Escherichia coli (E. coli) là vi khuẩn gây bệnh hàng đầu trong viêm đường tiêu hóa và sinh dục - tiết niệu. E. coli có tỷ lệ kháng kháng sinh cao gây khó khăn nhiều cho việc điều trị. Bài viết trình bày việc xác định thời gian và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của nano bạc đối với các chủng E. coli gây bệnh được phân lập tại Bệnh viện Da liễu Trung ương.
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC XÁC ĐỊNH THỜI GIAN VÀ NỒNG ĐỘ DIỆT KHUẨN TỐI THIỂU CỦA NANO BẠC ĐỐI VỚI CÁC CHỦNG E COLI GÂY BỆNH PHÂN LẬP ĐƯC TẠI BỆNH VIỆN DA LIỄU TRUNG ƯƠNG Mai Thu Phương*, Lê Hạ Long Hải*, Hoàng Thị Thanh Hoa*, Lê Văn Hưng** TÓM TẮT Escherichia coli (E coli) vi khuẩn gây bệnh hàng đầu viêm đường tiêu hóa sinh dục - tiết niệu E coli có tỷ lệ kháng kháng sinh cao gây khó khăn nhiều cho việc điều trị Mục tiêu nghiên cứu: Xác định thời gian nồng độ diệt khuẩn tối thiểu nano bạc chủng E coli gây bệnh phân lập Bệnh viện Da liễu Trung ương Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng kỹ thuật pha loãng cấy đếm, thử nghiệm 30 chủng E coli với 10 nồng độ dung dịch nano bạc mốc thời gian ủ, từ xác định thời gian nồng độ diệt khuẩn tối thiểu nano bạc chủng E coli Kết quả: Ở nồng độ thấp (0,98 mg/L), nano bạc có khả tiêu diệt 99,86% chủng vi khuẩn E coli ủ tới Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu nano bạc chủng E coli phân lập xác định 31,25 mg/L tiếp xúc Kết luận: Khả diệt chủng E coli gây bệnh nano bạc tỷ lệ thuận với nồng độ thời gian tiếp xúc Từ khóa: Nano bạc, E coli ĐẶT VẤN ĐỀ mối quan tâm hấp dẫn ngành y dược [2] Cùng với phát triển cơng nghệ kĩ thuật Trước có kháng sinh, bạc sử dụng chất kháng khuẩn tự nhiên từ sớm [1] Đến thời kỳ hoàng kim kháng sinh, việc sử dụng bạc giảm đáng kể Tuy nhiên, vài thập kỷ gần đây, kháng kháng sinh ngày gia tăng, đặc biệt dòng đa kháng dẫn đến nhu cầu cần thay đổi kháng sinh đại, công nghệ nano giới điều trị, lúc việc sử dụng bạc lại trở thành làm giảm kích thước hạt, tỷ lệ diện tích bề mặt Phản biện khoa học: PGS.TS Nguyễn Hữu Sáu *Bộ môn Vi sinh-Ký sinh trùng lâm sàng, Trường Đại học Y Hà Nội **Bộ môn Da liễu, Trường Đại học Y Hà Nội thể tích tăng dẫn đến tăng hoạt tính diệt khuẩn sử dụng nghiên cứu y khoa để chẩn đốn, điều trị phịng ngừa bệnh tật vật liệu nano tác động sâu đến tế bào mơ người với tính độc hại thấp chất diệt khuẩn khác [3] Ứng dụng công nghệ nano giúp chia nhỏ phân tử bạc kích thước nhỏ tầm nano-mét, [4],[5] Khơng có tác dụng kháng khuẩn hiệu mà cịn có khả chống viêm tốt, nano Số 28 (Tháng 05/2019) A H 49 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC bạc ứng dụng để phát triển miếng dán, kem trị vết thương, vết bỏng, chế tạo mỹ phẩm, chất khử mùi dung dịch hỗ trợ tăng cường miễn dịch [6] 2.2 Vật liệu (1) Dung dịch nano bạc nồng độ 500 mg/L cung cấp Viện Công nghệ môi trường với hạt nano bạc có kích thước 10 - 30 nm E coli trực khuẩn đường ruột Gram âm, hiếu kỵ khí tùy điều kiện, vi khuẩn thuộc vi hệ bình thường đường tiêu hóa Tuy nhiên, E coli vi khuẩn gây bệnh quan trọng hàng đầu trường hợp tiêu chảy, viêm đường mật nhiễm khuẩn huyết [7] Hơn nữa, việc điều trị nhiễm khuẩn E coli gặp khó khăn tình trạng E coli kháng kháng sinh ngày phổ biến Tại nước phát triển thuộc tổ chức Hợp tác Phát triển kinh tế (OECD), tỷ lệ kháng số kháng sinh thông dụng kê đơn cho trẻ em nhiễm khuẩn tiết niệu E coli cao (tỷ lệ kháng ampicilin 53,4%, kháng trimethoprim 23,6%), chưa kể đến nước ngồi tổ chức OECD có tràn lan việc sử dụng kháng sinh không kê đơn [4] Trong bối cảnh E coli có tỷ lệ kháng kháng sinh cao nay, việc tìm biện pháp diệt khuẩn an tồn hiệu vơ cấp thiết điều chế phương pháp dùng Sodium Borohydride (NaBH4) khử dung dịch bạc nitrat (2) Môi trường giữ chủng Skim milk (3) Môi trường thạch thường (4) Que cấy, đèn cồn, tủ ấm CO2, tủ an toàn sinh học, tủ lạnh thường, tủ âm sâu, máy đo độ đục, máy vortex, nhuộm Gram (5) Chủng vi khuẩn E coli 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu Mô tả cắt ngang Sử dụng kỹ thuật xét nghiệm labo nhằm xác định thời gian nồng độ diệt khuẩn tối thiểu dung dịch nano bạc từ dung dịch gốc có nồng độ 500 mg/L chủng E coli gây bệnh phân lập từ bệnh phẩm dịch niệu đạo, âm đạo 2.3.2 Quy trình thực Nghiên cứu giúp xác định thời gian tác 30 chủng E coli thu thập từ bệnh phẩm động diệt khuẩn nồng độ diệt khuẩn tối thiểu dịch niệu đạo, âm đạo, làm bảo nano bạc chủng E coli gây bệnh quản môi trường Skim milk nhiệt độ -800C bệnh nhân phân lập Bệnh viện Da liễu Cấy chuyển lần thứ đĩa thạch thường, Trung ương điều kiện 35-370C/5-7% CO2 24 Lấy ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP chuyển lần môi trường thạch ống nghiêng khuẩn lạc đĩa thạch thường cấy điều kiện tương tự Nhận định khuẩn lạc: 2.1 Đối tượng Trên môi trường cấy chuyển, sau 24 nuôi cấy, 30 chủng E coli xác định ngun khuẩn lạc có đường kính - 1,5 mm, dạng S: tròn, gây bệnh, phân lập từ bệnh phẩm dịch niệu đạo, lồi, nhẵn bóng, bờ đều, màu trắng đục, nhuộm âm đạo bệnh nhân đến xét nghiệm soi kiểm tra làm thêm thử nghiệm tính chất Khoa Xét nghiệm Vi sinh - Nấm - Ký sinh trùng, sinh vật hóa học có nghi ngờ Từ khuẩn lạc Bệnh viện Da liễu Trung ương thuần, pha huyền dịch để thực thử nghiệm 50 A H Số 28 (Tháng 05/2019) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Nghiên cứu tiến hành với 10 độ pha loãng dung dịch bạc nano gốc Nồng độ pha loãng chia sau: Độ pha loãng 10 Tỷ lệ 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 Nồng độ (mg/L) 500 250 125 62,5 31,25 15,625 7,81 3,90 1,95 0,98 Pha ống chứng: Cho ml nước cất tiệt trùng vào ống nghiệm vô trùng đánh dấu Dùng ăng cấy vô trùng lấy khuẩn lạc E coli hòa vào ống dung dịch nano bạc trộn đến độ đục đạt 0,5 McFarland Chia hỗn hợp sang ống nghiệm vô trùng, tương ứng với KẾT QUẢ 3.1 Tác động diệt khuẩn theo thời gian ủ nồng độ nano bạc E coli điều kiện: không ủ, ủ 15 phút, giờ, Biểu đồ 3.1: Khả diệt khuẩn nano bạc Ghi thông tin lên ống tiến hành thử E coli theo thời gian nồng độ nghiệm Sau hết thời gian ủ, trộn sử dụng pipet bán tự động hút 100 µl hỗn hợp từ ống nhỏ lên bề mặt thạch Dùng ăng cấy vô trùng cấy trải lên môi trường Đặt đĩa cấy vào tủ ấm điều kiện 370C/5 - 7% CO2 Sau 24 lấy đĩa đọc kết Phương pháp đếm khuẩn lạc Sau 24 giờ, đĩa nuôi cấy lấy quan sát đếm khuẩn lạc Chụp ảnh đĩa môi trường chia ảnh thành vng có diện tích cm2 Nhận xét: Thời gian ủ lâu nồng độ Đếm số lượng khuẩn lạc ô vuông nhỏ cao, khả diệt khuẩn nano bạc tính tổng số lượng khuẩn lạc tốt Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimum 3.2 Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu nano bạc E coli Bactericidal Concentration - MBC) nồng độ Kết thu thử nghiệm 30 thấp chất kháng khuẩn làm giảm chủng E coli phân lập từ bệnh nhân cho thấy, 99,9% lượng vi khuẩn ban đầu [5] Trong nghiên nano bạc với nồng độ 31,25 mg/L có khả cứu này, nồng độ diệt khuẩn tối thiểu dung diệt khuẩn 100% vừa tiếp xúc dịch nano bạc xác định lượng khuẩn thời gian ủ thực Khả diệt khuẩn lạc mọc môi trường nuôi cấy ≤ 0,1% lượng mức 99,9% nồng độ nano bạc khuẩn lạc mẫu chứng 3,90 mg/L mốc thời gian thực Khả Số 28 (Tháng 05/2019) A H 51 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC diệt khuẩn giảm đáng kể nồng độ gian ủ nồng độ với chủng vi khuẩn trên, nano bạc giảm xuống 1,95 mg/L Tuy nhiên, thời gian ủ tối ưu cho khả diệt khuẩn nano bạc nồng độ chí 0,98 nano bạc nghiên cứu từ đến mg/L ủ với E coli 4.2 Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu nano bạc chủng E coli phân lập bệnh nhân tỷ lệ diệt khuẩn tăng lên tương ứng 99,87% 99,86% Cơ chế tác động nano bạc lên vi sinh vật BÀN LUẬN chưa hoàn toàn sáng tỏ, đa số nhà 4.1 Tác động diệt khuẩn nano bạc theo thời gian ủ nồng độ nano bạc chủng E coli phân lập nghiên cứu nêu quan điểm thống Thí nghiệm cho thấy, dung dịch nano tế bào vi sinh vật Điều khiến băn bạc gốc dung dịch pha lỗng tới khoăn nano bạc tác dụng lên tế bào nồng độ 3,90 mg/L có tác dụng tiêu diệt đến thể người gây hại đến sức khỏe hay không 99,9% chủng E coli không cần ủ Các tế bào động vật cấp cao có lớp màng bảo vệ (thời điểm 0h) Từ nồng độ 1,95 mg/L, tác dụng hoàn toàn khác so với tế bào vi sinh vật với hai lớp diệt khuẩn nano bạc chủng E lipoprotein giàu liên kết đơi có khả cho điện coli đạt sau ủ (< 10 CFU) Khi tiếp tử, khơng cho phép ion bạc xâm nhập tục giảm nồng độ nano bạc xuống 0,98 mg/L, Vì chúng khơng bị tổn thương tiếp xúc với tác dụng ức chế E coli đạt hiệu ủ với ion Mặt khác, người ta cho hạt khoảng thời gian 2h 4h nano bạc tác động đến nhiều khía cạnh sinh Bạc tác nhân kháng khuẩn phổ rộng, có khả tiêu diệt lượng lớn chủng vi sinh vật gây bệnh nấm vi khuẩn, bao gồm chủng E coli loài nghiên cứu nhiều Shahverdi cộng (2007) nano bạc làm tăng tác dụng diệt khuẩn nhiều loại kháng sinh Staphylococcus aureus Escherichia coli [9] Theo nghiên cứu Nguyễn Như Lâm cộng (2009), nồng độ diệt khuẩn tối thiểu nano chúng phá hủy chức hô hấp số chức khác tế bào, liên kết với DNA lý vi khuẩn nên vi khuẩn khó phát triển tính kháng chúng Tuy vậy, có nghiên cứu rằng, E coli dễ dàng phát sinh đột biến kháng với nano bạc tích lũy 100 hệ hệ thứ 200 có đột biến kháng nano bạc với tần suất cao [11] Mặc dù không tránh nguy từ vi khuẩn đột biến với gen kháng, việc tìm nồng độ nano bạc tối thiểu vừa diệt khuẩn vừa an toàn với tế bào thể nhiệm vụ cần thiết bạc với E.coli 3,125 mg/L sau tiếp xúc [10] Kết nghiên cứu cho thấy Nghiên cứu khẳng định lại chủng E coli phân lập từ bệnh nhân khả diệt khuẩn dung dịch nano bạc nhạy cảm với nano bạc từ nồng độ chủng E coli phân lập bệnh nhân, 31,25 mg/L cho tiếp xúc với nano bạc với tỷ đặc biệt khả diệt khuẩn tăng theo thời lệ diệt khuẩn 100% Khả diệt khuẩn 52 A H Số 28 (Tháng 05/2019) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC mức 99,9% nồng độ nano bạc SCENIHR (2014) “Are silver nanoparticles 3,90 mg/L mốc thời gian thực Khả safe? Implications for health, the environment diệt khuẩn giảm đáng kể nồng độ and microbial resistance” nano bạc giảm xuống 1,95 mg/L Tuy nhiên, Bryce, Ashley et al (2016) Global nano bạc nồng độ chí 0,98 Prevalence of Antibiotic Resistance in Paediatric mg/L ủ với E coli Urinary Tract Infections Caused by Escherichia coli tỷ lệ diệt khuẩn tăng lên tương ứng 99,87% and Association with Routine Use of Antibiotics 99,86% Kết thấp so với nghiên cứu in Primary Care: Systematic Review and Meta- Ruparelia cộng (2008) công bố nồng độ Analysis The BMJ, 15,352: i939 diệt khuẩn tối thiểu nano tiểu phân bạc nhiều chủng E coli 60 - 220 mg/L [12] KẾT LUẬN Khả diệt khuẩn dung dịch nano bạc E coli tăng theo thời gian ủ, nồng độ thấp (0,98 mg/L), nano bạc có khả tiêu diệt 99,86% chủng vi khuẩn E coli ủ tới Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu nano bạc E coli xác định 31,25 mg/L tiếp xúc Tác dụng diệt khuẩn nano bạc với E coli tốt, nghiên cứu góp phần mở hướng điều trị bệnh chuyên ngành Da liễu như: viêm kẽ, viêm âm hộ, loét da niêm mạc E coli loài vi khuẩn kháng thuốc khác Ngoài ra, ứng dụng nano bạc để sản xuất dung dịch sát trùng, La Vũ Thùy Linh cộng (2010) Công nghệ nano - cách mạng khoa học kỹ thuật kỷ 21 Tạp chí Khoa học Ứng dụng, số 12-2010, 47-49 Chử Thị Thu Huyền cộng (2014) Nano tiểu phân bạc triển vọng ứng dụng Dược học Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 30 (2), 23-32 Nguyễn Vũ Trung (2014) Vi sinh - Ký sinh trùng lâm sàng, tập I Nhà xuất Y học, Hà Nội, 134 Amyes S et al (1996) Antimicrobial Chemotherapy: Pocketbook CRC Press, 25 Shahverdi AR et al (2007) Rapid synthesis of silver nanoparticles using culture supernatants of Enterobacteria: A novel biological approach Process Biochem, 42(5), 919–23 kem bôi, miếng dán, gạc đắp vết thương 10 Nguyễn Như Lâm cộng (2009) nhiều sản phẩm khác băng vệ sinh, bỉm cho Nghiên cứu nồng độ diệt khuẩn tối thiểu độc trẻ em người già tính cấp dung dịch nano bạc Tạp chí Y học TÀI LIỆU THAM KHẢO Roe, A.L et al (1915) Collosol argentum and its ophthalmic uses British Med J, 1(2820), 104 thảm họa Bỏng 11 Graves, Joseph L et al (2015) Rapid Evolution of Silver Nanoparticle Resistance in Escherichia coli Frontiers in Genetics, (42) Rai, M.K et al (2012) Silver nanoparticles: the 12 Ruparelia J.P et al (2008) Strain Specificity powerful nanoweapon against multidrug-resistant in Antimicrobial Activity of Silver and Copper bacteria J Appl Microbiol, 112(5), 841-852 Nanoparticles Acta Biom Số 28 (Tháng 05/2019) A H 53 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SUMMARY DETERMINE THE MINIMUM BACTERICIDAL CONCENTRATION AND TIME-DEPENDENT MANNER OF SILVER NANOPARTICLES TO ESCHERICHIA COLI ISOLATED FROM PATIENTS AT THE NATIONAL HOSPITAL OF DERMATOLOGY AND VENEREOLOGY E coli is the most common cause of diarrhea, cholangitis, genital infections, urinary tract infections, and sepsis It is also established as the main cause of high rates of antibiotic resistance that makes infections untreatable or difficult-to-treat Purpose: To determine the minimum bactericidal concentration and time-dependent manner of silver nanoparticles for E coli isolated from patients at the National Hospital of Dermatology and Venereology Method: The laboratory diagnostic techniques were used to test 30 pathogenic E coli strains with 10 different concentrations of silver nanoparticles during different incubation periods, thus evaluating the minimum incubation time and minimum bactericidal concentration to observe a significant effect on E coli Results: At a very low concentration (0.98 mg/L), silver nanoparticles were capable of killing 99.86% of E coli strains when incubated for hours The minimum bactericidal concentration of silver nanoparticles for E coli isolates was determined to be 31.25 mg/L at all times of exposure Conclusion: Silver nanoparticles capacity to kill the tested E.coli strains is proportionally time- and concentration-dependent Key words: Silver nanoparticle, Escherichia coli 54 A H Số 28 (Tháng 05/2019) ... khả diệt khuẩn nano bạc tính tổng số lượng khuẩn lạc tốt Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimum 3.2 Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu nano bạc E coli Bactericidal... nhiên, thời gian ủ tối ưu cho khả diệt khuẩn nano bạc nồng độ chí 0,98 nano bạc nghiên cứu từ đến mg/L ủ với E coli 4.2 Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu nano bạc chủng E coli phân lập bệnh nhân tỷ lệ diệt. .. nồng độ thấp (0,98 mg/L), nano bạc có khả tiêu diệt 99,86% chủng vi khuẩn E coli ủ tới Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu nano bạc E coli xác định 31,25 mg/L tiếp xúc Tác dụng diệt khuẩn nano bạc với