Luận văn tốt nghiệp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) của thuốc natsol (kháng sinh thực vật) lên vi khuẩn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN DƯƠNG VÕ MỸ HẠNH XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CỦA THUỐC NATSOL (KHÁNG SINH THỰC VẬT) LÊN VI KHUẨN Trung tâm Học Edwardsiella ictaluri@ Tài liệu họchydrophila liệu ĐH Cần Thơ VÀ Aeromonas tập nghiên cứu LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THUỶ SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2008 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN DƯƠNG VÕ MỸ HẠNH XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CỦA THUỐC NATSOL (KHÁNG SINH THỰC VẬT) LÊN VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri VÀ Aeromonas hydrophila Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TỪ THANH DUNG NGUYỄN THỊ NHƯ NGỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THUỶ SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2008 MỤC LỤC MỤC LỤC DANH SÁCH HÌNH DANH SÁCH BẢNG LỜI CẢM TẠ TÓM TẮT CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trung tâm 2.1 Bệnh vi khuẩn E ictaluri gây 2.1.1 Một số đặc điểm vi khuẩn E ictaluri .9 2.1.2 Phân bố vi khuẩn E ictaluri 2.2 Bệnh vi khuẩn Aeromonas hydrophila .10 2.2.1 Một số đặc điểm vi khuẩn Aeromonas hydrophila 10 2.2.2 Hình dạng khuẩn lạc 10 2.2.3 Hình dạng tế bào 10 2.2.4 Phân bố Aeromonas hydrophila 11 2.2.5 Bệnh xuất huyết vi khuẩn A hydrophila 11 2.3 Cây thảo dược 12 2.3.1 Sơ lược thảo dược 12 2.3.2 Một vài thuốc thảo dược công dụng phòng trị bệnh thủy sản 12 2.3.3 Một số kết khoa học sử dụng thảo dược phòng trị bệnh thủy sản 13 2.4 Natsol 14 2.5 Chloramphenicol 14 2.6 Một số kết Học liệu ĐHxác định Thơ @ chế tốiliệu (MIC) thuốc kháng sinh cứu Cần nồng độ ức Tài thiểu học tập nghiên thảo dược .14 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 16 3.1.1 Thời gian nghiên cứu 16 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 16 3.2 Vật liệu nghiên cứu 16 3.2.1 Hố chất mơi ttrường 16 3.2.2 Thuốc kháng sinh 16 3.2.3 Dụng cụ thí nghiệm .16 3.2.4 Vi khuẩn thí nghiệm 17 3.3 Phương pháp nghiên cứu 17 3.3.1 Chuẩn bị nguyên liệu nghiên cứu .17 3.3.1.1 Chuẩn bị vi khuẩn 17 3.3.1.2 Chuẩn bị dung dịch thuốc kháng sinh 18 3.3.2 Thực nghiên cứu 20 3.3.2.1 Nghiên cứu thăm dò 20 3.3.2.1 Phương pháp lập kháng sinh đồ 21 3.3.2.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) môi trường thạch (Lila Ruangpan, 2004): 22 3.3.2.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) phương pháp pha loãng (Geert Huys, 2002): 23 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 25 4.1 Kết nghiên cứu thăm dò khoảng nồng độ ức chế thuốc kháng sinh thực vật natsol lên vi khuẩn gây bệnh cá tra 25 4.2 Xác định nồng độ MIC 26 4.2 Kết kiểm tra kháng sinh đồ thuốc natsol lên vi khuẩn E ictaluri A hydrophila 27 4.3 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thuốc Natsol lên vi khuẩn E ictaluri A hydrophila phương pháp pha loãng .28 4.3.1 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thuốc Natsol lên vi khuẩn A hydrophila 28 4.3.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thuốc Natsol lên vi khuẩn E ictaluri 30 4.2.3 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thuốc Natsol lên vi khuẩn E ictaluri A hydrophila phương pháp thạch 32 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 35 5.1 Kết luận 35 5.2 Đề xuất 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 Phụ lục A: Pha dung dịch nhuộm gram vi khuẩn .41 Phụ lục B: Phương pháp nhuộm Gram vi khuẩn .42 Phụ lục C: Pha môi trường 43 Phụ lục D: Pha nước muối sinh lý pha môi trường NB 44 Phụ lục E: Pha thuốc kháng sinh chloramphenicol natsol 45 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Kết nhuộm gram vi khuẩn E ictaluri vật kính 40X (gram âm – hình que) 10 Hình 2.2: Kết nhuộm gram vi khuẩn A hydrophila vật kính 40X (gram âm – hình que) 11 Hình 4.3: Kết MIC mơi trường thạch vi khuẩn A hydrophila (Đĩa đối chứng (trái), đĩa môi trường chứa thuốc nồng độ 375ppm (phải)) 34 Hình 4.4: Kết MIC mơi trường thạch vi khuẩn A hydrophila (Đĩa đối chứng (trái), đĩa môi trường chứa thuốc nồng độ 750ppm (phải)) 34 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Pha loãng nồng độ thuốc natsol cho hai chủng vi khuẩn theo phương pháp pha loãng hai lần 18 Bảng 3.2: Pha loãng nồng độ thuốc chloramphenicol cho hai chủng vi khuẩn theo phương pháp pha loãng hai lần 19 Bảng 3.3: Nuôi vi khuẩn hàm lượng thuốc khác (cho chủng vi khuẩn) 19 Bảng 3.4: Nuôi vi khuẩn hàm lượng thuốc khác (cho chủng vi khuẩn) 20 Bảng 4.1: Kết nghiên cứu thăm dò nồng độ ức chế tối thiểu thuốc Natsol vi khuẩn E ictaluri 26 Bảng 4.2: Nồng độ ức chế tối thiểu thuốc chloramphenicol E coli 27 Bảng 4.3: Kết kháng sinh đồ kiểm tra độ nhạy thuốc natsol đĩa kháng sinh tự chế 28 Bảng 4.4: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thuốc kháng sinh natsol vi khuẩn A hydrophila chủng CAF2 29 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Bảng 4.5: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) natsol vi khuẩn A hydrophila chủng CAF133 29 Bảng 4.6: Đọc kết pha loãng ống MIC số độ pha loãng 105 vi khuẩn A hydrophila 30 Bảng 4.7: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) natsol vi khuẩn E ictaluri chủng vi khuẩn E.3B3 31 Bảng 4.8: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) natsol vi khuẩn E ictaluri chủng vi khuẩn E.223 31 Bảng 4.9: Đọc kết pha loãng ống MIC số độ pha loãng 104 vi khuẩn E ictaluri 32 Bảng 4.10: Kết MIC môi trường thạch vi khuẩn A hydrophila với đĩa môi trường 5, 6, ứng với nồng độ 1500; 750; 375ppm .32 Bảng 4.11: Kết MIC môi trường thạch vi khuẩn E ictaluri với đĩa môi trường 6, 7, ứng với nồng độ 750; 375; 187,5ppm 33 LỜI CẢM TẠ Tôi đặc biệt biết ơn cô Từ Thanh Dung Nguyễn Thị Như Ngọc ân cần hướng dẫn giúp đỡ tơi thực nghiên cứu hồn thành đề tài tốt đẹp Chân thành cảm ơn cô cố vấn học tập – cô Nguyễn Thị Thu Hằng nhiệt tình dạy dỗ dẫn dắt lớp tơi thời gian qua Tôi xin cảm ơn tất thầy cô Khoa thuỷ sản nói chung thầy Bộ mơn Sinh học bệnh thuỷ sản nói chung truyền dạy cho kiến thức quý giá suốt năm học vừa qua tạo điều kiện cho thực đề tài Cảm ơn bạn bè lớp bạn bè khác lớp tận tình trao đổi với tơi kiến thức khiếm khuyết giúp đỡ học tập q trình thực đề tài Tơi gởi lời cảm ơn đến gia đình, người thân ni dạy tạo điều kiện cho ăn học Tơi có thành ngày hơm kể hết công ơn trời biển cha mẹ dành cho Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu TĨM TẮT Thí nghiệm thăm dị nồng độ ức chế tối thiểu thuốc kháng sinh thực vật natsol lên vi khuẩn E ictaluri xác định khoảng nồng độ ức chế natsol lên vi khuẩn E ictaluri 50-100ppm Thực nghiên cứu xác định nồng độ ức chế tối thiểu thuốc kháng sinh thực vật natsol ba phương pháp:  Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) phương pháp lập kháng sinh đồ, qua thí nghiệm thuốc natsol khơng cho kết luận  Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) phương pháp pha loãng, xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) natsol lên vi khuẩn E ictaluri 93,75ppm lên vi khuẩn A hydrophila 375ppm  Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) phương pháp thạch, xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) natsol lên vi khuẩn E ictaluri 187,5ppm lên vi khuẩn A hydrophila 750ppm Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu CHƯƠNG GIỚI THIỆU Trung Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) loài cá da trơn nước nuôi phổ biến Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) Từ năm 1998-2000 thành công nghiên cứu “Quy trình kỹ thuật sinh sản nhân tạo ương nuôi cá tra thương phẩm” Khoa Thuỷ sản - Đại học Cần Thơ, đẩy mạnh phong trào nuôi cá tra thương phẩm phát triển vùng ĐBSCL, suất sản lượng nuôi không ngừng tăng Theo Dương Nhật Long (2006) sản lượng cá tra năm 1994 đạt 30.000 tấn, năm 2001 đạt 150.000 tấn, năm 2002 đạt 200.000 tấn, năm 2003 đạt 220.000 tấn, năm 2004 đạt 300.000 tấn, năm 2005 vượt qua 500.000 Song bên cạnh mặt thuận lợi tồn vấn đề khó khăn, tình hình bệnh cá tra nuôi Trong nhiều năm qua người nuôi cá tra bị thiệt hại lớn dịch bệnh xảy ra, bệnh đốm đỏ, trắng da, phù đầu phù mắt, bệnh ký sinh trùng ngoại ký sinh…(Ferguson & ctv, 2001) Theo Lương Trần Thục Đoan (2006) bệnh trắng gan (còn gọi bệnh mủ gan) vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (E ictaluri) gây bệnh phổ biến, xuất quanh năm cá tra, gây thiệt hại nghiêm trọng nuôi cá tra thâm canh ĐH Cần Thơ đỏ Tài liệu học tập nghiên tâm Học liệu Mặt khác, bệnh đốm@ (còn gọi bệnh xuất huyết) vi khuẩncứu Aeromonas hydrophila (A hydrophila) gây nhiều lồi cá nước có cá tra ni (Từ Thanh Dung, 2005) Từ Thanh Dung (1996) cho bệnh vi khuẩn vấn đề quan trọng nuôi trồng thuỷ sản, việc điều trị chủ yếu hoá chất sử dụng thuốc kháng sinh penicillin, streptomycin, chloramphenicol, oxytetracylin, tetracylin Tuy nhiên sử dụng hố chất phịng trị bệnh vi khuẩn thời gian dài, đặc biệt kháng sinh lại gặp nhiều khó khăn, giá thành loại thuốc kháng sinh cao, lại gây tượng kháng thuốc tác nhân gây bệnh, làm giảm hiệu phòng trị bệnh sau Thêm vào vấn đề nhiễm mơi trường nước, tích tụ dư lượng kháng sinh sản phẩm thuỷ sản… ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm xuất khẩu, không tốt cho sức khoẻ người tiêu dùng Theo Direkbusarakom (1995), giải pháp phòng trị khác sử dụng thảo dược điều trị bệnh vi khuẩn thuỷ sản, hiệu khơng nhanh chóng khắc phục khó khăn gặp sử dụng hóa chất thuốc kháng sinh Vì vậy, Thái Lan, Trung Quốc, Ấn Độ… kể Việt Nam, vài thảo dược có sẵn tự nhiên dùng làm dược phẩm cho người gia súc, thử nghiệm làm thuốc trị bệnh ngành thuỷ sản (Sivarajan, 1994) Chất chiết đậu (Clinacanthus nutans) ức chế bệnh Yellowhead Baculovirus tôm sú (Penaeus monodon) (Direkbusarakom & ctv, 1995) Theo Kamei (1988) cho chiết suất thảo dược từ ổi (Psidium guajava) phòng trị bệnh vi rút IHNV, IPNV, OMV cá Từ Thanh Dung (1996) nghiên cứu thành công ảnh hưởng thảo dược lên vi khuẩn A hydrophila gây bệnh xuất huyết cá trê lai (Clarias macrocephalus x C.gariepinus) Hiện chưa có nhiều tài liệu khoa học đề cập đến cách phòng trị bệnh cá tra thảo dược Vì vậy, để làm phong phú thêm cho phương pháp điều trị làm đa dạng danh mục thuốc phịng trị bệnh cho cá lý để đề tài “Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thuốc Natsol (kháng sinh thực vật) lên vi khuẩn E ictaluri A hydrophila” thực Mục tiêu nghiên cứu Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thuốc Natsol lên vi khuẩn A hydrophila E ictaluri Nội dung nghiên cứu Kiểm tra nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) phương pháp pha lỗng mơi trường thạch vi khuẩn A hydrophila E ictaluri Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Bảng 4.7: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Natsol vi khuẩn E ictaluri chủng vi khuẩn E.3B3 Nồng độ thật (ppm) 12000 6000 3000 1500 750 375 187,5 93,75 46,875 10 23,4375 11 11,71875 Ống đối chứng (-) Ống đối chứng (+) Ống MIC Thí nghiệm lặp lại + + ++ ++ + + Bảng 4.8: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Natsol vi khuẩn E ictaluri chủng vi khuẩn E.223 Nồng độ thật Thí nghiệm lặp lại Ống MIC Trung tâm Học liệu ĐH Cần(ppm) @ Tài liệu học tập nghiên cứu Thơ 2 10 11 12000 6000 3000 1500 750 375 187,5 93,75 46,875 23,4375 11,71875 Ống đối chứng (-) Ống đối chứng (+) -+ ++ + + ++ + 31 Bảng 4.9: Đọc kết pha loãng ống MIC số độ pha loãng 104 vi khuẩn E ictaluri Chủng vi khuẩn Số lần lặp lại Trung bình Mật độ vi khuẩn sống sót (cfu/ml) (%)vi khuẩn sống sót E.223 Ống MIC Ống MIC số số 70 63 73 68,67 E.3B3 Ống MIC Ống MIC số số 63 57 57 59 343,35x10 295x105 343,35 295 4.2.3 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thuốc Natsol lên vi khuẩn E ictaluri A hydrophila phương pháp thạch Trung Kết thí nghiệm bảng 4.9 bảng 4.10 xác định nồng độ MIC thuốc natsol lên vi khuẩn A hydrophila môi trường thạch 750ppm Ở nồng độ khơng có vi khuẩn phát triển mặt thạch (Hình 4.1B) Nồng độ MIC thuốc natsol lên vi khuẩn A hydrophila môi trường thạch cao giá trị MIC thuốc vi khuẩn môi trường lỏng (375ppm) tâm Học liệu375ppm, vi khuẩn phát triển rấthọc tập nghiên cứu Tại nồng độ ĐH Cần Thơ @ Tài liệu nhiều đĩa mơi trường thạch (Hình 4.1A) Giá trị MIC natsol vi khuẩn E ictaluri môi trường thạch (375ppm) cao môi trường lỏng (187,5ppm) Sự chênh lệch kết MIC thuốc loài vi khuẩn hai phương pháp phương pháp thạch không đủ dụng cụ để thực thí nghiệm Theo Lila & Eleonor (2004), xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thuốc kháng sinh cần sử dụng dụng cụ xác định MIC đa kênh (MIC multiple inoculating apparatus set) Bảng 4.10: Kết MIC môi trường thạch vi khuẩn A hydrophila với đĩa môi trường 5, 6, ứng với nồng độ 1.500; 750; 375ppm Chủng vi khuẩn A hydrophila CAF2 CAF133 Đĩa môi trường số Đĩa môi trường số Đĩa môi trường số Đĩa môi trường số Đĩa môi trường số Đĩa môi trường số Số lần lặp lại 56 175 104 215 48 154 97 102 75 189 71 133 Trung bình 59,67 172,67 90,67 150 32 Bảng 4.11: Kết MIC môi trường thạch vi khuẩn E ictaluri với đĩa môi trường 6, 7, ứng với nồng độ 750; 375; 187,5ppm Chủng vi khuẩn E ictaluri E.223 E.3B3 Đĩa môi trường số Đĩa môi trường số Đĩa môi trường số Đĩa môi trường số Đĩa môi trường số Đĩa mơi trường số Lặp lại Trung bình 76 155 51 210 58 149 47 132 105 178 41 153 79,67 160,67 46,33 165 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 33 A Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu B Hình 4.1: Kết MIC môi trường thạch vi khuẩn A hydrophila (Đĩa đối chứng (trái), đĩa môi trường chứa thuốc nồng độ 750ppm (phải)) 34 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Thí nghiệm đạt số kết sau:  Thí nghiệm thăm dò xác định khoảng nồng độ ức chế natsol lên vi khuẩn E ictaluri 50-100ppm  Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thuốc kháng sinh thực vật Natsol vi khuẩn E ictaluri 93,75ppm phương pháp pha loãng 187,5ppm phương pháp thạch  Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thuốc kháng sinh thực vật Natsol vi khuẩn A hydrophila 375ppm phương pháp pha loãng 750ppm phương pháp thạch  Phương pháp lập kháng sinh đồ thuốc kháng sinh natsol không hiệu vi khuẩn E ictaluri A hydrophila 5.2 Đề Trung tâm Họcxuất ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu liệu  Trang bị thêm dụng cụ, thiết bị hỗ trợ cho phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) môi trường thạch 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Baxa-Antonio D., Groff J M., Hedrick R P., 1992 Experimental horizontal transmission of Enterocytozoon salmonis to Chinook salmon Oncorhynchus tshawytscha J Protozool 39: 699-702 Bùi Thị Tho, 2003 Thuốc kháng sinh nguyên tắc sử dụng chăn nuôi NXB Hà Nội, 323 trang Bùi Quang Tề, 1997 Tình hình bệnh tơm cá thời gian qua biện pháp phịng trị bệnh Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y - Hội thú y Việt Nam, tập IV, số 2/1997 Bùi Quang Tề, 1998 Giáo trình bệnh động vật thuỷ sản NXB Nơng nhiệp., Hà Nội 192 trang Bùi Quang Tề 2003 Bệnh tơm ni biện pháp phịng trị NXB Nông nghiệp Hà Nội 110 trang Bùi Quang Tề 2006 Bệnh học thuỷ sản NXB Nông nghiệp., Hà Nội 219 trang Trung Direkbusarakom, S., Herunsalee, A., Yoshimizu, M., Ezura, Y., Tajima K., and Kimura T., 1995 Efficacy of liệu (Psidium nghiên tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ TàiGuava học tậpguajava) Extractcứu Against some Fish Shrimp Pathogenic Agents, p.109-110 In R.Leroy Cresswell (eds) Book of Abstracts World Aquaculture’96 Queen Sirikit National convention center Bangkok, Thailand Dixit S.P., & Achar M.P., 1979 Bhringaraj in the treatment of infective hepatitis Curr Med Pract 23(6): 237-242 Dương Nhật Long 2006 Giải pháp kỹ thuật góp phần nâng cao chất lượng khai thác bền vững sản phẩm cá tra nuôi xuất vùng ĐBSCL 10 Đỗ Tất Lợi, 1991 Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB KHKT Hà Nội 11 Eisenbrand, G., Tang, W., 1992 Chinese drugs of plant origine, p 891 12 Goujun Yin, Galina Jeney, Timea Racz, Pao Xu, Xie Jun, Zsigmond Jeney, 2005 Effect of two Chinese herbs (Astragalus radix and Scutellaria radix) on non-specific immune response of tilapia, Oreochromis niloticus CHN13/04, OMFB-00220/2005, 1-16 13 Hawke, J P., McWhorter, A C., Steigerwalt, A G., Brenner, D J., 1981 Edwardsiella ictaluri sp, the causative agent of enteric septicemia of catfish Int J System Bact, 31: 396-400 36 14 Hawke, J P., R M Durborow, R L Thune, and A C Camus, 1998 ESCEnteric Septicemia of catfish Southern Regional Aquaculture Center Special Publication No: 477 15 H W Ferguson, J F Turnbull, A Shinn, K Thompson, TTDung and M Crumlish (2001), Bacillary necrosis in farmed Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage) from the Mekong Delta, Vietnam Joural of fish diseases 2001 16 Kamei Y., Yoshimizu M., Ezura Y And Kimura T., 1988 Effect of environmetal waters on the infectivity of infectous hematopoietic necrosis virus (IHNV) and infectous pancreatic necrosis virus (IPNV) J Appl Ichthyology, 4, 37-47 17 Kiymet Guven, Sezgin Celik, Ismet Uysal, 2005 Antimicrobial activity of Centaurea Species Pharmaceatical Biology, pp.67-71 18 Kumar G.S., Jayaveera K.N., Ashok Kumar C.K., Umachigi P.S., Vrushabendra B.M., Kishore Kumar D.V., 2007 Antimicrobial effects of Indian medicinal plants against acne-inducing bacteria Tropical journal of Pharmaceutical Research, June 2007, 717-723 Trung 19 Lê Thị Kim Liên Nguyễn Quốc Thịnh 2006 Bài giảng thuốc hoá tâm Học liệu ĐH trồng thuỷ sản.@ trang liệu học tập nghiên cứu chất nuôi Cần Thơ 74 Tài 20 Lio-Po, G D., Albright, L J.,and Tendencia, A E V., 1992 Aeromonas hydrophila in Epizootic Ulcerative Syndrom (EUS) of Sneakhead, Ophicephalus striatus, and Catfish, Clarias batrachus: Quantitative Estimation in Natural Infection and Experimental Induction of dermomuscularnecrotic Lesion In: Diseases in Asian Aquaculture I Proceedings of the first symposium Diseases in Asian Aquaculture, Bli, 1990 (ed By M Shariff, R P Subasinghe and J R Artur), pp 461-474 Asian Fisheries Society, Manila 21 Lila Ruangpan & Eleonor A Tendencia, 2004 Laboratory manual of standardized methods for antimicrobial sensivity tests for bacteria isolated from aquatic animals and environment, pp 1-50 22 Lương Trần Thục Đoan 2006 Khảo sát xâm nhập vi khuẩn gây bệnh mủ gan (Edwardsiella ictaluri ) quan khác cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) LVTN Khoa Thuỷ sản, ĐHCT, 42 trang 37 23 Luis Scardapane, Oscar Giordano, Alicia Andersen, Blas Micalizzi, 2006 Antibacterial and antioxidant activity of extracts from aerial parts of Verbena seriphioides (Verbenaceae) Book: Cuyo biology society, 157 24 M Crumlish, TTDung, JFTurnbull, NTN.Ngoc, and HW Ferguson (2001), Short communication of Edwerdsiella ictaluri from diseases freshwater catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta, Vietnam Joural of fish diseases 2002, 25, 733-736 25 Mohan Thakare, Denbow D.M., McElrroy A.R., Novak C.L., Link L.R., 2004 thesis submitted to the faculty of the Virginia Polytechnic institute and State University in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master of Sciences in animal and poultry sciences Pharmacology.42p 26 Mullika traidej Chomnawang, Suvimol Surassmo, Veena S Nukoolkarn, Wandee Gritsanapan, 2005 Antimicrobial effects Thai medicinal plants against acne-inducing bacteria Journal of Ethnopharmocology 101 (2005) 330-333 27 Newman, S G., 1993 Bacterial vaccines for fish Annu rev fish Dis 3, 145185 Trung tâm Học liệu 2003 Cần Thơ @ Tài liệu disk suscesbilitynghiên cứu 28 NCCLS, ĐH Methods for antimicrobial học tập testing of bacteria isolated from aquatic animals: A report NCCLS document M42R(ISBN1-56238-501-1) NCCLS, 940 west valley road, suite 1400, Pennsylvania 19087-1898 USA, 7-8 29 Pai, R., Karunasagar, I., Shetty, H P C and Karunasagar, I., 1995 The Effect of some Stress Factors on Injection of Fish by Aeromonas hydrophila Journal Aquaculture Tropical 10-29-35 30 Pithai Kanbutra, Sompoth Weerakhun, Kingkan Sarachoo, Sarthorn Porntrakulpipat, 2005 Anti bacterial activity of Thai medicinal plant extracts on Aeromonas hydrophila and Streptococcus agalactiae isolated from diseased tilapia Joural of fish diseases p1-31 31 Rahman, M.H., S Suzuki K Kawai 2000 The effect of temperature on Aeromonas hydrophila infection in goldfish, Carassius auratus, Joural of fish diseases 2002 32 Rogers, J & Burke, L., 1981 Identification of pathogenic bacteria associated with the occurrence of “red spot” in sea mullet, Mugil cephalus, in south eastern Queensland J Fish Dis 4, 153-159 38 33 Sivarajan V V., and Palachandran, I., 1994 Ajavadic Drugs and their Plant sources Published by Mohan Primlani for Oxford and IBH Publishing Co: Pvt Ltd., 66 Janpath, New delhi 110 001 34 Shotts, E.B., J.L Gaines, L Martin, and A.K Prestwood 1972 Aeromonas induced deaths among fish and reptiles in an eutrophic inland lake 35 Shotts and Rimler, 1973 Medium for the Isolation of Aeromonas hydrophila College of Veterinary Medicine, University of Georgia, Athens, Georgia 30602, 550-553 36 Snieszko, S.F and Axelrod, H.R 1971 Septicemec diseases caused by motile Aeromonads and Pseudomonads Book 2A: Bacterial Diseases of fishes Bullock G L Conroy D A and Sneiszko S F Book 2B Bullock G L Identification of fish pathogenic bacteria T F H Publications Inc., 245 37 Subasingha, R., 1995 Diseases Control and Health Management in Aquaculture FAO Aquaculture Newsletter, FAN (8-11) Trung 38 Supayang Piyawan Voravuthikunchai, Treechada Sririrak, Surasak Limsuwan, Thanomjit Supawita, 2005 Inhibilitory Effects of Active Compounds from Punica granatum on Verocytotoxin production by tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @coli O157:H7 Journal ofvà nghiên cứu Enterohemorrhagic Escherichia Tài liệu học tập health science, 590-596 39 Tonguthai, K., Chinabut, S., Limsuwan, C., Somsiri, t., Chanakhan, P., macrae, I H., 1993 Handbook of Hybrid Catfish: Husbandry and Health Kasetsart University Campus Bangkok, Thailand 40 Tu Thanh Dung 1996 The effect of selected herb extracts on Aeromonas hydrophila isolated from hydrid catfish (Clarias macrocephalus x C.gariepenus) 41 Từ Thanh Dung, M Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh, Đặng Thuỵ Mai Thy 2004 Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm trắng gan cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Tạp chí Khoa học Đại Học Cần Thơ chuyên ngành Thuỷ sản 150-155 42 Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa 2005 Bài giảng Bệnh vi khuẩn động vật thuỷ sản, 124 trang 43 Từ Thanh Dung 2005 Bài giảng bệnh học thuỷ sản, 65 trang 44 Trease, G E., and Evans, W C., 1973 Tenth Editon Pharmacognosy 39 45 Trust, T J., and Sparrow, R A H., 1974 The Bacterial Flora in the Alimentary tract of freshwater Samonid Fish Journal Microbiology., 20: 1217-1228 46 Trương Quốc Phú 2004 Giáo trình Quản lý chất lượng nước, 216 trang Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 40 Phụ lục A: Pha dung dịch nhuộm gram vi khuẩn Dung dịch I (ammonium oxalate, crystal violet) Crystal violet (colour index No.42555) 2g Ethanol (95%) 20ml Ammonium oxalate 0,8g Nước cất 80ml - Hoà tan crystal violet vào ethanol - Hoà tan ammonium oxalate vào nước cất phần cặn Trộn hai dung dịch lại, sau 24 lọc qua giấy lọc loại bỏ Dung dịch II (iodine) Iodine 1g Potassium iodine 2g Nước cất 300ml Hoà tan potassium iodine Tài liệu học tập Trung tâm Học -liệu ĐH Cần Thơ @ 20ml nước cất nghiên cứu - Cho tiếp iodine vào, giữ qua đêm - Sau cho thêm phần nước lại vào dung dịch Dung dịch III (dung dịch rửa màu) Hỗn hợp ethanol/acetone theo tỷ lệ 95%:5% Dung dịch IV (Safranin) Safranin (colour index No.50240) 0,25g Ethanol (95%) 10ml Nước cất 90ml - Hoà tan safranin ethanol nước cất 41 Phụ lục B: Phương pháp nhuộm Gram vi khuẩn Nhỏ giọt nước cất lên lame, dùng que cấy nhặt vi khuẩn trãi lên giọt nước cất Để khô nhiệt độ phịng sau hơ lướt lame lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn lame Các bước nhuộm Gram:  Nhỏ dung dịch crystal violet (dung dịch I) lên lame Để phút  Rửa nước cất cho hết màu tím lame (khoảng giây)  Nhỏ dung dịch Iodine (dung dịch II) Để khoảng phút  Lật nghiêng lame cho hết dung dịch Iodine lame  Dung dịch cồn: aceton (dung dich III) để tẩy màu cách lật nghiêng lame nhỏ từ từ dung dịch III giọt nước cuối tren lame khơng cịn màu tím Rửa vảy cho nước  Nhỏ dung dịch safranin (dung dịch IV) lên lame Để khoảng phút Rửa vảy cho nước Để khô nhiệt độ phịng Quan sát vật kính 100X với dầu soi kính Đọc kết liệu Trung tâm Học quả: ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu  Vi khuẩn Gram âm (G-) có màu hồng đỏ  Vi khuẩn Gram dương (G+) có màu tím xanh 42 Phụ lục C: Pha môi trường NA (nutrient agar) Nước cất TSA (triptic soy agar) Nước cất MHA (muller hinton agar) Nước cất Trung 20g 1000ml 40g 1000ml 38g 1000ml Hồ tan mơi trường cần sử dụng vào 1000ml nước cất, sau tiệt trùng nhiệt độ 1210C 15 phút Để nhiệt độ hạ xuống khoảng 500C, tiến hành đỗ đĩa tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu petri với độ dày khoảng 4mm 43 Phụ lục D: Pha nước muối sinh lý pha môi trường NB Pha nước muối sinh lý (0.85% - NaCl) NaCl Nước cất 0.8g 100ml Hoà tan 0.8g NaCl vào 100ml nước cất Chuẩn bị môi trường NB lỏng NB Nước cất 8g 500ml Hoà tan NB nước cất, vặn chặt nắp, tiệt trùng 121 0C 15 phút Vặn kín nắp, Thơ @ Tài liệu Trung tâm Học -liệu ĐH Cầngiữ nhiệt độ phòng học tập nghiên cứu 44 Phụ lục E: Pha thuốc kháng sinh chloramphenicol natsol Cân 0.1024g thuốc kháng sinh (chloramphenicol) cho vào chai tiệt trùng, sau cho vào100ml dung dịch ethanol Lắc cho thuốc tan hoàn toàn, thuốc kháng sinh khơng tan cần sử dụng máy đánh sóng âm, nồng độ thuốc kháng sinh 1024ppm (nồng độ gốc) Đong 5ml thuốc kháng sinh natsol cho vào 100ml nước cất tiệt trùng, lắc cho thuốc tan hoàn toàn, lúc nồng độ thuốc kháng sinh 50000ppm theo hướng dẫn nhà sản xuất Trung Các nồng độ thuốc kháng sinh chloramphenicol natsol pha loãng áp dụng theo công thức C1V1 = C2V2 Chẳng hạn chuẩn bị 10ml dung dịch thuốc kháng sinh chloramphenicol có nồng độ 256ppm (dung dịch gốc thứ hai) từ nồng độ liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu tâm Học gốc 1024ppm Áp dụng công thức: C1V1 = C2V2 Vậy: V1 = C2V2/C1 = 256 x 10/1024 = 2,5ml thuốc kháng sinh gốc Do đó, để đạt 10ml thuốc kháng sinh nồng độ 256ppm cần 2,5ml thuốc kháng sinh (nồng độ gốc) 7,5ml nước muối sinh lý Các nồng độ khác áp dụng phương pháp pha loãng hai lần để nồng độ giảm phân nửa từ dung dịch gốc 45 ... nồng độ ức chế tối thiểu thuốc kháng sinh thực vật natsol lên vi khuẩn E ictaluri xác định khoảng nồng độ ức chế natsol lên vi khuẩn E ictaluri 50-100ppm Thực nghiên cứu xác định nồng độ ức chế. .. nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) phương pháp pha loãng, xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) natsol lên vi khuẩn E ictaluri 93,75ppm lên vi khuẩn A hydrophila 375ppm  Xác định nồng độ ức chế tối. .. loãng .28 4.3.1 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thuốc Natsol lên vi khuẩn A hydrophila 28 4.3.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thuốc Natsol lên vi khuẩn E ictaluri