Enterococcus faecalis là cầu khuẩn Gram dương, thuộc vi hệ bình thường ở đường ruột, cũng có thể tìm thấy trong miệng, hầu họng và âm đạo. Bài viết trình bày xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của nano bạc đối với Enterococcus faecalis phân lập tại Bệnh viện Da liễu Trung ương.
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC 121 2, , ,(7 72, ,(8 12 % Trịnh Thị Hương*, Lê Văn Hưng** TÓM TẮT Enterococcus faecalis cầu khuẩn Gram dương, thuộc vi hệ bình thường đường ruột, tìm thấy miệng, hầu họng âm đạo Tuy nhiên, E faecalis gây nhiều nhiễm trùng nghiêm trọng nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn tiết niệu, viêm nội tâm mạc, viêm màng não Tỷ lệ E faecalis kháng thuốc gia tăng nhanh chóng, đặc biệt kháng vancomycin khiến cho việc điều trị gặp nhiều khó khăn Mục tiêu: Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) nano bạc Enterococcus faecalis phân lập Bệnh viện Da liễu Trung ương Phương pháp nghiên cứu: 30 chủng E faecalis phân lập từ bệnh nhân có hội chứng tiết dịch âm đạo đến khám Bệnh viện Da liễu trung ương cho tiếp xúc với nano bạc nồng độ khoảng thời gian khác để đánh giá khả tiêu diệt E faecalis nano bạc Kết quả: tác dụng diệt khuẩn nano bạc tỷ lệ thuận với nồng độ thời gian tiếp xúc MBC nano bạc E faecalis sau tiếp xúc, sau 15 phút, giờ, 62,5mg/L; 31,25mg/L; 31,25mg/L; 15,625mg/L; 3,95mg/L Kết luận: Nano bạc có hiệu diệt khuẩn cao, nồng độ thấp thời gian tiếp xúc đủ dài Từ khóa: nano bạc, Enterococcus faecalis, Bệnh viện Da liễu trung ương I ĐẶT VẤN ĐỀ Enterococcus faecalis cầu khuẩn Gram dương, thuộc vi hệ bình thường đường ruột, tìm thấy miệng, hầu họng âm đạo [1] Tuy nhiên, suy giảm miễn dịch gặp điều kiện thuận lợi E faecalis gây nhiều nhiễm trùng nghiêm trọng * Bộ môn Vi sinh-Ký sinh trùng lâm sàng ** Bộ môn Da liễu, Trường Đại học Y Hà Nội nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn tiết niệu, viêm nội tâm mạc, viêm màng não [2] Tỷ lệ E faecalis kháng thuốc gia tăng nhanh chóng, đặc biệt kháng vancomycin khiến cho việc điều trị gặp nhiều khó khăn Bạc biết đến kim loại có khả diệt khuẩn từ sớm Trong lịch sử, dung dịch keo bạc sử dụng để điều trị bệnh nấm da, vết thương, vết bỏng, bệnh miệng Giữa kỷ XX, xuất Số 27 (Tháng 09/2018) DA LIỄU HỌC NGHIÊN CỨU KHOA HỌC thuốc kháng sinh với hiệu lực kháng khuẩn mạnh - Môi trường thạch máu, tủ ấm CO2 (Thermo), làm cho mức độ sử dụng thuốc có nguồn tủ an toàn sinh học, tủ lạnh thường, tủ âm sâu, gốc từ bạc giảm dần Tuy nhiên, năm gần máy đo độ đục (BioMérieux), máy vortex (IKA), xuất gia tăng nhanh chóng nhuộm Gram nhiều vi khuẩn kháng thuốc, tính kháng khuẩn bạc lại ý Các thuốc có nguồn gốc từ bạc có phổ kháng khuẩn rộng bị vi khuẩn kháng tác dụng [3] Công nghệ nano xuất đem lại nhiều ý nghĩa to lớn, thúc đẩy phát triển lĩnh vực đặc biệt y học Công nghệ nano giúp chia nhỏ phân tử bạc kích thước nhỏ, nano mét, làm tăng diện tích bề mặt bạc nhờ khả diệt khuẩn tăng lên gấp nhiều lần Nhiều kết nghiên cứu cho thấy, nano bạc có hoạt tính kháng khuẩn cao vi khuẩn Gram dương Gram âm Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio cholerae [4],[5] Hiện nay, Việt Nam chưa có nghiên cứu thực E faecalis Do đó, chúng tơi tiến hành đề tài: “Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu nano bạc 2.3 Phương pháp nghiên cứu: mô tả cắt ngang, thực kỹ thuật xét nghiệm Labo 2.3.1 Chuẩn bị chủng E faecalis 30 chủng E faecalis thử nghiệm phân lập từ bệnh phẩm mủ, dịch viêm bệnh nhân có hội chứng tiết dịch âm đạo dựa tiêu chuẩn: - Nhuộm soi: tiêu nhuộm Gram, vi khuẩn có hình cầu, bắt màu Gram dương, xếp thành chuỗi - Nuôi cấy: sau 18-24 nuôi cấy thạch máu E faecalis tạo thành khuẩn lạc màu xám, dạng S, có đường kính khoảng 1mm, gây tan máu hoàn toàn Bắt khuẩn lạc nhuộm soi thấy cầu khuẩn bắt màu Gram dương, xếp thành chuỗi vi khuẩn Enterococcus faecalis” ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng 30 chủng vi khuẩn Enterococcus faecalis phân lập từ bệnh phẩm mủ, dịch viêm bệnh nhân mắc hội chứng tiết dịch âm đạo đến khám Bệnh viện Da liễu Trung ương 2.2 Vật liệu - Dung dịch nano bạc có nồng độ 500mg/L cung cấp Phịng Cơng nghệ thân môi trường, Viện Công nghệ môi trường Các hạt nano bạc có kích thước 10-30 nm điều chế phương pháp dùng Sodium Borohydride (NaBH4) khử dung dịch bạc nitrat DA LIỄU HỌC Số 27 (Tháng 09/2018) Hình 2.1 Cấy chuyển E faecalis thạch máu - Test Catalase: âm tính - Phản ứng xác định nhóm liên cầu: âm tính - Thử nghiệm Bile Esculin: dương tính Các chủng E faecalis sau phân lập bảo quản môi trường Skim milk nhiệt độ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC -800C Trước thử nghiệm, cấy chuyển lần nồng độ 500mg/L; 250mg/L; 125mg/L, 62,5mg/ chủng lên thạch máu để kiểm tra ổn định L;31,25mg/L; 15,625mg/L; 7,81mg/L; 3,95mg/L; đặc tính sinh học Sau kiểm tra, tiến hành pha 1,97mg/L; 0,95mg/L tương ứng với hệ huyền dịch vi khuẩn để thực th nghim s pha loóng 1, ẵ, ẳ, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 2.3.2 Chuẩn bị dung dịch nano bạc với nồng 1/256, 1/512 độ khác Ống chứng: cho vào 2ml nước cất vô trùng Dung dịch nano bạc pha loãng 10 2ml dd Nano bạc Hình 2.2 Pha lỗng dung dịch nano bạc nồng độ khác 2.3.3 Đánh giá khả diệt khuẩn nano 2.3.4 Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu bạc E faecalis nano bạc E faecalis Pha hỗn hợp huyền dịch vi khuẩn Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimum dung dịch nano bạc nồng độ khác nhau, Bactericidal Concentration-MBC) nồng độ thấp điều chỉnh độ đục đạt 0,5 McFarland (tương làm giảm 99,9% lượng vi khuẩn ban đầu đương 108 CFU/ml) Vortex để trộn hỗn hợp Trong nghiên cứu này, MBC dung dịch nano Cấy trải 100µl hỗn hợp lên mơi trường thạch máu, bạc nồng độ ống mà cấy lên môi trường nuôi cấy 370C, 5-7%CO2 Đối chứng có nước khơng có khuẩn lạc mọc cất vơ trùng khuẩn lạc vi khuẩn E faecalis Tác dụng diệt khuẩn đánh giá dựa số lượng khuẩn lạc E faecalis cịn mọc mơi trường so với nồng độ vi khuẩn ban đầu sau khoảng thời gian tiếp xúc với dung dịch nano bạc Số lượng khuẩn lạc hỗn hợp nồng độ thời gian tiếp xúc mọc đĩa nuôi cấy tính trung bình 30 chủng Số liệu xử lý theo chương trình Excell 2016 KẾT QUẢ 3.1 Đánh giá khả diệt khuẩn nano bạc vi khuẩn Enterococcus faecalis Tại nồng độ thời gian ủ cụ thể, hỗn hợp E faecalis dung dịch nano bạc cấy lên môi trường thạch máu ủ 370C, 5-7% CO2 Sau 24 giờ, đếm số lượng khuẩn lạc mọc tính giá trị trung bình 30 chủng Số 27 (Tháng 09/2018) DA LIỄU HỌC NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Biểu đồ 3.1 cho thấy nồng độ thấp Ở nồng độ 31,25mg/L, nano bạc có khả tiếp xúc thời gian ngắn, nano bạc có tiêu diệt 90% E faecalis khả tiêu diệt E faecalis Tác dụng diệt vừa tiếp xúc Ở nồng độ 3,91 mg/L, nano bạc có khuẩn nano bạc tỷ lệ thuận với nồng độ khả tiêu diệt 96,67% 100% E faecalis thời gian tiếp xúc ủ tương ứng Biểu đồ 3.1 Khả diệt khuẩn nano bạc chủng E faecalis theo thời gian tiếp xúc DA LIỄU HỌC Số 27 (Tháng 09/2018) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC 3.2 Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu nano bạc vi khuẩn Enterococcus faecalis thấy khuẩn lạc 30 chủng E faecalis Sau 24 nuôi cấy, với thời gian tiếp xúc Nhóm nghiên cứu xác định nồng độ giờ, 15 phút, giờ, giờ, ống có nồng độ nano bạc 62,5mg/L; 31,25mg/L; nghiên cứu xuất môi trường diệt khuẩn tối thiểu nano bạc E faecalis theo khoảng thời gian tiếp xúc (Bảng 3.1) 31,25mg/L; 15,625mg/L; 3,95mg/L không phát Thời gian 15 phút giờ MBC (mg/L) 62,5 31,25 31,25 15,625 3,91 Bảng 3.1 Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu nano bạc E faecalis theo thời gian tiếp xúc BÀN LUẬN 4.1 Khả diệt khuẩn nano bạc Enterococcus faecalis lý thuyết hấp thụ thuyết phục Bản chất thuyết chỗ tế bào vi khuẩn bị vơ hiệu hóa kết trình tương tác tĩnh điện bề mặt mang điện tích âm Hiệu diệt khuẩn nano bạc đánh tế bào ion Ag+ hấp phụ lên đó, ion giá dựa số lượng khuẩn lạc mọc sau 24 sau xâm nhập vào bên tế bào vi nuôi cấy so với số lượng vi khuẩn ban đầu Mẫu khuẩn vơ hiệu hóa chúng Với kích thước nhỏ chứng thực đồng thời để kiểm soát chất bé, hạt nano bạc có diện tích bề mặt lớn để lượng 30 chủng E faecalis nghiên cứu, mơi tương tác lớn, từ giúp cho nano bạc có hiệu trường ni cấy thao tác người thực diệt khuẩn vượt trội Enterococcus faecalis vi khuẩn có đường Kết thử nghiệm nhóm nghiên cứu ruột người khỏe mạnh, tìm thấy cho thấy, nano bạc có khả tiêu diệt miệng, cổ âm đạo Tuy nhiên, suy E faecalis vừa tiếp xúc Ở nồng độ giảm miễn dịch E faecalis gây nhiều nhiễm trùng nghiêm trọng nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn tiết niệu, viêm nội tâm mạc, viêm màng não Tỷ lệ E faecalis kháng thuốc gia tăng nhanh chóng, đặc biệt kháng vancomycin đặt thách thức lớn cho nhà lâm sàng Theo nghiên cứu Trần Thị Thanh Nga Bệnh viện Chợ Rẫy (2013), E faecalis nguyên nhân thứ hai gây nhiễm trùng tiết niệu với tỷ lệ kháng vancomycin vi khuẩn 4,1% [6] 31,25mg/L, nano bạc có khả tiêu diệt 90% E faecalis vừa tiếp xúc (