Khảo sát đột biến Gien PBP2B liên quan đến tính kháng thuốc kháng sinh ở Streptococcus pneumoniae

Bài viết khảo sát đột biến Gien PBP2B liên quan đến tính kháng thuốc kháng sinh ở Streptococcus pneumonia thông qua chủng vi khuẩn, phương pháp PCR, kiểm tra hiệu quả nhân bản các trình tự 2B1, 2B2, 2B3…

25(1): 51-54 Tạp chí Sinh học 3-2003 Khảo sát đột biến gien pbp2b liên quan đến tính kháng Thuốc kháng sinh streptococcus pneumoniae Đỗ Thanh Ngân, Nguyễn Hoàng Chơng Thái Kế Quân, Hồ Huỳnh Thùy Dơng Trờng đại học Khoa học tự nhiên Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh Streptococcus pneumoniae tác nhân gây bệnh viêm màng n o mủ viêm đờng hô hấp, viêm xoang mũi Trong năm 1940, chủng S pneumoniae phân lập đợc nhạy cảm với thuốc kháng sinh penixillin nên thuốc đợc định dùng điều trị bệnh nhiễm phế cầu khuẩn Trờng hợp kháng penixillin S pneumoniae đợc ghi nhận Nam Phi vào năm 1977 [1] Việt Nam, tình trạng dùng thuốc kháng sinh không kiểm soát, không theo dẫn bác sĩ đ làm tăng nhanh tợng kháng thuốc kháng sinh nhiều loại vi khuẩn năm gần Nghiên cứu tình hình kháng thuốc số vi khuẩn ngời khỏe mạnh cộng đồng năm 1999 (tại ba địa điểm ngoại thành Hà Nội, HuÕ vµ thµnh Hå ChÝ Minh) cho thÊy tû lƯ ng−êi kháe m¹nh mang vi khn S pneumoniae cã ®éc lùc lµ 40,1% ë Hµ Néi, 16,7% ë HuÕ 30,9% thành phố Hồ Chí Minh Kết nghiên cứu cho thấy tỷ lệ S pneumoniae đa kháng thành phố Hồ Chí Minh cao hẳn ë H vµ Hµ Néi (53% so víi 16% ë Hà Nội 32,1% Huế) Tính nhạy cảm với penixillin S pneumoniae đ giảm 19,6%, tính chung cho địa phơng Sự đề kháng penixillin S pneumoniae biến đổi gien pbp, m hóa cho protein gắn với penixillin (penicillin binding protein - PBP) màng tế bào vi khuẩn Các biến đổi làm thay đổi cấu trúc PBP khiến khả liên kết chúng thuốc kháng sinh họ lactam giảm Vì vậy, vi khuẩn trở nên không bị tác động thuốc kháng sinh [1] Chúng dùng kỹ thuật PCR để nhân số trình tù cđa gien pbp2b, sau ®ã dïng kü tht SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) để phát trình tự có mang đột biến I phơng pháp nghiên cứu Chđng vi khn 20 chđng vi khn S pneumoniae kh¸ng penixillin, chủng vi khuẩn nhạy penixillin chủng S pneumoniae ATCC 49619 sử dụng đề tài nghiên cứu đợc cung cấp khoa vi sinh, bệnh viện Nhi Đồng I khoa vi sinh, bệnh viện Chợ Rẫy, Tp Hồ Chí Minh Phơng pháp a) Phơng pháp PCR àl ADN vi khuẩn tách chiết theo phơng pháp đun sôi đợc dùng làm mẫu cho phản ứng PCR Thể tích phản ứng 25 µl cã chøa 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH = 8, 1,5 mM MgCl2, 12,5 pmol loại mồi P5 P6 [1], 200 nM loại deoxyribonucleotit (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), 1,5 U Taq DNA polymeraza (promega) Ch−¬ng trình PCR đợc thiết lập nh sau : 93oC phót; tiÕp theo lµ 30 chu kú bao gåm: 93oC-1 phót, 55oC-1 phót, 72oC-1 phót; ci cïng lµ 72oC-5 phút Sản phẩm tạo có kích thớc 684 bp (cặp base) Để phục vụ cho kỹ thuật SSCP - kỹ thuật phân tích hiệu trình tù ADN cã kÝch th−íc d−íi 400 bp, chóng t«i thiết kế mồi "trong" nhằm nhân đoạn có kích thớc theo yêu cầu từ trình tự 684 bp nói Các cặp mồi đợc thiết kế phần mềm Clustal X, Annhyb Trình tự mồi kích 51 thớc sản phẩm PCR tơng ứng đợctrình bày bảng sau: Tên mồi Trình tự P5 P22 P23 P24 P25 P6 5’- CTGACCATTGATTTGGCTTTCCAA – 3’ 5’- GAGCTGAACCTTGGAAGACG – 3’ 5’- CGTCTTCCAAGGTTCAGCTC – 3’ 5’- CATGATTCCAAGAGCGGTTT – 3’ 5’- GGCCAGACCTATCAACCAAA – 3’ 5’- TTTGCAATAGTTGCTACATACTG –3’ S¶n phẩm 684 bp đợc pha lo ng 100 lần; àl đợc sử dụng làm mẫu cho phản ứng PCR Phản ứng PCR đợc tiến hành với thành phần phản ứng chơng trình đ nêu phần Các sản phẩm PCR sau đợc phân tích điện di gel agaroza 1% b) Phơng pháp SSCP Khi đợc điện di gel không biến tính, mạch đơn DNA nhận cấu hình đặc trng đợc quy định trình tự nucleotit Sự thay đổi base trình tự làm thay đổi cấu hình này, dẫn đến di chuyển không giống trình điện di Chúng phát diện đột biến DNA phơng pháp Các sản phẩm PCR đợc biến tính cách đun 100oC phút làm lạnh đột ngột Sau Kích thớc sản phẩm PCR 331 cặp base (đoạn 2B1) 130 cặp base (đoạn 2B2) 242 cặp base (đoạn 2B3) ADN biến tính đợc điện di gel polyacrylamit 8% Quá trình điện di đợc tiến hành 12-14 với hiệu 120V 4oC Sau điện di, gel đợc nhuộm bạc để xác định vị trí vạch tơng ứng với ADN mạch đơn [2, 3, 4] ii Kết thảo luận Kiểm tra hiệu nhân trình tự 2B1, 2B2, 2B3 Chúng sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại trình tự 2B1, 2B2, 2B3 tõ gien pbp2b cña 20 chñng vi khuÈn Streptococcus pneumoniae kháng penixillin Kết điện di sản phẩm khuếch đại vài chủng gel agaroza 1% đợc trình bày hình Hình Kết điện di gel agaroza trình tự gien pbp2b đợc nhân PCR 1: thang X-174 HaeIII 2: mẫu chứng âm 3, 4, 5: đoạn 2B1, 2B2, 2B3 cña chñng S pneumoniae SR15 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14: đoạn tơng ứng chủng S pneumoniae SR20, SR25, SR30 Kết cho thÊy ë c¶ chđng S pneumoniae thư nghiƯm có xuất sản phẩm PCR có kích thớc nh dự kiến 52 lần lợt 331bp, 130bp 242bp Điều chứng tỏ cặp mồi thiết kế đ hoạt động tốt Để kiểm tra tính đặc hiệu sản phẩm PCR, tiến hành lai phân tử (Southern blotting) sản phẩm PCR với mẫu dò đánh dấu DIG-dUTP Mẫu dò sản phẩm 2B3 chủng S pneumoniae ATCC 49619 đ đợc xác định trình tự so sánh với trình tự GenBank (http://ncbi.nlm.nih.gov) Kết cho phép khẳng định tính đặc hiệu sản phẩm PCR thu đợc (kết không trình bày) Kết phân tích kỹ thuật SSCP trình tự pbp 2B1, 2B2, 2B3 cđa 20 chđng S pneumoniae kh¸ng penixillin Vài kết tiêu biểu phân tích đoạn 2B1 chủng kháng có đối chiếu với chủng nhạy đợc trình bày hình Hình Kết điện di gel polyacrylamit trình tự 2B1 từ số chủng kháng nhạy với penixillin 1: ADN không biến tính 2: đoạn 2B1 chủng S pneumoniae nhạy 3-9: đoạn 2B1 chủng S pneumoniae kháng SR25, SR15, SR26, SR18, SR22, SR20, SR23 Kết cho thấy có dạng điện di khác nhau, tạm gọi dạng I, II, III, IV trình tự 2B1 chủng khảo sát Dạng I bao gồm chủng SR25 (giếng 3) SR26 (giếng 5), dạng II bao gåm chđng SR15, SR18, SR22 (giÕng 4,6,7), d¹ng III cã chủng SR20 (giếng 8) dạng IV có chủng SR20 (giếng 9) Các kết đoạn 2B1, 2B2, 2B3 20 chủng khảo sát cho thấy có dạng điện di khác đoạn 2B1, dạng điện di đoạn 2B2 dạng điện di đoạn 2B3 Các dạng điện di khác phản ánh diện đột biến điểm trình tự khảo sát Tổng kết trình tự khảo sát chủng kháng, thu đợc kết nh sau: Sự xuất đột biến trình tự 2B1, 2B2, 2B3 gien pbp2b Không có đột biến trình tự Chỉ xảy trình tự Chỉ xảy trình tự Chỉ xảy trình tự Xảy trình tự Xảy trình tự Xảy tr×nh tù Chđng vi khn 33, 34 15, 22, 23, 24 25, 27, 28 26, 29 18, 29 32 16, 17, 19, 21, 30, 31 53 Số lợng lớn dạng điện di khác trình tự tơng đối ngắn cho thấy vùng biến động cao Điều phù hợp với công bố trớc cho thấy trình tự ADN gien pbp2b S pneumoniae nằm hai mồi P5 P6 tơng ứng với vùng m hóa cho hoạt tính transpeptidaza vùng thờng xuyên xảy đột biến [1] Các đột biến ảnh hởng không ảnh hởng đến cấu trúc PBP Chỉ đột biến làm thay đổi cấu trúc PBP2B làm thay đổi tính kháng vi khuẩn Trong phần nghiên cứu tiếp theo, tiến hành xác định đột biến iii Kết luận Kỹ thuật SSCP sử dụng cho phép phát diện đột biến điểm trình tự nhân từ gien pbp2b 20 chủng S pneumoniae kháng penixillin Vùng trình tự khảo sát vïng cã tÝnh biÕn ®éng di trun lín, thĨ hiƯn qua số lợng lớn dạng điện di SSCP khác chủng kháng thử nghiệm TàI liệu tham kh¶o Mignon du Pleissis, Anthony M Smith, Keith P Klugman., 1998: Journal of Clinical Microbiology, 36: 453-457 E P H Yap and J O'D McGee, 1994: Non-isotopic single strand conformation polymorphism (SSCP) analysis of PCR products PCR technology current innovations CRC Press, 165-177 Peter Nollau and Christoph Wagener 1997: Clinical chemistry, 43: 1114-1128 Steve E Humphiries et al., 1997: Clinical chemistry, 43: 427-435 POINT MUTATION ANALYSIS OF the PBP2B (PENIcILLIN BINDING PROTEIN) GENE IN PENICILLIN RESISTANT Streptococcus PNEUMONIAE STRAINS ngan, Nguyen Hoang Chuong, Thai Ke Quan, ho huynh thuy duong summary We amplified three fragments (2B1, 2B2, 2B3) corresponding to the transpeptidase encoding region of pbp2b gene in 20 penicillin-resistant strains of S pneumoniae isolated from clinical samples The fragments were then analysed by SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) electrophoresis We identified seven SSCP electrophoretic patterns of 2B1, four of 2B2 and five of 2B3 fragments This high variation in electrophoretic mobility of these fragments shows the great genetic variation of the studied region The sequencing of these fragments will confirm our results Ngµy nhËn bµi:15-4-2002 54 ... đột biến [1] Các đột biến ảnh hởng không ảnh hởng đến cấu trúc PBP Chỉ đột biến làm thay đổi cấu trúc PBP2B làm thay đổi tính kháng vi khuẩn Trong phần nghiên cứu tiếp theo, tiến hành xác định đột. .. Kü tht SSCP sư dơng cho phép phát diện đột biến điểm trình tự nhân từ gien pbp2b 20 chủng S pneumoniae kháng penixillin Vùng trình tự khảo sát vùng có tính biến động di truyền lớn, thể qua số lợng... chủng khảo sát cho thấy có dạng điện di khác đoạn 2B1, dạng điện di đoạn 2B2 dạng điện di đoạn 2B3 Các dạng điện di khác phản ánh diện đột biến điểm trình tự khảo sát Tổng kết trình tự khảo sát