1.1 Tình hình bệnh lao thế giới Bệnh lao gắn liền với sự phát triển xã hội loài người từ hàng ngàn năm nay, thế giới chưa và không có một quốc gia nào, một khu vực nào, một dân tộc nào không có người mắc bệnh lao và chết lao [1] Do sự phát minh các thuốc hóa học chống lao khiến việc chữa lao đơn giản và hiệu quả hơn, đồng thời đã phát sinh tâm trạng chủ quan của y giới, đã làm lãng quên bệnh nguy hiểm này Ngày nay, bệnh lao xuất hiện trở lại và với đại dịch HIV/AIDS trở thành một những nguyên gây mắc bệnh và tử vong chủ yếu, đặc biệt tại các nước phát triển Năm 1993, Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) đã tuyên bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu của bệnh lao và mối hiểm hoạ của nó tương lai là bệnh lao kháng thuốc [22] Hiện nay, thế giới có khoảng 2,2 tỷ người đã nhiễm lao (chiếm 1/3 dân số thế giới) Theo số liệu công bố của TCYTTG (2004), ước tính năm 2003 có thêm khoảng triệu người mắc lao và triệu người chết lao Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết lao các nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ độ tuổi lao động Trong đó, có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao [1,22] Hiện nay, tỷ lệ điều trị thành công toàn cầu đạt 82%, tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, và theo Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ước tính của TCYTTG, mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới bị nhiễm lao (65 triệu người) [22] Hơn 33% số bệnh nhân lao toàn cầu tại khu vực Đông nam Châu Á Dưới là ước tính bệnh nhân lao mắc năm 2002 theo khu vực [22] Bảng 1.1: Ƣớc tính bệnh nhân lao mới mắc năm 2002 theo khu vực Số BN (nghìn) Khu vực Các thể Châu Phi Châu Mỹ Trung Đông Châu Âu Đông nam Châu Á Tây Thái Bình Dương Toàn cầu 2354 (26%) 370 (4%) 622 (7%) 472 (5%) 2890 (33%) 2090 (24%) 8797 (100%) Tỷ lệ/100 000 AFB Các AFB (+) thể (+) 1000 350 165 Tử vong lao (bao gồm nhiễm HIV) SL (nghìn) TL/100000 149 556 83 43 19 53 279 124 55 143 28 211 54 24 73 1294 182 81 625 39 939 122 55 373 22 3887 141 63 1823 29 Mức độ nặng nề của bệnh lao đã ảnh hưởng tới thu nhập quốc dân và chỉ số phát triển người của các quốc gia Các nghiên cứu về kinh tế y tế cho thấy, mỗi bệnh nhân lao sẽ mất trung bình 3-4 tháng lao động, làm giảm 20-30% thu nhập bình quân của gia đình Những gia đình có người chết sớm vì bệnh lao có thể sẽ mất tới 15 năm thu nhập Bệnh lao đã tác động mạnh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn tới 70% đối tượng lao động chính của xã hội, làm lực lượng sản xuất bị giảm sút, suất lao động giảm và mùa màng, chợ búa sẽ không tham gia được Diễn đàn các đối tác chống lao lần thứ nhất diễn năm 2001 tại trụ sở của ngân hàng thế giới Washington D.C với sự có mặt của đại diện cấp Bộ trưởng từ các quốc gia có tình hình bệnh lao nặng nề đã nhận định, bệnh lao là nguyên nhân chủ yếu làm nghèo đói dai dẳng và là trở ngại đối với sự phát triển kinh tế xã hội [22] Bệnh lao là bệnh của người nghèo, lây lan nhanh cộng đồng có điều kiện sống chật chội, thiếu vệ sinh, thông khí và dinh dưỡng Trên 95% số bệnh nhân lao, 98% số chết lao toàn cầu thuộc các nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số người mắc bệnh lao các lứa tuổi 14-55, tuổi làm nhiều của cải nhất cuộc đời [1, 22] Bệnh lao là kết quả của nghèo đói và nghèo đói lại là nguyên nhân làm cho bệnh lao phát triển 1.1.2 Tình hình bệnh lao ở Việt Nam Ở nước ta, bệnh lao còn phổ biến và mức độ trung bình cao Việt Nam đứng thứ 13 22 nước có số bệnh nhân lao cao toàn cầu (TCYTTG, 2004) Trong khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung Quốc và Philipinnes về số lượng bệnh nhân lao lưu hành cũng bệnh nhân lao xuất hiện hàng năm [1] Năm 1995, trước những biến động xấu của tình hình dịch tễ bệnh lao toàn cầu, công tác chống lao thực sự bắt đầu phải đối mặt với những thách thức là bệnh lao kháng thuốc và Lao/HIV, Nhà nước và Bộ Y tế Việt Nam đã quyết định đưa Chương trình chống lao thành một những Chương trình y tế quốc gia trọng điểm Cùng với sự đầu tư phát triển Chương trình y tế quốc gia nói chung, Bộ Y tế và Chính phủ đã ưu tiên đầu tư đồng bộ lượng rất lớn cán bộ, kinh phí và trang thiết bị cho Chương trình Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn chống lao Ban chỉ đạo Chương trình chống lao và chính quyền địa phương các cấp đã tham gia tích cực triển khai công tác này, với sự hợp tác và giúp đỡ có hiệu quả về tài chính và kỹ thuật của các tổ chức quốc tế [4] Năm 1996, Chương trình chống lao quốc gia (CTCLQG) với sự hỗ trợ về kỹ thuật và tài chính của Chính phủ Hà Lan, hiệp hội chống lao hoàng gia Hà Lan, uỷ ban hợp tác y tế Hà Lan - Việt Nam, CTCLQG đã hình thành và xây dựng kế hoạch phòng chống lao giai đoạn 1996-2000 Đến năm 1999, chiến lược DOTS (điều trị bằng hoá trị liệu ngắn ngày có kiểm soát trực tiếp) đã được bao phủ 100% số huyện cả nước [4] Trong giai đoạn 1997-2002, CTCLQG đã phát hiện được 532.703 bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện đạt 82% số bệnh nhân ước tính (so với mục tiêu của TCYTTG là 70%), CTCLQG đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi AFB (+) với tỷ lệ khỏi là 92% [3] Năm 2002, khu vực Tây Thái Bình Dương phát hiện 806.460 bệnh nhân lao các thể, 372.220 bệnh nhân lao phổi AFB (+) Trong đó, số bệnh nhân CTCLQG Việt Nam phát hiện chiếm 12% bệnh nhân các thể và 15% số bệnh nhân lao phổi AFB (+) [1] Với những kết quả đạt được chỉ tiêu phát hiện và điều trị bệnh nhân, năm 1996, Việt Nam là nước đầu tiên Châu Á đã đạt được mục tiêu của TCYTTG Việt Nam đã được TCYTTG và ngân hàng thế giới đánh giá cao thành tích đạt được mọi hoạt động chống lao Từ năm 1997, TCYTTG hiệp hội lao bệnh phổi quốc tế phối hợp với CTCLQG Việt Nam tổ chức khoá học về quản lý Chương trình chống lao cho các học viên quốc tế tại Việt Nam Mô hình hoạt động chống lao Việt Nam được xem là mô hình để học viên các nước học tập [4] Vì là một số ít nước sớm nhất đạt được các mục tiêu phòng chống lao TCYTTG đề ra, những kết quả đạt được có tính bền vững, nên tháng 10 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn năm 2003 vừa qua CTCLQG Việt Nam đã nhận được giải thưởng của hội chống lao hoàng gia Hà Lan (KNCV) nhân lễ kỷ niệm 100 năm ngày thành lập tổ chức Nhân ngày thế giới chống lao, 24/3/2004, tại diễn đàn các đối tác chống lao lần thứ TCYTTG tổ chức tại New Dehli, CTCLQG Việt Nam là một nước thế giới (bao gồm: Việt Nam, Peru, Madives, Cuba, Tunisia và Morocco) và là nước nhất 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao được nhận giải thưởng của TCYTTG về thành tích đã đạt được mục tiêu của TCYTTG và kết quả có tính bền vững năm [4] Hiện nguy nhiễm lao hàng năm nước ta ước tính là 1,5% (ở các tỉnh phía nam là 2%, các tỉnh phía bắc là 1%) Ước tính với dân số 70-80 triệu, hàng năm nước ta có một s ố lượng lớn người bị mắc lao mới Số lư ợng người mắc lao mới được thể h iện qua bảng 1.2 Bảng 1.2: Bảng ƣớc tính số bệnh nhân mắc lao mới qua mỗi năm ở Việt Nam Số mắc lao (mọi thể): 130.000 Số lao phổi BK dương tính mới: 60.000 Tổng số trường hợp lao: 260.000 Tổng số lao phổi BK dương tính: 120.000 Nước ta thuộc loại trung bình về dịch tễ lao so với các nước vùng Tây Thái Bình Dương, vùng dịch tễ lao vào loại trung bình thế giới Trên thực tế có thể chỉ số nguy nhiễm lao hàng năm có thể cao 1,5% vậy các số nêu có thể còn lớn Điều đó sẽ tăng thêm sự khó khăn đối với công tác chống lao không những những năm tới mà có thể còn thời gian khá dài, cả đã bước sang thiên niên kỷ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.1.3 Tình hình lao kháng thuốc Theo báo cáo dựa thăm dò lớn về lao kháng thuốc toàn cầu của TCYTTG công bố ngày 26/2/2008, tỷ lệ nhiễm lao kháng nhiều thuốc hiện mức cao chưa có Mỗi năm có khoảng nửa triệu ca lao kháng đa thuốc, theo ước tính của TCYTTG, chiếm khoảng 5% số triệu ca nhiễm lao hàng năm Cũng báo cáo này, lần đầu tiên lao kháng thuốc cực mạnh được đề cập, là một dạng gần không chữa lành được [5] Theo TCYTTG, hiện bệnh lao kháng thuốc là một vấn đề toàn cầu, đặc biệt nghiêm trọng là tình hình kháng đa thuốc Bệnh lao kháng thuốc xuất hiện có vi khuẩn lao kháng với một nhiều loại thuốc chống lao, nguyên nhân là bệnh nhân không hợp tác, không tuân thủ đúng nguyên tắc điều trị được quy định của chương trì nh chống lao , một nguyên nhân khác hay gặp là thầy thuốc kê đơn không đúng không phối hợp đầy đủ các thuốc chống lao, liều lượng thuốc không đủ, hướng dẫn bệnh nhân không đúng cách, điều trị không đủ thời gian Kết quả điều trị với bệnh nhân kháng thuốc thường không cao, nhất là đối với bệnh nhân kháng đa thuốc Chi phí điều trị bệnh nhân lao kháng đa thuốc tăng lên 100 lần so với bệnh nhân lao không kháng thuốc và thậm chí không điều trị được một số trường hợp Tỷ lệ kháng đa thuốc bệnh nhân lao khu vực Tây Thái Bình Dương dao động khoảng 1% đến 10,8% (theo một số nghiên cứu khu vực) [4] Dự án nghiên cứu kháng t huốc lao sở toàn c ầu được thực hiện từ năm 1995 với mục tiêu là xác đị nh được tổng số bệnh nhân lao kháng thuốc thế giới bằng những phương pháp thống nhất thử độ nhạy với thuốc lao của vi khuẩn Năm 1998, TCYTTG đã công bố kết quả khảo sát tì nh hì nh vi khuẩn lao kháng thuốc ở 35 nước và khu vực thế giới [6] Theo công bố này , tỷ lệ kháng thuốc tiê n phát trung bì nh với riêng từ ng loại thuốc có khác , cụ thể là : kháng isoniazid 3,2%, rifampicin 0,2%, Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ethambutol 0,3%, steptomycin 2,5% %, đó kháng steptomycin ở vùng Ivanovo (Nga) là nơi kháng đơn thuốc cao nhất Tỷ lệ kh áng thuốc tiên phát trung bì nh là 9,9 % đó kháng thuốc chiếm 6,6 %, kháng thuốc chiếm 2,5 %, kháng thuốc chiếm 0,6 %, kháng bốn thuốc chiếm 0,2 %, kháng đa thuốc trung bì nh là 1,4 % Tỷ lệ kháng thuốc tiên phát cao n hất 40,6 % cộng hòa Dominica , thấp nhất là 2% cộng hòa Séc [6] Tình hình kháng thuốc mắc phải với loại thuốc cũng khác kháng isoniazid trung bì nh : 6,3 %, rifampicin 0,7 %, ethambutol 0,4 %, steptomycin 2,6 % Kháng thuốc mắc phải với steptomycin ở Cuba có tỷ lệ cao nhất 57 % Tỷ lệ kháng thuốc mắc phải trung bình toàn thế giới là 36 %, đó kháng loại thuốc 12,2 %, loại thuốc 9,7 %, loại thuốc 5,4 %, loại thuốc 4,4 % Lao kháng đa thuốc mắc phải có tỷ lệ trung bì nh là 13 % Kháng đa thuốc mắc phải cao nhất Latvia , có tỷ lệ 54 % [6] Vi khuẩn lao kháng đa thuốc là một thách thức lớn , đe dọa công cuộc phòng chống lao toàn cầu , vì các thuốc chống lao có hiệu quả hiện bị vi khuẩn lao kháng lại nhất là kháng đa thuốc Trong các thuốc chống lao hàng đầu chỉ có năm thuốc thì các thuốc chống lao loại hai lại thường có độc tí nh cao và giá thành đắt [5] Việc nghiên cứu lao kháng thuốc ở Việt Nam được tiến hành khá sớm Năm 1958 Phạm Ngọc Thạc h và cộng sự đã công bố t ỷ lệ kháng thuốc mắc phải v ới isoniazid là 53 %, với paraminosalicylic acid là 26 %, với steptomycin là 59 % [6] Báo cáo của CTCLQG năm 1998 cho thấy tì nh hì nh kháng thuốc của vi khuẩn lao ở Việt Nam là một vấn đề đáng lo ngại Tỷ lệ kháng thuốc tiên phát là 32,5 % đứng thứ tư khảo sát của TCYTTG sau Latvia (34%), Thái Lan (36,6%), và Cộng hòa Dominica (40,6%) Qua các nghiên cứu đã cho thấy Việt Nam là một những quốc gia có tỷ lệ bệnh lao kháng thuốc cao thế giới [6] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc là nguyên nhân dẫn đến thấ t bại điều trị Những bệnh nhân lao mới có thể chữa khỏi 95 – 100% Nhưng bệnh nhân lao kháng thuốc mắc phải , tỷ lệ chữa khỏi chỉ 20 – 30% [22] Kết quả còn thấp nữa ở những trường hợp kháng đa thuốc mắc phải, thậm chí không chữa được Nguy hiểm là các bệnh nhân này có thể tiếp tục truyền bệnh cho người khác Vì vậy việc phát hiện và ngăn chặn sự lan tràn của các chủng lao kháng đa thuốc là vấn đề quan trọng nhất chiến lược điều trị lao hiện 1.2 Vi khuẩn lao 1.2.1 Đặc điểm phân loại Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria , ngành Actinobacteria , bộ Actinomycetales , phân bộ, họ Mycobacteriaceae, giống Mycobacterium [18] Tên khoa học của vi khuẩn lao là: Mycobacterium tuberculosis Các chủng vi khuẩn lao được chia làm tuberculosis gồm bốn nhóm : Mycobacterium loài có khả gây bệnh người , và nhóm Mycobacteria other than tuberculosis gồm nhiều loài không gây bệnh ở người [6,7] 1.2.2 Đặc điểm hình thể Vi khuẩn lao có hình trực khuẩn , kích thước – μm, rộng 0,3 – 1,5 μm Trực khuẩn mảnh , đứng riêng lẻ hoặc xếp thành hì nh chữ N , Y, V hoặc thành dãy phân nhánh cành Vi khuẩn lao không di động , không sinh bào tử, khó bắt màu các thuốc nhuộm thông thường có lớp sáp thành tế bào [7] 1.2.3 Khả gây bệnh Các bệnh lý nhiễm trùng là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu thế giới Không chỉ có những bệnh nhiễm trùng phát sinh mà những bệnh nhiễm trùng cũ gây chết người đã biết từ lâu cũng tái xuất hiện Hơn nữa tỉ lệ vi khuẩn gây bệnh đề kháng kháng sinh ngày càng tăng cao là nguy lớn cho sức khỏe cộng đồng Những bằng chứng gần cho thấy các tác nhân gây bệnh rất khác đều sử dụng những phương thức chung để 10 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn phát động quá trình nhiễm trùng và gây bệnh Những chế này tạo nên độc lực của vi khuẩn Tìm hiểu các chế mà vi khuẩn sử dụng để xâm nhập và gây bệnh có ý nghĩa quan trọng cuộc chiến chống lại các tác nhân bé nhỏ này [7] Độc lực của vi khuẩn lao có liên quan đến “Cord factor” (trehalose – 6,6’ – dimycolate ) là chất gây ức chế hoạt động của tế bào bạch cầu , gây nên những u hạt mãn tí nh Miễn dị ch bệ nh lao ngày được xác đị nh là đáp ứng miễn dị ch qua trung gian tế bào Đáp ứng miễn dị ch làm chậm sự nhân lên của vi khuẩn lao , gây hạn chế sự lan tràn của vi khuẩn lao , dẫn tới phá hủy tế bào vi khuẩn Đáp ứng miễn d ịch bệnh lao phát sinh một phản ứng quá muộn Một số trường hợp vi khuẩn lao có khả ức chế hoặc tiêu diệ t trở lại bạch cầu người và tồn tại dưới dạng ngủ các u hạt nên thể không tiêu diệt được Đặc biệt các trường hợp lao kháng thuốc thể không tiêu diệt được vi khuẩn và các thuốc cũng không tác động được Đó là một vấn đề nan giả i điều trị bệnh lao [8] Vi khuẩn lao có thể vào thể qua nhiều đường , thườ ng là qua đường hô hấp, bên cạnh đó là các đường tiêu hóa , da, kết mạc mắt Sau gây tổn thương tiên phát , vi khuẩn lao có thể theo đường bạch huyết hoặc đường máu tới quan khác gây tổn thương thứ phát Nhiều quan : phổi, thận, màng não , xương, hạch, da đều có thể bị vi khuẩn lao xâm nhập , thường bị cả là phổi và vị trí gặp nhiều nhất là đỉ nh phổi , nơi có phân áp oxy 120 mmHg [6] 1.2.4 Hệ gen của vi khuẩn lao Hệ gen của v i khuẩn lao đã được đọc trì nh tự , có chiều dài 4.411.522 cặp base đó có 3.924 trình tự được dự đoán là có mã hóa protein , tỷ lệ G + C chiếm đến 65,6% Genome của vi khuẩn lao có chứa tới 90,8 % trình tự mã hóa protein và chỉ có gen giả [28] 11 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.3 Gen KatG và tính kháng thuốc isoniazid ở vi khuẩn lao Gen katG là một đoạn DNA có kích thước 2223 bp, nằm nhiễm sắc thể của vi khuẩn lao và chị u trách nhiệm mã hóa cho enzyme catalase - peroxidase Người ta nhận thấy có khoảng 95% các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid có đột biến gen này [28] Gen katG mã hóa cho enzyme catalase-peroxidase Enzyme này hoạt hóa isoniazid bằng cách kết hợp axyl isonicotinic với NADH để tạo thành phức hệ axyl isonicotinic-NADH Phức hệ này liên kết chặt chẽ với enzyme ketoenoylreductase (mã hóa gen InhA), theo đó làm ngăn cản chất enoyl-AcpM Quá trình này làm ức chế sự tổng hợp axit mycolic cần cho thành tế bào vi khuẩn lao Cơ chế phân tử của tính kháng isoniazid chủ yếu có liên quan tới đột biến thêm đoạn/mất đoạn các đột biến nhầm nghĩa/vô nghĩa, đó chủ yếu diễn tại codon 315 và 463 (S315T) của gen katG mã hóa catalase-peroxidase Nếu có sự biến dạng hay đột biến base thứ tại codon 315 của gen katG (AGC biến thành ACC hay ACA) sẽ dẫn đến làm giảm mất hoàn toàn hoạt tính của enzyme catalase-peroxidase đó M tuberculosis sẽ trở thành kháng thuốc isoniazid [51] Do đó phát hiện sự thay đổi di truyền này gen katG có thể cung cấp một phương pháp sàng lọc nhanh và chính xác cho việc phát hiện các chủng M tuberculosis kháng isoniazid 1.4 Chẩn đoán vi khuẩn lao kháng Isoniazid Vi khuẩn lao kháng isoniazid được xác định theo phương pháp chẩn đoán kiểu gen Các phương pháp chẩn đoán kiểu gen đều dựa sở xác đị nh đột biến ở các gen có liên quan kháng thuốc tương ứng Để xác đị nh đột biến gen katG hiện có nhiều phương pháp , song giải trình gen là phương phá p bản, chính xác , rõ ràng nhất Tuy nhiên là phương pháp không phải nơi nào cũng làm được vì đòi hỏi máy móc thiết bị đắt tiền và nhân lực có trì nh độ để vận hành khai thác [28] 12 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Giải trình tự (DNA squencing ) là phương pháp xác đị nh vị trí sắp xếp các nucleotide phân tử DNA Nguyên lý của phương pháp này là : Tổng hợp các mạch đơn DNA mới có độ dài ngắn mạch khu ôn, nhờ kỹ thuật đánh dấu và ngắt đoạn quá trì nh tổng h mạch đơn kém một base ợp mạch DNA , thu được các từ đó có được sơ đồ trật tự mạch DNA khuôn mẫu So sánh trật tự của mẫu thí nghiệm với trật tự DNA ch uẩn ta biết được vị trí các sai lệch (đột biến) [33] Ứng dụ ng các kỹ thuật sinh học phân tử đã xác đị nh các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid là có đột biến ở gen katG Codon xảy đột biến là codon 315 [34] Sự đột biến xảy là thay thế nucleotid e ở codon 315 (AGC  ACC hoặc AGC  ACA) [34] Để giải trì nh tự gen katG, hiện người ta có thể thực hiện trực tiếp từ sản phẩm PCR Khi sản phẩm PCR là đơn nhất và có độ dài thích hợp cho việc phân tí ch kết quả thì có thể thực hiện giải trì nh giải trình tự thông tự trực tiếp Cũng có thể qua tách dòng , gắn đoạn gen katG cần nghiên cứu vào vector Đoạn gen cùng với vector tái tổ hợp được nhân lên tế bào E.coli Khi giải trì nh tự gen , cả đoạn gen katG và phần vector đề u được xác đị nh trình tự Giải trình tự thông qua tách dòng được ứng dụng sản phẩm PCR không được tốt , đặc biệt là các trường hợp gây đột biến nhân tạo kiểm chứng kháng thuốc và nghiên cứu biểu h iện gen [6] 13 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Các chủng vi khuẩn lao M tuberculosis được cung cấp Học viện Quân y Bảng 2.1: Đặc điểm kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn lao Mã DNA Mã Chủng Kháng thuốc ĐA1 TB06-22 HSRE ĐA2 TB06-23 HSRE ĐA3 TB06-26 HSRE ĐA4 TB06-27 HSR ĐA5 TB06-28 HSRE ĐA6 TB06-31 HSRE ĐA7 TB06-33 HSRE ĐA8 TB06-35 HSR ĐA9 TB06-36 HSRE ĐA10 TB06-37 HSRE ĐA11 TB06-38 HSRE ĐA12 TB06-39 HSR ĐA13 TB06-41 HSRE ĐA14 TB06-51 HSRE 14 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2 Vật liệu thiết bị và dụng cụ nghiê n cƣ́u 2.2.1 Các sinh phẩm hóa chất Bảng 2.2: Các sinh phẩm hóa chất Tên hóa chất Hãng sản xuất H/c dùng PCR Tris base Applied BioSciences (Mỹ) Lysozyme Fermentas (Mỹ) Proteinase K Sigma (Mỹ) Agarose Sigma (Mỹ) Thang chuẩn DNA Fermentas (Mỹ) EDTA Fermentas (Mỹ) Taq-DNA-polymerase Fermentas (Mỹ) H/c sinh phẩm dùng tách dòng Pepton Fermentas (Mỹ) Yeast Extract Fermentas (Mỹ) Nacl Fermentas (Mỹ) Agar Fermentas (Mỹ) Ampicilin Fermentas (Mỹ) X-gal Fermentas (Mỹ) IPTG Fermentas (Mỹ) Accuprep plasmid Mini Extraction Kit Fermentas (Mỹ) EcoRI Fermentas (Mỹ) pBT Fermentas (Mỹ) H/c phục vụ giải trì nh tƣ̣ gene Big Dye Terminator V3.1 Applied BioSciences (Mỹ) HiDi Formamid Applied BioSciences (Mỹ) Ethanol tuyệ đối Fermentas (Mỹ) 15 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.2 Các máy và thiết bị Bảng 2.3: Các máy và thiết bị Tên máy, thiết bị Hãng sản xuất Tủ ấm ổn nhiệt Sanyo (Nhật Bản) Máy PCR (GenAmp PCR System 9700) Applied BioSciences (Mỹ) Máy PCR (Thermo cycle) Bio-rad (Pháp) Máy ly tâm (Biofuge Primo R) Heraeus (Mỹ) Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320) Thommas Scientific (Mỹ) Máy chụp ảnh Gel-Doc Dolphin (Mỹ) Tủ lạnh -200C, -800C Nuaire (Mỹ) Lò vi sóng Sanyo (Nhật Bản) Tủ an toàn sinh học cấp II Nuaire Nuaire (Mỹ) Bể ổn nhiệt Memmert (Đức) Máy lắc Gyromax 737R Amerex Instrument (Đức) Máy quang phổ tử ngoại khả biến Nano Drop Analitika (Đức) Máy phân tích trình tự DNA ABI 3100- Applied BioSciences (Mỹ) Avant 2.2.3 Các mồi dùng nghiên cứu Các mồi đặc hiệu cho phát hiện trực khuẩn lao và lao kháng thuốc được sử dụng cho phản ứng PCR n hân các đoạn gen đí ch có trì nh tự tương ứng là : - Cặp mồi dùng cho nhân trì nh tự gen katG: KatG F: 5'-GAG CCC GAT GAG GTC TAT TG-3' KatG R: 5'-ACA AGC TGA TCC ACC GAG AC-3' - Cặp mồi dùng cho giải trình tự gen katG: M13 F: 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3' M13 R: 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' Các trình tự này được gửi tổng hợp công ty Invitrogen , Hồng Kông 16 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.3 Phƣơng pháp nghiên cƣ́u 2.3.1 Thiết kế nghiên cƣ́u Tiến hành nghiên cứu theo phương pháp : - Dịch tễ học mô tả, điều tra cắt ngang, có đối chứng - Thực nghiệm labo có đối chứng Sơ đồ nghiên cƣ́u DNA (Tách từ vi khuẩn lao đã đƣợc xác đị nh tí nh kháng thuốc) Nhân bản đoạn gen katG sƣ̉ dụng mồi đặc hiệu Sản phẩm gen KatG Tách dòng gen KatG Sản phẩm vector có đoạn gen KatG Xác định đột biến liên quan đến tí nh kháng INH Giải trình tự gen KatG 17 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.3.2 Các kỹ thuật cụ thể 2.3.2.1 Kỹ thuật nhân bản đoạn gen katG sử dụng mồi đặc hiệu Sơ đồ qui trì nh nhân bản đoạn gen KatG Đo nồng độ DNA của mẫu nghiên cƣ́u Tính toán giá trị các thành phần phản ứng PCR Tạo hỗn hợp phản ứng Nhân gen theo chu trì nh nhiệt đã đƣợc tối ƣu hóa Điện di kiểm tra vạch đặc hiệu Sƣ̉ dụng sản phẩm PCR làm DNA chèn vào plasmid Cụ thể: Sau đo nồng độ DNA khuô n, tính và tạo các nồng độ DNA của các mẫu nha u để đưa vào hỗn hợp sản phẩm một thể tí ch DNA khuôn, và đạt khoảng 100 ng/thể tí ch 25µl phản ứng Tính các giá trị của các thành phần khác 18 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 2.4: Tính toán các thành phần cho phản ứng PCR Thành phần phản ứng PCR Thể tí ch (µl) Nước Nồng độ 10,25 MgCl2 (25 mM) 2,5 mM PCR bufer (10X) 2,5 1X dNTP mix (5mM) 2,5 0,2 mM Mồi KatG F 0,5 µM Mồi KatG R 0,5 µM 0,25 unit Taq Polymerase DNA khuôn Tổng 25 Các thành phần này phản ứng của các mẫu bệnh phẩm đều giống Có đối chứng âm tiến hành phản ứng Chu trì nh nhiệt sau : 35 chu kỳ 950C phút 950C phút 720C phút 720C phút 560C 45 giây 40C 60 phút Điện di sản phẩm PCR a garose 1,5%, nhuộm Ethidium bromide và đọc kết quả máy Gel - Doc 19 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.3.2.2 Kỹ thuật tách dòng (cloning), tạo sản phẩm phục vụ giải trình tự gen katG Sơ đồ qui trì nh tách dòng Tinh sạch và gắn đoạn gen vào vector tách dòng pBT tạo vector tái tổ hợp Đƣa vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến Nuôi cấy tế bào có vector Lƣ̣a chọn tế bào mang vector tái tổ hợp theo nguyên tắc chọn lọc khuẩn lạc xanh trắng Kiểm tra và tách plasmid Thu plasmid, kiểm tra đoạn gen Sau nhân bản thành công đoạn gen katG, chúng tiến hành làm sạch (thôi gel) bằng bộ kit QIAquick Gel Extraction Trong quá trì nh thao tác đèn tí m rất có thể bị đứt gẫy các nucleotide sẽ gây ảnh hưởng k hông tốt tới sản phẩm kết nối , vì vậy trước k hi thực hiện phản ứng kết nối tiến hành thực hiện phản ứng nối đầu A chúng Thành phần phản ứng được trình bày bảng 2.5 20 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn [...]... M tuberculosis sẽ trở thành kháng thuốc isoniazid [51] Do đó phát hiện sự thay đô i di truyền này trong gen katG có thể cung cấp một phương pháp sàng lọc nhanh và chính xác cho vi ̣c phát hiện các chủng M tuberculosis kháng isoniazid 1.4 Chẩn đoán vi khuẩn lao kháng Isoniazid Vi khuẩn lao kháng isoniazid được xác i nh theo phương pháp chẩn đoán kiểu gen Các phương... http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.3 Gen KatG và tính kháng thuốc isoniazid ở vi khuẩn lao Gen katG là một đoạn DNA có kích thước 2223 bp, nằm trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn lao và chị u trách nhiệm mã hóa cho enzyme catalase - peroxidase Ngươ i ta nhận thấy có khoảng 95% các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid có đột biến trên gen này [28] Gen katG mã hóa cho enzyme catalase-peroxidase Enzyme... chứng - Thực nghiệm labo có đô i chứng Sơ đồ nghiên cƣ́u DNA (Tách từ vi khuẩn lao đã đƣợc xác i nh tí nh kháng thuốc) Nhân bản đoạn gen katG sƣ̉ dụng mô i đặc hiệu Sản phẩm gen KatG Tách dòng gen KatG Sản phẩm vector có đoạn gen KatG Xác i nh đột biến liên quan đến tí nh kháng INH Gia i trình tự gen KatG 17 Số hóa b i Trung tâm Học liệu – Đ i học Th i Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn... isoniazid bằng cách kết hợp axyl isonicotinic v i NADH để tạo thành phức hệ axyl isonicotinic-NADH Phức hệ này liên kết chặt chẽ v i enzyme ketoenoylreductase (mã hóa b i gen InhA), theo đó làm ngăn cản cơ chất enoyl-AcpM Quá trình này làm ức chế sự tổng hợp axit mycolic cần cho thành tế bào vi khuẩn lao Cơ chế phân tử của tính kháng isoniazid chủ yếu có liên. .. đoán kiểu gen đều dựa trên cơ sở xác i nh đột biến ở các gen có liên quan kháng thuốc tương ứng Để xác i nh đột biến trên gen katG hiện có nhiều phương pháp , song gia i trình gen vẫn là phương phá p cơ bản, chính xác , rõ ràng nhất Tuy nhiên đây là phương pháp không pha i n i nào cũng làm được vi đo i ho i máy móc thiết bị đắt tiền và nhân lực có trì... thí nghiệm vơ i trật tự DNA ch uẩn ta biết được vi trí các sai lệch (đột biến) [33] Ứng dụ ng các kỹ thuật sinh học phân tử đã xác i nh các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid là do có đột biến ở gen katG Codon xảy ra đột biến là codon 315 [34] Sự đột biến xảy ra là do thay thế nucleotid e ở codon 315 (AGC  ACC hoặc AGC  ACA) [34] Để gia i trì nh tự gen. .. [6] 1.2.4 Hệ gen của vi khuẩn lao Hệ gen của v i khuẩn lao đã được đọc trì nh tự , có chiều da i 4.411.522 cặp base trong đó có 3.924 trình tự được dự đoán là có mã hóa protein , tỷ lệ G + C chiếm đến 65,6% Genome của vi khuẩn lao có chứa tơ i 90,8 % trình tự mã hóa protein và chỉ có 6 gen giả [28] 11 Số hóa b i Trung tâm Học liệu – Đ i học Th i Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn... gia i trì nh tự gen katG, hiện nay ngươ i ta có thể thực hiện trực tiếp từ sản phẩm PCR Khi sản phẩm PCR là đơn nhất và có độ da i thích hợp cho vi ̣c phân tí ch kết quả thì có thể thực hiện gia i trì nh gia i trình tự thông tự trực tiếp Cũng có thể qua tách dòng , gắn đoạn gen katG cần nghiên cứu vào vector Đoạn gen cùng vơ i vector ta i tổ hợp được nhân... tế bào E.coli Khi gia i trì nh tự gen , cả đoạn gen katG và 1 phần vector đề u được xác i nh trình tự Gia i trình tự thông qua tách dòng được ứng dụng khi sản phẩm PCR không được tốt , đặc biệt là trong các trường hợp gây đột biến nhân tạo kiểm chứng kháng thuốc và trong nghiên cứu biểu h i ̣n gen [6] 13 Số hóa b i Trung tâm Học liệu – Đ i học Th i Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn... sinh phẩm dùng trong tách dòng Pepton Fermentas (Mỹ) Yeast Extract Fermentas (Mỹ) Nacl Fermentas (Mỹ) Agar Fermentas (Mỹ) Ampicilin Fermentas (Mỹ) X-gal Fermentas (Mỹ) IPTG Fermentas (Mỹ) Accuprep plasmid Mini Extraction Kit Fermentas (Mỹ) EcoRI Fermentas (Mỹ) pBT Fermentas (Mỹ) 3 H/c phục vụ gia i trì nh tƣ̣ gene Big Dye Terminator V3.1 Applied BioSciences (Mỹ) HiDi Formamid Applied BioSciences

Ngày đăng: 06/06/2016, 12:58

TỪ KHÓA LIÊN QUAN

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN